本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種楝苦素類四降三萜化合物和該化合物的提取分離方法以及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

苦楝(Melia azedarach L.)為楝科(Meliaceae)楝屬(Melia)植物，較常見，生于低海拔曠野、路旁或疏林中，廣泛分布于東半球的熱帶和亞熱帶地區(qū)?？嚅暧卸?，果實(shí)毒性最大，苦楝子味苦，性寒，具有殺蟲治癬、理氣止痛的效能；亦可做殺蛔蟲藥，民間也用作土農(nóng)藥，在中華藥典中已有收載。苦楝的化學(xué)成分種類豐富，目前，國內(nèi)外研究者所報(bào)道的化合物共有十幾種，主要成分有三萜類、甾體類、黃酮類、酚酸類、糖苷類等。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，楝苦素類化合物具有抗癌、抗菌、抗瘧、抗病毒、殺蟲和一些其他對人體的藥理作用。近年來，我國學(xué)者對川楝素的抗腫瘤作用進(jìn)行了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)川楝素具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化抑制多種腫瘤細(xì)胞增生和凋亡作用，具有廣譜抗腫瘤效果，是一個(gè)有希望的抗癌候選藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種楝苦素類四降三萜化合物和該化合物的提取分離方法以及應(yīng)用，所述的楝苦素類四降三萜化合物具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒活性，該化合物的提取分離方法簡單、易操作且提取分離效果好。

發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種楝苦素類四降三萜化合物，其它的分子式為C₃₅H₄₂O₈，其結(jié)構(gòu)式為：

所述的楝苦素類四降三萜化合物的提取分離方法，它包括以下步驟：

1)提?。嚎嚅麑?shí)經(jīng)干燥、粉碎后，用甲醇提取，所得提取液濃縮后得粗浸膏；將該粗浸膏溶于水，混合均勻后用乙酸乙酯萃取，所得萃取液濃縮后得到乙酸乙酯浸膏；

2)分離：將步驟1)所得的乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫；其中，石油醚與乙酸乙酯體積比為60:40的洗脫液濃縮后進(jìn)一步經(jīng)MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫；其中，甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以氯仿與甲醇的混合溶劑進(jìn)行洗脫，其中，氯仿與甲醇的體積比為2:1-1:1，收集洗脫液并將洗脫液濃縮后再經(jīng)反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，其中甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)氯仿重結(jié)晶得到所述的楝苦素類四降三萜化合物。

在進(jìn)行步驟2)中的Sephadex LH-20凝膠柱層析時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)以氯仿與甲醇體積比1:1洗脫時(shí)的分離效果最佳；另外，對于步驟2)的分離過程，當(dāng)在進(jìn)行硅膠柱層析、MCI柱層析、Sephadex LH-20凝膠柱層析以及反相色譜柱層析時(shí)，發(fā)明人對每一次柱層析均嘗試了多種洗脫劑，結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)采取本發(fā)明相應(yīng)的洗脫劑能夠達(dá)到很好的分離效果。

本發(fā)明步驟1)中提取的具體方法為：將苦楝果實(shí)經(jīng)干燥、粉碎后，用1.5-2.5L甲醇于室溫下反復(fù)滲漉提取2-4次，合并提取液，所得的提取液濃縮后得粗浸膏；將粗浸膏溶于水，混合均勻后用乙酸乙酯萃取2-4次，所得萃取液于50℃-70℃條件下減壓濃縮成乙酸乙酯浸膏。

步驟2)中，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫時(shí)，石油醚與乙酸乙酯體積比依次為：80:20、60:40、50:50、30:70、0:100。

步驟2)中，MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：50:50、70:30、80:20、100:0。

步驟2)中，反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：30:70、50:50、80:20、100:0。

步驟2)中，反相色譜柱層析，所使用的反相色譜柱的填料為反相十八烷基鍵合硅膠。

在進(jìn)行反相色譜柱層析時(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人還嘗試了其他一些填料，如辛烷基硅烷鍵合硅膠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用辛烷基硅烷鍵合硅膠進(jìn)行分離時(shí)的分離效果不及反相十八烷基鍵合硅膠。

所述的楝苦素類四降三萜化合物的應(yīng)用，在制備治療乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和肝癌藥物中的應(yīng)用。

較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明的楝苦素類四降三萜化合物是從植物中分離純化得到的，具有原料來源廣泛的優(yōu)點(diǎn)，通過本發(fā)明的提取分離方法拓寬了該楝苦素類四降三萜化合物作為藥用活性成分的來源，也有助于揭示藥用植物的作用機(jī)制，本發(fā)明還通過實(shí)驗(yàn)證明了該楝苦素類四降三萜化合物具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒活性，可應(yīng)用于制備治療乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和肝癌藥物中。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的楝苦素類四降三萜化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說明書附圖和實(shí)施例對本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明：

在以下實(shí)施例中，所述的楝苦素類四降三萜化合物的結(jié)構(gòu)式(結(jié)構(gòu)式中的阿拉伯?dāng)?shù)字是化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位)如下：

所用試劑均為分析純，其中甲醇為色譜純。薄層層析所用硅膠板為預(yù)制硅膠HSGF254(煙臺(tái)江支硅膠開發(fā)有限公司)，硅膠200-300目(青島海洋化工有限公司)，MCI為CHP-20P(75-150μm)(日本三菱化學(xué)公司)，凝膠為Sephadex LH-20(Amersham Biosciences),液相為島津LC-20A，紫外檢測器為SPD-M20A，檢測波長為210nm，色譜柱為沃特世半制備柱XBridge@prep C18柱(205mm×9.4mm，微粒大小5μm)。NMR由Bruker DRX600測定得到。EI-MS由HP-5988質(zhì)譜儀測得，IR由Nicolet170SX FT-IR紅外儀測得。

實(shí)施例一：楝苦素類四降三萜化合物的提取分離——a

1)提?。簩⒖嚅麑?shí)(采自福建省)10kg經(jīng)干燥、粉碎后，用1.5L甲醇于室溫下反復(fù)滲漉提取3次，合并提取液，將所得的提取液濃縮后得粗浸膏；將粗浸膏溶于水，混合均勻后用乙酸乙酯萃取3次，所得萃取液于60℃條件下減壓濃縮成乙酸乙酯浸膏。

2)分離：將步驟1)所得的乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫；其中，石油醚與乙酸乙酯體積比為60:40的洗脫液濃縮后進(jìn)一步經(jīng)MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫；其中，甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以氯仿與甲醇體積比1:1洗脫，收集洗脫液并將洗脫液濃縮后再經(jīng)反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，其中甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)氯仿重結(jié)晶得到所述的楝苦素類四降三萜化合物15.56mg。

其中，步驟2)中，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫時(shí)，石油醚與乙酸乙酯體積比依次為：80:20、60:40、50:50、30:70、0:100；MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：50:50、70:30、80:20、100:0；反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：30:70、50:50、80:20、100:0；反相色譜柱層析，所使用的反相色譜柱的填料為反相十八烷基鍵合硅膠。

分離純化得到的本發(fā)明的楝苦素類四降三萜化合物為白色粉末，¹H及¹³C數(shù)據(jù)如下表1所示：

表1楝苦素類四降三萜化合物的¹H及¹³C NMR(ppm,CDCl₃)

楝苦素類四降三萜化合物：C₃₅H₄₂O₉；UVλ_max nm:225和207；IR(KBr)ν_max cm^-1:3500-3250,1735,1710,1600和1580。ESI-MS m/z 591.3395[M+H]⁺。

實(shí)施例二：楝苦素類四降三萜化合物的提取分離——b

1)提?。簩⒖嚅麑?shí)(采自福建省)10kg經(jīng)干燥、粉碎后，用2L甲醇于室溫下反復(fù)滲漉提取2次，合并提取液，將所得的提取液濃縮后得粗浸膏；將粗浸膏溶于水，混合均勻后用乙酸乙酯萃取2次，所得萃取液于50℃條件下減壓濃縮成乙酸乙酯浸膏。

2)分離：將步驟1)所得的乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫；其中，石油醚與乙酸乙酯體積比為60:40的洗脫液濃縮后進(jìn)一步經(jīng)MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫；其中，甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以氯仿與甲醇體積比1.5:1洗脫，收集洗脫液并將洗脫液濃縮后再經(jīng)反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，其中甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)氯仿重結(jié)晶得到所述的楝苦素類四降三萜化合物14.39mg。

其中，步驟2)中，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫時(shí)，石油醚與乙酸乙酯體積比依次為：80:20、60:40、50:50、30:70、0:100；MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：50:50、70:30、80:20、100:0；反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：30:70、50:50、80:20、100:0；反相色譜柱層析，所使用的反相色譜柱的填料為反相十八烷基鍵合硅膠。

實(shí)施例三：楝苦素類四降三萜化合物的提取分離——c

1)提?。簩⒖嚅麑?shí)(采自福建省)10kg經(jīng)干燥、粉碎后，用2.5L甲醇于室溫下反復(fù)滲漉提取4次，合并提取液，將所得的提取液濃縮后得粗浸膏；將粗浸膏溶于水，混合均勻后用乙酸乙酯萃取4次，所得萃取液于70℃條件下減壓濃縮成乙酸乙酯浸膏。

2)分離：將步驟1)所得的乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫；其中，石油醚與乙酸乙酯體積比為60:40的洗脫液濃縮后進(jìn)一步經(jīng)MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫；其中，甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以氯仿與甲醇體積比2:1洗脫，收集洗脫液并將洗脫液濃縮后再經(jīng)反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫，其中甲醇與水體積比為80:20的洗脫液濃縮后經(jīng)氯仿重結(jié)晶得到所述的楝苦素類四降三萜化合物15.43mg。

其中，步驟2)中，硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫時(shí)，石油醚與乙酸乙酯體積比依次為：80:20、60:40、50:50、30:70、0:100；MCI柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：50:50、70:30、80:20、100:0；反相色譜柱層析，以甲醇-水梯度洗脫時(shí)，甲醇與水體積比依次為：30:70、50:50、80:20、100:0；反相色譜柱層析，所使用的反相色譜柱的填料為反相十八烷基鍵合硅膠。

本發(fā)明實(shí)施例二和實(shí)施例三分離所得的楝苦素類四降三萜化合物液為白色粉末，且¹H及¹³C數(shù)據(jù)與實(shí)施例一的一致。

實(shí)施例四：本發(fā)明所述的楝苦素類四降三萜化合物的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)：

一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞系SGC7901、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人皮膚癌細(xì)胞系A(chǔ)431、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116、人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系MOLT4、人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60、人慢髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562。

二、實(shí)驗(yàn)藥物

本發(fā)明所述的楝苦素類四降三萜化合物。以培養(yǎng)基配制濃度為20mg/mL,再倍比稀釋設(shè)置6個(gè)藥物濃度。

抗癌細(xì)胞活性測定：

1、楝苦素類四降三萜化合物對人實(shí)體腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用：

方法1：采用SRB法。分別取對數(shù)生長期的人實(shí)體腫瘤細(xì)胞系(人胃癌細(xì)胞系SGC7901、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人皮膚癌細(xì)胞系A(chǔ)431、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種量分別為5000/150μL、3000/150μL、3500/150μL和6000/150μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白對照孔。藥物實(shí)驗(yàn)組每孔加不同濃度的本發(fā)明所述的楝苦素類四降三萜化合物溶液100μL(化合物母液用營養(yǎng)液稀釋)，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔；陰性對照組每孔加營養(yǎng)液100μL，共設(shè)6個(gè)復(fù)孔；空白對照孔只加營養(yǎng)液200μL，用于儀器調(diào)零。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，作用72h后取出，棄上清液控干水分，每孔加100μl 4℃預(yù)冷的10％三氯醋酸溶液，靜置5min后于4℃處避光保存1h以上；取出培養(yǎng)板用雙蒸水洗滌5遍，控干水分；每孔加入0.4％的SRB溶液100μl，靜置染色15min；用1％醋酸溶液洗滌5遍，控干水分；每孔加入100μl 10mmol﹒L^-1Tris溶液，于振蕩器上振蕩5min使之完全溶解。用酶標(biāo)儀在492nm波長處測定吸光度值(A)。按以下公式測得存在不同藥物濃度時(shí)細(xì)胞的增殖抑制率：抑制率(％)＝(1-藥物干預(yù)組A492/空白對照組A492)×100％，取各復(fù)孔平均值，計(jì)算各組的增殖抑制率。用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算IC₅₀。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。結(jié)果見表2和表3。

表2楝苦素類四降三萜化合物對腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用(x±SD,n＝3)

表3楝苦素類四降三萜化合物對腫瘤細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度

方法2：采用MTT法。分別取對數(shù)生長期的人白血病細(xì)胞系(急性髓系白血病細(xì)胞系HL-60、慢性髓系白血病細(xì)胞系K562和淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系MOLT-4)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔接種量分別為6000/150μL、7000/150μL和13000/150μL。實(shí)驗(yàn)設(shè)藥物實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組和空白對照孔。藥物實(shí)驗(yàn)組每孔加不同濃度的本發(fā)明所述的楝苦素類四降三萜化合物溶液100μL(化合物母液用營養(yǎng)液稀釋)，每個(gè)濃度做3個(gè)復(fù)孔；陰性對照組每孔加營養(yǎng)液100μL，共設(shè)6個(gè)復(fù)孔；空白對照孔只加營養(yǎng)液200μL，用于儀器調(diào)零。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，作用72h后，每孔加入20μL MTT溶液(濃度為5mg/mL，用PBS配制，pH＝7.4)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，離心棄上清，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150μL，震蕩5min，待結(jié)晶完全溶解后，用酶標(biāo)儀(BIO-RAD產(chǎn)品)在570nm波長處測定每個(gè)小孔的吸光度值(A₅₇₀)，各組取平均值，計(jì)算抑制率：IR＝(1－實(shí)驗(yàn)組A₅₇₀/對照組A₅₇₀)×100％。用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算IC₅₀。實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次。

結(jié)果見表4和表5。

表4楝苦素類四降三萜化合物對腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制作用(x±SD,n＝3)

表5楝苦素類四降三萜化合物對腫瘤細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楝苦素類四降三萜化合物對多種人實(shí)體腫瘤(人胃癌細(xì)胞系SGC7901、人肝癌細(xì)胞系HepG2、人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、人皮膚癌細(xì)胞系A(chǔ)431、人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116)和白血病細(xì)胞系(人急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系MOLT4、人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系HL60和人慢髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562)均具有顯著的增殖抑制作用，并呈劑量依賴性，作用72h的IC₅₀分別為4.10、4.10、8.00、8.00、2.41、2.49、11.68、14.00和9.74mg/L，說明本發(fā)明的楝苦素類四降三萜化合物具有抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明所述的楝苦素類四降三萜化合物可用于制備抗腫瘤藥物。