利用纖維素內(nèi)切酶和β?葡糖苷酶構(gòu)建食品安全級載體及篩選培養(yǎng)基的制作方法

文檔序號：11936787閱讀：510來源：國知局

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及利用纖維素內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶構(gòu)建食品安全級載體及篩選培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

現(xiàn)在大多數(shù)的載體都是利用抗生素的抗性作為載體的篩選標記，抗生素對人類食品安全的危害是很多的，因此利用抗生素作為篩選標記的載體其應(yīng)用就有很多局限性。

作為篩選標記必須具有以下特點：能夠輕易區(qū)分轉(zhuǎn)化子和非轉(zhuǎn)化子；能夠讓目的基因片段或目的單元整合在基因組中，或穩(wěn)定在宿主菌中存在。在構(gòu)建基因工程菌中，對于整合型質(zhì)粒有更多的偏愛，整合型質(zhì)粒不會輕易環(huán)出，相對而言具有更好的穩(wěn)定性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于在于提供一種食品安全級載體及其構(gòu)建方法與篩選培養(yǎng)基。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種食品安全級載體，以纖維素內(nèi)切酶、β-葡糖苷酶為篩選標記，含有纖維素內(nèi)切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因，能表達纖維素內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶。優(yōu)選的，所述的纖維素內(nèi)切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因來源于黑曲霉。

所述的纖維素內(nèi)切酶編碼基因的序列優(yōu)選如SEQ ID NO.1所示。

所述的β-葡糖苷酶編碼基因的序列優(yōu)選如SEQ ID NO.2所示。

所述的食品安全級載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：將纖維素內(nèi)切酶編碼基因、β-葡糖苷酶編碼基因克隆到載體上，使載體能夠表達纖維素內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶。

優(yōu)選的，所述的食品安全級載體的構(gòu)建方法包括如下步驟：將SEQ ID NO.3所示序列、SEQ ID NO.4所示序列通過限制性內(nèi)切酶及DNA連接酶構(gòu)建到pPIC9K載體上；其中限制性內(nèi)切酶為SnaBI、EcoR I和AvrII、NotI，SnaBI、EcoR I對應(yīng)酶切SEQ ID NO.3所示序列，AvrII、NotI對應(yīng)酶切SEQ ID NO.4所示序列。

所述的食品安全級載體的篩選培養(yǎng)基，包含羥甲基纖維素鈉和梔子藍。該培養(yǎng)基沒有微生物可直接利用的碳源，只有載體上的纖維素內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶同時表達后，才能把羥甲基纖維素鈉轉(zhuǎn)化成葡萄糖，使微生物生長增值。同時β-葡糖苷酶把梔子藍轉(zhuǎn)化成梔子紅，從而使菌落周圍呈現(xiàn)淡淡紅色。基于此，纖維素內(nèi)切酶編碼基因和β-葡糖苷酶編碼基因組合可用于構(gòu)建食品安全級載體。

優(yōu)選的，所述的篩選培養(yǎng)基的配方為：羥甲基纖維素鈉10g/L，梔子藍1.5g/L，NH₄NO₃1.0g/L，NaCl 2g/L，YGM003A酵母細胞全合成培養(yǎng)基YGM003A-1 1.5g/L，瓊脂20g/L。

本發(fā)明利用纖維素內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶作為篩選標記酶，同時利用特殊設(shè)計的篩選培養(yǎng)基平板，能夠快速準確的篩選出轉(zhuǎn)化子。由于篩選標記不為抗生素，因而為食品安全級的載體。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

1、材料

限制性內(nèi)切酶購自Takara；質(zhì)粒提取試劑盒（B518188）、DNA連接酶、卡那霉素購自上海生物工程股份有限公司；含有質(zhì)粒pPIC9K的大腸桿菌DH5α保藏于實驗室。人工合成的分別如SEQ ID NO.3、4所示的合成序列1、合成序列2。

2、質(zhì)粒pPIC9K的提取

含有表達質(zhì)粒pPIC9K的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基中（添加10μg/mL卡那霉素）培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為30℃，用質(zhì)粒提取試劑盒（B518188）提取質(zhì)粒。提取步驟如下：

（1）取0.5mL菌液，10000rpm離心3min收集菌體，倒盡或吸干培養(yǎng)基。

（2）在菌體沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振蕩至徹底懸浮菌體，室溫放置3min。

（3）將裂解液全部小心移入吸附柱，室溫放置1min，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（6）重復(fù)向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（7）將吸附柱和收集管放入離心機，8000rpm離心2min。

（8）將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室溫靜置2min，8000 rpm離心2min。將所得到的質(zhì)粒DNA溶液置于-20℃保存。

3、質(zhì)粒pPIC9K和SEQ ID NO.3所示合成序列1的酶切

往25μL提取的質(zhì)粒pPIC9K中加入SnaBI和EcoR I酶各0.2μL，加入酶切緩沖液及雙蒸水24.6μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到質(zhì)粒pPIC9K酶切液。

合成序列1用雙蒸水稀釋10倍，取25μL，加入SnaBI和EcoR I酶各0.2μL，加入酶切緩沖液及雙蒸水24.6μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到序列1酶切液。

4、酶切液電泳

（1）電泳試劑配制

1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）緩沖液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20mL，將pH調(diào)到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用時稀釋5倍。

2）加樣緩沖液的配制：0.25%溴酚藍，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。

3）溴化乙錠的配制：稱取0.1g溴化乙錠，溶于10mL水，配成終濃度為10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色時，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其終濃度為0.5μg/mL，混合均勻。

4）100×TE緩沖液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。稱取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL雙蒸水，加熱攪拌溶解后，再用鹽酸調(diào)pH至8.0（大約加入鹽酸20mL），然后定容至1000mL。

5）100×電泳緩沖液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸鈉，200mmol/L EDTA。稱取Tris 242.2g，無水乙酸鈉82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL雙蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調(diào)pH至8.0（大約加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用時稀釋100倍。

（2）電泳方法

1）安裝電泳槽：將有機玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺上，插上樣品梳。

2）1%瓊脂糖凝膠的制備：稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化，取出搖勻。

3）灌膠：將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。

4）待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。

5）加樣：將DNA樣品與加樣緩沖液按體積比4:1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加20μL，記錄樣品的點樣次序和加樣量。

6）電泳：安裝好電極導線，點樣孔一端接負極，另一端接正極，打開電源，調(diào)電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當溴酚藍移到距凝膠前沿1-2cm時，停止電泳。

7）染色和觀察：取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶。

5、酶切片段的回收和純化

使用Takara的膠回收試劑盒回收純化酶切的DNA片段。在紫外燈下切出含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。

稱量膠塊重量，計算膠塊體積。向膠塊中加入膠塊溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量3凝膠體積。均勻混合后室溫25℃溶解膠塊10min。當凝膠完全溶解后，加入3M醋酸鈉溶液（pH5.2）10μL，均勻混合至溶液恢復(fù)黃色。將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。0.2mL膠溶解液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。將700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。再次將700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。將Spin Column安置于Collection Tube上，室溫12000rpm離心1min。將Spin Column安置于新的1.5mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入30μL滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。室溫12000rpm離心1min洗脫DNA。

6、酶切的pPIC9K質(zhì)粒與合成序列1的連接與轉(zhuǎn)化

連接體系為：酶切回收的合成序列1 7μL，酶切回收的pPIC9K質(zhì)粒1μL，T4 DNA ligase 1μL，Buffer 1μL。4℃連接24小時。

取一管-80℃保存的大腸桿菌DH5α（不含質(zhì)粒）感受態(tài)細胞50μL，置冰上融化，加入5μL上述連接產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min；將離心管置于42℃熱擊60-90秒，然后迅速置冰浴3分鐘。向離心管中加入500μL液體LB培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘（150轉(zhuǎn)/分鐘）；目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標記基因表達，使菌體復(fù)蘇。吸取100μL培養(yǎng)液加到含卡那霉素5mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。挑選單菌落，保藏得到轉(zhuǎn)化子，得到含pPIC9K-1載體的大腸桿菌DH5α。

7、質(zhì)粒提取和酶切

按照上述步驟將重組質(zhì)粒pPIC9K-1、合成序列2進行酶切、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定，其中重組質(zhì)粒pPIC9K-1、合成序列2的酶切所用內(nèi)切酶為AvrII和NotI，最后得到重組質(zhì)粒pPIC9K-1-2。

8、質(zhì)粒pPIC9K-1-2轉(zhuǎn)化酵母菌

（1）酵母菌感受態(tài)制備

1）從平板上或保種管中，挑少許酵母SMD1168，在YPDA平板（YPDA培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏10g/L，瓊脂20g/L（固體），腺嘌呤15mL/L 0.2%腺嘌呤，調(diào)節(jié)pH=7.5，121℃滅菌15min）上劃單克隆，30℃培養(yǎng)3天左右。

2）從平板上分別挑取單克?。ㄖ睆?-3mm）到含有3mL YPDA的玻璃試管中（平行做3管）。

3）30℃、50rpm培養(yǎng)8-12h。取200μL菌液，測OD₆₀₀。選取OD₆₀₀值最大的一個試管（即活力最高的一個），吸取5μL轉(zhuǎn)移至50mL新鮮的YPDA培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基裝在250mL三角瓶中）。

4）30℃、230rpm培養(yǎng)16-20h，直至OD₆₀₀=0.15-0.3。

5）將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)入2個50mL離心管，室溫3000g離心3min，棄上清，用100mL新鮮的YPDA懸起管底的菌體，并倒入干凈的三角瓶中。30℃、230rpm培養(yǎng)直到OD₆₀₀=0.4-0.5（3-5小時）。

6）將菌液倒入2個50mL離心管，室溫3000g離心3min，棄上清，每個離心管用30mL milipore水重懸。

7）再次3000g離心3min，棄上清，每管用1.4mL 1.1×TE/LiAc重懸。

8）將重懸的菌液轉(zhuǎn)移到2個EP管中，12000rpm離心15s。

9）棄上清，每管用600μL 1.1×TE/LiAc重懸，將兩管重懸菌液并入一管，得到酵母感受態(tài)細胞。

（2）轉(zhuǎn)化

質(zhì)粒用SacI線性化，往25μL pPIC9K-1-2中加入限制性內(nèi)切酶SacI酶0.2μL，加入酶切緩沖液及雙蒸水24.8μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到酶切液。pPIC9K-1-2酶切液通過電泳回收純化得到線性化的pPIC9K-1-2質(zhì)粒。

往離心管中加入線性化的pPIC9K-1-2質(zhì)粒10μL，鮭魚精DNA（變性的，10mg/mL）5μL，加入酵母感受態(tài)細胞50μL，輕彈混勻；加入500μL PEG/LiAc輕彈混勻。30℃水浴30min，每10-15min輕彈混勻；加入20μL DMSO，輕彈混勻；42℃水浴15min，每5-10min輕彈混勻；12000rpm離心0.5min，棄上清；用1mL液體PDA培養(yǎng)基重懸；30℃、200rpm培養(yǎng)90min；12000r/m離心0.5min，棄上清；加入雙蒸水1mL，重懸后12000r/m離心10min，棄上清，加入雙蒸水1mL，得到最終重懸液。

9、篩選培養(yǎng)基設(shè)計和篩選

篩選培養(yǎng)基：羥甲基纖維素鈉10g/L，梔子藍1.5g/L，NH₄NO₃1.0g/L，NaCl 2g/L，YGM003A 酵母細胞全合成培養(yǎng)基YGM003A-1（北京泛基諾科技有限公司）1.5g/L，瓊脂20g/L，115℃滅菌20 min，倒平板。最終重懸液涂布于篩選平板，28℃培養(yǎng)48h，菌落周圍有淡淡紅色的為轉(zhuǎn)化子。

因為在篩選培養(yǎng)基中，沒有酵母菌可直接利用的碳源，只有質(zhì)粒上的纖維素內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶同時表達后，才能把羥甲基纖維素鈉轉(zhuǎn)化成葡萄糖，使酵母菌生長增值。同時β-葡糖苷酶把梔子藍轉(zhuǎn)化成梔子紅，從而使菌落周圍呈現(xiàn)淡淡紅色。

對照實驗：將含有質(zhì)粒pPIC9K或不含質(zhì)粒的酵母菌稀釋涂布篩選培養(yǎng)基平板進行培養(yǎng)，沒有菌落生長。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業(yè)大學

<120> 利用纖維素內(nèi)切酶和β-葡糖苷酶構(gòu)建食品安全級載體及篩選培養(yǎng)基

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 1

atgaagttgc cagtttcttt ggctatgttg gctgctaccg ctatgggtca aaccatgtgt 60

tctcaatacg actctgcttc ttctccacca tactctgtta accaaaactt gtggggtgaa 120

taccaaggta ccggttctca atgtgtttac gttgacaagt tgtcttcttc tggtgcttct 180

tggcacaccg aatggacctg gtctggtggt gaaggtaccg ttaagtctta ctctaactct 240

ggtgttacct tcaacaagaa gttggtttct gacgtttctt ctatcccaac ctctgttgaa 300

tggaagcaag acaacaccaa cgttaacgct gacgttgctt acgacttgtt caccgctgct 360

aacgttgacc acgctacctc ttctggtgac tacgaattga tgatctggtt ggctagatac 420

ggtaacatcc aaccaatcgg taagcaaatc gctaccgcta ccgttggtgg taagtcttgg 480

gaagtttggt acggttctac cacccaagct ggtgctgaac aaagaaccta ctctttcgtt 540

tctgaatctc caatcaactc ttactctggt gacatcaacg ctttcttctc ttacttgacc 600

caaaaccaag gtttcccagc ttcttctcaa tacttgatca acttgcaatt cggtaccgaa 660

gctttcaccg gtggtccagc taccttcacc gttgacaact ggaccgcttc tgttaactag 720

<210> 2

<211> 2583

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 2

atgagattca ccttgatcga agctgttgct ttgaccgctg tttctttggc ttctgctgac 60

gaattggctt actctccacc atactaccca tctccatggg ctaacggtca aggtgactgg 120

gctgaagctt accaaagagc tgttgacatc gtttctcaaa tgaccttggc tgaaaaggtt 180

aacttgacca ccggtaccgg ttgggaattg gaattgtgtg ttggtcaaac cggtggtgtt 240

ccaagattgg gtgttccagg tatgtgtgct caagactctc cattgggtgt tagagactct 300

gactacaact ctgctttccc agctggtgtt aacgttgctg ctacctggga caagaacttg 360

gcttacttga gaggtcaagc tatgggtcaa gacttctctg acaagggtgc tgacatccaa 420

ttgggtccag ctgctggtcc attgggtaga tctccagacg gtggtagaaa ctgggaaggt 480

ttctctccag acccagcttt gtctggtgtt ttgttcgctg aaaccatcaa gggtatccaa 540

gacgctggtg ttgttgctac cgctaagcac tacatcgctt acgaacaaga acacttcaga 600

caagctccag aagctcaagg ttacggtttc aacatcaccg aatctggttc tgctaacttg 660

gacgacaaga ccatgcacga attgtacttg tggccattcg ctgacgctat cagagctggt 720

gctggtgctg ttatgtgttc ttacaaccaa atcaacaact cttacggttg tcaaaactct 780

tacaccttga acaagttgtt gaaggctgaa ttgggtttcc aaggtttcgt tatgtctgac 840

tgggctgctc accacgctgg tgtttctggt gctttggctg gtttggacat gtctatgcca 900

ggtgacgttg actacgactc tggtacctct tactggggta ccaacttgac catctctgtt 960

ttgaacggta ccgttccaca atggagagtt gacgacatgg ctgttagaat catggctgct 1020

tactacaagg ttggtagaga cagattgtgg accccaccaa acttctcttc ttggaccaga 1080

gacgaatacg gtttcaagta ctactacgtt tctggtggtc catacgaaaa ggttaaccaa 1140

ttcgttaacg ttcaaagaaa ccactctgaa ttgatcagaa gaatcggtgc tgactctacc 1200

gttttgttga agaacgacgg tgctttgcca ttgaccggta aggaaagatt ggttgctttg 1260

atcggtgaag acgctggttc taacccatac ggtgctaacg gttgttctga cagaggttgt 1320

gacaacggta ccttggctat gggttggggt tctggtaccg ctaacttccc atacttggtt 1380

accccagaac aagctatctc taacgaagtt ttgaagaaca agaacggtgt tttcaccgct 1440

accgacaact gggctatcga ccaaatcgaa gctttggcta agaccgcttc tgtttctttg 1500

gttttcgtta acgctgactc tggtgaaggt tacatcaacg ttgacggtaa cttgggtgac 1560

agaagaaact tgaccttgtg gagaaacggt gacaacgtta tcaaggctgc tgcttctaac 1620

tgtaacaaca ccatcgttat catccactct gttggtccag ttttggttaa cgaatggtac 1680

gacaacccaa acgttaccgc tatcttgtgg ggtggtttgc caggtcaaga atctggtaac 1740

tctttggctg acgttttgta cggtagagtt aacccaggtg ctaagtctcc attcacctgg 1800

ggtaagacca gagaagctta ccaagactac ttgtacaccg aaccaaacaa cggtaacggt 1860

gctccacaag aagacttcgt tgaaggtgtt ttcatcgact acagaggttt cgacaagaga 1920

aacgaaaccc caatctacga cttcggttac ggtttgtctt acaccacctt caactactct 1980

aacttgcaag ttgaagtttt gtctgctcca gcttacgaac cagcttctgg tgaaaccgaa 2040

gctgctccaa ccttcggtga agttggtaac gcttctgact acttgtaccc agacggtttg 2100

caaagaatca ccaagttcat ctacccatgg ttgaactcta ccgacttgga agcttcttct 2160

ggtgacgctt cttacggtca agacgcttct gactacttgc cagaaggtgc taccgacggt 2220

tctgctcaac caatcttgcc agctggtggt ggtgctggtg gtaacccaag attgtacgac 2280

gaattgatca gagttaccgt taccatcaag aacaccggta aggttgctgg tgacaaggtt 2340

ccacaattgt acgtttcttt gggtggtcca aacgaaccaa agatcgtttt gagacaattc 2400

gaaagaatca ccttgcaacc atctgaagaa acccaatggt ctaccacctt gaccagaaga 2460

gacttggcta actggaacgt tgaaacccaa gactgggaaa tcacctctta cccaaagatg 2520

gttttcgttg gttcttcttc tagaaagttg ccattgagag cttctttgcc aaccgttcac 2580

taa 2583

<210> 3

<211> 1292

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成序列1

<400> 3

cctacgtagt tcgatcaaca acccgaatcc tatcgtaatg atgttttgcc cgatcagcct 60

caatcgacaa ttttacgcgt ttcgatcgaa gcagggatga caattggctg ggaacggtat 120

actggaataa atggtcttcg ttatggtatt gatgtttttg gtgcatcggc cccggcgaat 180

gatctatatg ctcatttcgg cttgaccgca gtcggcatca cgaacaaggt gttggccgcg 240

atcgccggta agtcggcacg ttaaaaaata gctatggaat atagtagcta ctaataagtt 300

aggagaataa actggatcca aacgatgaga tttccttcaa tttttactgc agttttattc 360

gcagcatcct ccgcattagc tgctccagtc aacactacaa cagaagatga aacggcacaa 420

attccggctg aagctgtcat cggttactca gatttagaag gggatttcga tgttgctgtt 480

ttgccatttt ccaacagcac aaataacggg ttattgttta taaatactac tattgccagc 540

attgctgcta aagaagaagg ggtaatgaag ttgccagttt ctttggctat gttggctgct 600

accgctatgg gtcaaaccat gtgttctcaa tacgactctg cttcttctcc accatactct 660

gttaaccaaa acttgtgggg tgaataccaa ggtaccggtt ctcaatgtgt ttacgttgac 720

aagttgtctt cttctggtgc ttcttggcac accgaatgga cctggtctgg tggtgaaggt 780

accgttaagt cttactctaa ctctggtgtt accttcaaca agaagttggt ttctgacgtt 840

tcttctatcc caacctctgt tgaatggaag caagacaaca ccaacgttaa cgctgacgtt 900

gcttacgact tgttcaccgc tgctaacgtt gaccacgcta cctcttctgg tgactacgaa 960

ttgatgatct ggttggctag atacggtaac atccaaccaa tcggtaagca aatcgctacc 1020

gctaccgttg gtggtaagtc ttgggaagtt tggtacggtt ctaccaccca agctggtgct 1080

gaacaaagaa cctactcttt cgtttctgaa tctccaatca actcttactc tggtgacatc 1140

aacgctttct tctcttactt gacccaaaac caaggtttcc cagcttcttc tcaatacttg 1200

atcaacttgc aattcggtac cgaagctttc accggtggtc cagctacctt caccgttgac 1260

aactggaccg cttctgttaa ctaggaattc gg 1292

<210> 4

<211> 3624

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 合成序列2

<400> 4

ggcctagggt tcgatcaaca acccgaatcc tatcgtaatg atgttttgcc cgatcagcct 60