發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及具有能夠結(jié)合并激活角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)受體和玻連蛋白(VN)的整聯(lián)蛋白受體的不同結(jié)構(gòu)域的蛋白復(fù)合體。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和玻連蛋白的整聯(lián)蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合蛋白。更具體地，本發(fā)明涉及刺激細(xì)胞遷移的蛋白復(fù)合物和嵌合蛋白以及促進(jìn)或誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和/或增殖的組合物和方法。這些組合物和方法具有在傷口愈合、組織工程、美容和治療處理例如皮膚置換以及需要上皮細(xì)胞遷移和/或增殖時(shí)燒傷的皮膚補(bǔ)充和治療中的用途。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供由本發(fā)明提供的涉及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移(尤其是與乳腺癌有關(guān)的)的防止或抑制的治療。

發(fā)明背景

角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子是參與廣泛細(xì)胞過程包括增生、DNA合成、分化、細(xì)胞周期進(jìn)行和凋亡抑制的促有絲分裂生長(zhǎng)因子(Marchese等人,1990,J.Cell Physiol.144:326-32)。這些作用是通過與其酪氨酸激酶連接的細(xì)胞表面受體，KFG受體，結(jié)合來介導(dǎo)的。

玻連蛋白是血液和外細(xì)胞基質(zhì)(ECM)中高豐度的糖蛋白。主要在肝臟中合成但由許多其他細(xì)胞類型表達(dá)。VN在血液中以閉合構(gòu)象循環(huán)而以打開的或者延伸的構(gòu)象在ECM中沉積(Schvartz等人,1999,Int.J.Biochem.Cell Biol.31:531-44)。兩種構(gòu)象據(jù)信結(jié)合IGF-II(Upton等人,1999,Endocrinology 140:2928-31；International Publication WO 02/24219；McMurty等人,1996,Endocrinology 150:149-60)并且同樣結(jié)合多種其他配體，包括膠原蛋白(Morris等人,1994,J.Bio.Chem.269:23845-52)、糖胺聚糖(Francois等人,1999,J.Bio.Chem.274:37611-19)、多種其他ECM蛋白以及各種整聯(lián)蛋白尤其是α_v整聯(lián)蛋白的。事實(shí)上，玻連蛋白的主要作用是作為經(jīng)由RGD結(jié)合基序與這些細(xì)胞表面整聯(lián)蛋白受體粘性連接的ECM組織分子。VN受體(α_v整聯(lián)蛋白)已經(jīng)顯示調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和侵入所需的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重排，因此，VN結(jié)合整合細(xì)胞粘附和移動(dòng)(DePasquale,1998,Histochemistry and Cell Biology 110:485-94；Huang,2000,Oncogene 19:1915-23)。

然而，就刺激生物學(xué)響應(yīng)例如細(xì)胞遷移和/或增殖而言，以蛋白復(fù)合物存在的KGF和VN的相對(duì)貢獻(xiàn)和它們各自的結(jié)構(gòu)域依然不清楚。

發(fā)明概述

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)包含KGF和VN的蛋白復(fù)合物通過結(jié)合并且協(xié)同共活化角質(zhì)化蛋白生長(zhǎng)因子和結(jié)合VN的整聯(lián)蛋白受體來刺激細(xì)胞遷移和/或增殖。

因此，本發(fā)明廣泛涉及分離包含角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和能夠結(jié)合整聯(lián)蛋白受體的玻連蛋白的結(jié)構(gòu)域的蛋白復(fù)合物，其中所述分離的蛋白復(fù)合物可共活化角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和整聯(lián)蛋白受體并且由此引出生物學(xué)響應(yīng)。

在第一方面，本發(fā)明提供包含下列氨基酸序列的合成嵌合蛋白形式的分離的蛋白復(fù)合物：

(i)角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子或能夠結(jié)合角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的至少一個(gè)分離的結(jié)構(gòu)域；和

(ii)包含玻連蛋白(VN)的至少一個(gè)整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VN的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。

優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_v整聯(lián)蛋白。

更優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_vβ₃整聯(lián)蛋白或α_vβ₅整聯(lián)蛋白。

本發(fā)明的這一方面在其范圍內(nèi)還包括相應(yīng)于上文(i)和(ii)的氨基酸序列的氨基酸缺失、加入、取代和/或突變。

在第二方面，本發(fā)明提供了編碼所述第一方面的分離的蛋白復(fù)合物的分離的核酸。

在第三方面，本發(fā)明提供包含在表達(dá)載體中與一個(gè)或多個(gè)調(diào)控序列可操作地連接的所述第二方面的分離的核酸的基因構(gòu)建體。

優(yōu)選地，所述基因構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。

在第四方面，本發(fā)明提供包含所述第三方面的基因構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。

在第五方面，本發(fā)明提供包含所述第一方面的分離的蛋白復(fù)合物和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。

本發(fā)明的這一方面還預(yù)期包含所述第四方面的宿主細(xì)胞的藥物組合物，其細(xì)胞表達(dá)所述合成蛋白。

在第六方面，本發(fā)明提供所述第一方面的合成蛋白的特異性抗體。

在第七方面，本發(fā)明提供促進(jìn)細(xì)胞遷移的方法，其包括使用合成蛋白結(jié)合角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和整聯(lián)蛋白受體的步驟。

優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_v整聯(lián)蛋白。

更優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_vβ₃整聯(lián)蛋白或α_vβ₅整聯(lián)蛋白。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的這一方面涉及促進(jìn)或誘導(dǎo)上皮細(xì)胞/角質(zhì)化細(xì)胞/成纖維細(xì)胞遷移和/或增殖以有利于動(dòng)物尤其是人類中的傷口愈合。

優(yōu)選地，所述合成蛋白根據(jù)本發(fā)明的第一方面。

在第八方面，本發(fā)明提供阻止細(xì)胞遷移和/或增殖的方法，包括阻止、抑制或另外的減少經(jīng)由包含角質(zhì)化細(xì)胞蛋白生長(zhǎng)因子和玻連蛋白的復(fù)合物結(jié)合角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和整聯(lián)蛋白受體的步驟。

優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_v整聯(lián)蛋白。

更優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_vβ₃整聯(lián)蛋白或α_vβ₅整聯(lián)蛋白。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的這一方面涉及在哺乳動(dòng)物尤其是人類中阻止或抑制癌細(xì)胞的遷移和/或增殖。

本發(fā)明的這一方面預(yù)期的特定實(shí)例是癌細(xì)胞遷移的阻止和抑制。

同樣應(yīng)當(dāng)理解的是所述第七方面和第八方面的方法可包括治療的預(yù)防性和治療性方法。

在第九方面，本發(fā)明提供使用所述第一方面的分離的蛋白復(fù)合物生產(chǎn)下列分子：

(i)包含角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子和玻連蛋白的蛋白復(fù)合物的激動(dòng)劑；或

(ii)包含角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子和玻連蛋白的蛋白復(fù)合物的拮抗劑。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供使用所述第一方面的分離的蛋白復(fù)合物生產(chǎn)下列分子：

(i)KGF:VN蛋白復(fù)合物的激動(dòng)劑；或

(ii)KGF:VN蛋白復(fù)合物的拮抗劑。

根據(jù)本發(fā)明的這一方面產(chǎn)生的激動(dòng)劑和/或拮抗劑可在促進(jìn)傷口愈合、組織工程、皮膚再生和/或防止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或皮膚的過度增生例如瘢痕化和銀屑病上具有特殊功效。

在第十方面，本發(fā)明提供包含所述第一方面的分離的蛋白復(fù)合物的生物材料。

在特定的實(shí)施方案中，所述生物材料可以是適合地浸透、包被或以其他形式包含本發(fā)明的分離的蛋白復(fù)合物的外科植入物、假體、支架、傷口或燒傷敷料或者類似物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1.玻連蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，包括玻連蛋白中不同結(jié)構(gòu)域的殘基參照，以及殘基修飾位點(diǎn)、配體結(jié)合位點(diǎn)和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。

圖2.(a)全長(zhǎng)VN(75kDa)和(b)卵黃VN(54kDa)的結(jié)構(gòu)關(guān)系顯示配體結(jié)合位點(diǎn)。哺乳動(dòng)物和鳥類血清VN具有相同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，然而，在氨基酸序列上有差別。卵黃VN(54kDa)是這些蛋白的截短的形式。所用的縮寫是：Som B，促生長(zhǎng)因子B；連接，連接結(jié)構(gòu)域；血紅素蛋白，血紅素蛋白樣重復(fù)；HBD，肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域；PAI-1，纖溶酶原活化因子抑制劑-1；uPAR，尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑受體；TAT，凝血酶-抗凝血酶III復(fù)合物；uPA，尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑；----，聚陰離子區(qū)(堿性區(qū))；+++，聚陽離子區(qū)(酸性區(qū))。

圖3.(A)成熟玻連蛋白(SEQ ID NO:2)、(B)成熟KGF(SEQ ID NO:3)、(C)優(yōu)選的連接子序列(SEQ ID NO:4-9)和(D)至(H)含KGF和VN的嵌合蛋白的實(shí)施方案(SEQ ID NO:10-14)的氨基酸序列。

圖4.(A)VN:KGF嵌合蛋白刺激初級(jí)角質(zhì)化細(xì)胞遷移。響應(yīng)于用VN:KGF嵌合體和對(duì)照包被的培養(yǎng)孔，被移去以允許向外遷移的接種插入物的內(nèi)室中接種的分離的角質(zhì)化細(xì)胞的遷移。每個(gè)條表示24小時(shí)孵育之后的細(xì)胞覆蓋的平均面積(+/-SEM)并且從至少三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，其中在一式三份的孔中分析處理。(B)VN:KGF嵌合蛋白刺激初級(jí)成纖維細(xì)胞遷移。響應(yīng)于用VN:KGF嵌合體和對(duì)照包被的培養(yǎng)孔，被移去以允許向外遷移的接種插入物的內(nèi)室中接種的分離的皮膚成纖維細(xì)胞的遷移。每個(gè)條表示24小時(shí)孵育之后的細(xì)胞覆蓋的平均面積(+/-SEM)并且從至少三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，其中在一式三份的孔中分析處理。(C)VN:KGF嵌合蛋白刺激初級(jí)角質(zhì)化細(xì)胞增殖。響應(yīng)于用VN:KGF嵌合體和對(duì)照包被的培養(yǎng)孔的分離的皮膚角質(zhì)化細(xì)胞的增殖。每個(gè)條表示72小時(shí)孵育之后DNA結(jié)合GR染色的平均吸光度(代表細(xì)胞數(shù)目)(+/-SEM)并且從至少三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，其中在一式三份的孔中分析處理。(D)VN:KGF嵌合蛋白刺激初級(jí)成纖維細(xì)胞增殖。響應(yīng)于用VN:KGF嵌合體和對(duì)照包被的培養(yǎng)孔的分離的皮膚成纖維細(xì)胞的增殖。每個(gè)條表示24小時(shí)孵育之后DNA結(jié)合GR染色的平均吸光度(代表細(xì)胞數(shù)目)(+/-SEM)并且從至少三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得，其中在一式三份的孔中分析處理。

圖5.對(duì)VN:KGF嵌合蛋白和對(duì)照的初級(jí)角質(zhì)化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞信號(hào)響應(yīng)。VN:KGF嵌合蛋白促進(jìn)相對(duì)各自對(duì)照的相似水平的ERK1/2和AKT信號(hào)通路的活化：(A)角質(zhì)化細(xì)胞ERK1/2；(B)角質(zhì)化細(xì)胞AKT；(C)成纖維細(xì)胞ERK1/2；(D)成纖維細(xì)胞AKT。

發(fā)明詳述

本發(fā)明來自于包含KGF和VN的蛋白復(fù)合物通過由各自細(xì)胞表達(dá)的KGF受體和VN結(jié)合整聯(lián)蛋白受體結(jié)合并表現(xiàn)它們對(duì)細(xì)胞遷移的生物學(xué)作用的發(fā)現(xiàn)。更具體地，這一雙重結(jié)合事件協(xié)同刺激細(xì)胞遷移和/或增殖。

盡管不希望限制于任何特定理論，但是認(rèn)為與KGF相互作用或結(jié)合的VN的結(jié)構(gòu)域是相應(yīng)于成熟VN的氨基酸53-64的VN的聚陰離子區(qū)(SEQ ID NO:2)。

這一發(fā)現(xiàn)使得本發(fā)明發(fā)明人提供包含與VN的整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合的能夠與KGF受體結(jié)合的KGF的至少最小結(jié)構(gòu)域或區(qū)。甚至更具體地，可生產(chǎn)包含這些結(jié)構(gòu)域的單個(gè)的連續(xù)的蛋白。

單個(gè)合成蛋白形式的這些蛋白復(fù)合物協(xié)同結(jié)合或共連接KGF受體和VN結(jié)合整聯(lián)蛋白受體并且因此是對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞遷移和/或增殖和傷口愈合來說有用的劑。類似地，防止KGF受體和VN結(jié)合整聯(lián)蛋白受體共連接可被用于預(yù)防癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

整個(gè)說明書中，除了另外表明之外，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”是包括性而不是排他性使用的，因此所表示的整體或整體的集合可包括一個(gè)或多個(gè)另外的未表示的整體或整體的集合。

在角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特定的上下文中，這樣的結(jié)構(gòu)域?qū)鼋Y(jié)構(gòu)域的氨基酸序列以及所期望的其他的額外的氨基酸。

還應(yīng)當(dāng)理解的是這樣的結(jié)構(gòu)域可“基本上由所述結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與不超過十個(gè)優(yōu)選地不超過五個(gè)或甚至更優(yōu)選地不超過四個(gè)、三個(gè)、兩個(gè)或一個(gè)額外的氨基酸一起組成”。

還應(yīng)當(dāng)理解的是這樣的結(jié)構(gòu)域可在不存在任何另外的氨基酸的情況下“由所述結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列組成”。

為了本發(fā)明的目的，“分離”意指材料已經(jīng)離開其天然狀態(tài)或者由人進(jìn)行了操作。分離的材料可以是實(shí)質(zhì)上或基本上不含在天然狀態(tài)下通常與其相伴的組分，或者可以進(jìn)行操作以便使其與在天然狀態(tài)下通常與其相伴的組分一起處于人工狀態(tài)中。分離的材料包括天然和重組形式的材料。

如本文中所用的，“合成”是指不是天然存在的而是通過人為技術(shù)干涉制備的。在合成蛋白和核酸的上下文中，其涵蓋由重組、化學(xué)合成或本領(lǐng)域己知的技術(shù)組合所產(chǎn)生的分子。

“蛋白質(zhì)”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或者非天然氨基酸，本領(lǐng)域中己知的D-或L-氨基酸。如本領(lǐng)域中所常用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”還包括和涵蓋術(shù)語例如“糖蛋白”、“脂蛋白”以及類似物。

“肽”指的是具有少于50個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。

“多肽“是指具有50個(gè)或更多氨基酸的蛋白質(zhì)。

如上文所述，在一個(gè)特定方面，本發(fā)明提供了合成嵌合蛋白形式的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其包含如下的氨基酸序列：

(i)角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子或能夠結(jié)合角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的角質(zhì)化細(xì)胞

生長(zhǎng)因子的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域；和

(ii)玻連蛋白或玻連蛋白的至少一個(gè)整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

如本文中所用的，“嵌合蛋白”包括連續(xù)的氨基酸序列，所述氨基酸來源于玻連蛋白的整聯(lián)蛋白受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子或角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的至少一個(gè)受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

如本文所用的，“角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子”是能夠體外和/或體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活和/或遷移的生物學(xué)上有活性的蛋白(Marchese等人,1990,J.Cell Physiol.144:326-32；UniProtKB/Swiss-Prot:#P21781，成熟蛋白包含完整序列的氨基酸殘基32-194)mature protein comprises氨基酸殘基32-194of the complete sequenc)。

本發(fā)明的合成嵌合蛋白形式的分離的蛋白復(fù)合物包含角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子或能夠結(jié)合角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域。

在本文中，“結(jié)構(gòu)域”意指至少能夠結(jié)合角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的部分或區(qū)域。通常，盡管不排他的，所述角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體由細(xì)胞表達(dá)，并且所述角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域與所述角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的結(jié)合和連接會(huì)引起細(xì)胞響應(yīng)例如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活和/或遷移。

還應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明的合成嵌合蛋白形式的分離的蛋白復(fù)合物的另一個(gè)組分是玻連蛋白的至少一個(gè)整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_v整聯(lián)蛋白。

更優(yōu)選地，所述整聯(lián)蛋白受體是α_vβ₃整聯(lián)蛋白或α_vβ₅整聯(lián)蛋白。

盡管不希望限制于任何特定理論，但是假定合成嵌合蛋白能夠共連接并共活化角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體和VN的受體以由此刺激、誘導(dǎo)、增加或另外的促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活和/或細(xì)胞遷移。

根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白的優(yōu)點(diǎn)是它們通過化學(xué)合成或重組方式容易地生產(chǎn)并且預(yù)期在體內(nèi)更穩(wěn)定，因?yàn)樗鼈儾灰蕾囉诰S持在非共價(jià)寡聚蛋白復(fù)合物中所需的蛋白-蛋白相互作用。

本發(fā)明預(yù)期不包括VN的C-末端肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HBD)和/或聚陰離子區(qū)的合成嵌合蛋白的實(shí)施方案。“C-末端HBD”意指成熟VN序列的殘基347-459(SEQ ID NO:2)。Xu等人(2001,Proteins 44:312-20)已經(jīng)證明VN在其中央?yún)^(qū)包含第二個(gè)HBD。本發(fā)明沒有預(yù)期這一類似的HBD。

就不包含C-末端HBD和/或聚陰離子區(qū)的VN蛋白及其氨基酸序列而言，可能有天然存在的蛋白例如54kD雞卵黃VN(缺少C末端HBD)或者可以通過VN蛋白或氨基酸序列的缺失、突變或截短來工程化以使C末端HBD和/或聚陰離子區(qū)不存在或至少基本上無功能。

如本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，技術(shù)例如蛋白水解降解和定位突變可被用于這一目的。

在特定的實(shí)施方案中，所述VN的至少一個(gè)整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有選自由下列組成的組的氨基酸序列：

(i)VN的氨基酸殘基1至459；

(ii)VN的氨基酸殘基1至379；

(iii)VN的氨基酸殘基1至346；

(iv)VN的氨基酸殘基1至311；

(v)VN的氨基酸殘基1至130；

(vi)VN的氨基酸殘基1至125；

(vii)VN的氨基酸殘基1至64；和

(viii)VN的氨基酸殘基1至52(所有均以成熟VN序列(SEQ ID NO:2)為參照)。

可包括的另外的氨基酸序列選自由下列組成的組：

(ix)VN的氨基酸殘基65至459；

(x)VN的氨基酸殘基343至376；

(xi)VN的氨基酸殘基347至459；和

(xii)VN的氨基酸殘基347至379(所有均以成熟VN序列(SEQ ID NO:2)為參照)。

上文所述的序列可組合使用，例如VN的氨基酸殘基1至130和VN的氨基酸殘基347至459或VN的氨基酸殘基1至52和VN的氨基酸殘基65至459。

特別的，包含KGF和VN的嵌合蛋白的非限制性實(shí)例示于圖3中并且包括：(i)1-459VN:(Gly₄Ser)₄:1-163KGF:Gly₄Ser Gly₄:6His；(ii)1-311VN:(Gly₄Ser)₄:1-163KGF:Gly₄Ser Gly₄:6His；(iii)1-125VN:(Gly₄Ser)₄:1-163KGF:Gly₄Ser Gly₄:6His；(iv)1-64VN:(Gly₄Ser)₄:1-163KGF:Gly₄Ser Gly₄:6His和(v)1-64VN:(Gly₄Ser)₄:343-376VN:(Gly₄Ser)₄:1-163KGF:Gly₄Ser Gly₄:6His。

在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如合成嵌合蛋白質(zhì)形式，包含KGF和VN或包含VN的至少一個(gè)整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的VN片段。

在本文中，“片段”指的是VN的結(jié)構(gòu)域、亞序列或部分。片段優(yōu)選由成熟VN序列的少于500、少于400、少于300或更優(yōu)選大約80-280個(gè)連續(xù)氨基酸構(gòu)成。

VN的整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域合適地包含RGD序列(成熟VN序列的45-47位氨基酸)。因此，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述合成嵌合體包含包含RGD序列的VN片段。

優(yōu)選地，如上文描述的合成嵌合蛋白還包含位于角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子序列和VN氨基酸序列之間并且與角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子序列和VN氨基酸序列順序相連的“連接體序列”。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接體序列包含一個(gè)或多個(gè)甘氨酸殘基和一個(gè)或多個(gè)絲氨酸殘基。

盡管沒有限制于此，但連接體序列的特定的實(shí)例可選自：Gly₄Ser(SEQ ID NO:4)；Gly₄Ser₃(SEQ ID NO:5)；(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:6)和(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO:7)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，連接體序列包括纖維蛋白溶酶剪切識(shí)別位點(diǎn)(Sakiyama-Elbert等人,2001,FASEB 15:1300-02)，例如根據(jù)序列：

Leu Ile Lys Met Lys Pro(SEQ ID NO:8)。

在還有一個(gè)實(shí)施方案中，連接體序列包括膠原酶-3剪切識(shí)別位點(diǎn)(Kim&Healy,2003,Biomacromolecules 4:1214-23)，例如根據(jù)序列：

Gln Pro Gln Gly Leu Ala Lys(SEQ ID NO:9)

本發(fā)明還延伸至使用本發(fā)明的合成嵌合蛋白的生物學(xué)上有活性的片段和/或使用本文所示例的角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和整聯(lián)蛋白受體結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)上有活性的片段。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述“生物學(xué)上有活性的片段”具有其衍生自的蛋白質(zhì)的不少于10％、優(yōu)選不少于25％、更優(yōu)選不少于50％以及甚至更優(yōu)選不少于75％、80％、85％、90％或95％的生物學(xué)活性。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述“生物學(xué)上有活性的片段”具有其衍生自的蛋白質(zhì)的不少于10％、優(yōu)選不少于25％、更優(yōu)選不少于50％以及甚至更優(yōu)選不少于75％、80％、85％、90％或95％的連續(xù)氨基酸序列。

還預(yù)期本發(fā)明的變體蛋白復(fù)合物。

典型地，涉及蛋白質(zhì)時(shí)，“變體”蛋白質(zhì)具有一或多個(gè)被不同氨基酸替換的氨基酸。本領(lǐng)域己知一些氨基酸能夠被變?yōu)榫哂写笾孪嗨菩再|(zhì)的其他氨基酸而不會(huì)改變蛋白質(zhì)的活性特性(保守取代)。

應(yīng)當(dāng)理解的是參照序列例如角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子、角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、VN的整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基或合成嵌合蛋白中存在一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的殘基可被修飾或缺失或加入額外的序列而基本上不改變本發(fā)明的分離的蛋白復(fù)合物的生物學(xué)活性。

本發(fā)明預(yù)期的成熟VN(SEQ ID NO:2)中的特定突變包括(i)T50A；(ii)T57A；(iii)T50E；(iv)T57E；(v)S378E；(vi)S378A和(v)S362E。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)變體與參照氨基酸序列共享至少70％，優(yōu)選地至少80％和更優(yōu)選地至少90％、95％、98％或99％的序列同一性。

優(yōu)選地，測(cè)量序列同一性超過參考序列的至少60％，更優(yōu)選超過至少75％，更優(yōu)選超過至少90％或更優(yōu)選超過至少95％、98％或者基本上是全長(zhǎng)。

為了確定序列同一性百分比，可以計(jì)算機(jī)執(zhí)行算法(Intelligenetics的Geneworks程序；Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FAST A和TFASTA，Genetics Computer Group，WI，USA)或檢驗(yàn)以及由選擇的不同方法中任一種產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即在對(duì)比窗口中產(chǎn)生最高百分比同源性)進(jìn)行氨基酸和/或核苷酸序列的最佳比對(duì)。關(guān)于BLAST程序家族的參考文獻(xiàn)可見例如Altschul等人所公開的實(shí)例(1997，Nucl.Acids Res.253389)。

在另一例子中，“序列同一性”可以理解為意指由DNASIS計(jì)算機(jī)程序計(jì)算得到的“匹配百分比”(windows版本2.5，來自自Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco,California,USA)。

有關(guān)序列分析的詳細(xì)討論可見于CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的19.3單元，Ausubel等人編輯(John Wiley&Sons Inc NY,1995-1999)。

本發(fā)明還預(yù)期角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、VN的整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或包含其的分離的蛋白復(fù)合物的衍生物。

如本文所用，本發(fā)明的“衍生物”蛋白是已經(jīng)例如通過用其他化學(xué)部分的添加、軛合或復(fù)合或者通過本領(lǐng)域中己知的翻譯后修飾技術(shù)改變的蛋白。

氨基酸的“添加”可以包括將多肽或其變體與其他多肽或蛋白融合。所述其他蛋白例如可以協(xié)助純化蛋白。例如，這包括聚組氨酸標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)、蛋白質(zhì)A，或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。

本發(fā)明所預(yù)期的其他衍生物包括但不限于側(cè)鏈修飾，在肽、多肽或蛋白質(zhì)合成過程中摻入非天然氨基酸和/或其衍生物以及使用交聯(lián)劑和對(duì)本發(fā)明的多肽、片段和變體施加構(gòu)象約束的其他方法。本發(fā)明所預(yù)期的側(cè)鏈修飾的實(shí)例包括氨基修飾，例如使用乙酸酐的?；⑹褂枚《狒退臍溧彵蕉姿狒陌被孽；?、使用甲基乙酰亞胺酯的酰胺化、使用氰酸酯的氨基的氨甲?；?、使用吡哆醛-5-磷酸酯的賴氨酸的吡哆醛化以及之后的使用NaBH₄的還原、通過與醛反應(yīng)之后用NaBH₄還原的還原烷基化以及用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)對(duì)氨基進(jìn)行三硝基苯基化。

羧基基團(tuán)可以通過經(jīng)由O-?；愲逍纬梢约半S后的衍生(derivitization)對(duì)例如相應(yīng)的酰胺進(jìn)行的碳二亞胺活化而修飾。

精氨酸殘基的胍基可以通過與試劑如2,3-丁二酮、苯甲酰甲醛與乙二醛形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物而修飾。

巰基可以通過例如過甲酸氧化成磺基丙氨酸，使用4-氯汞基苯磺酸、4-氯汞苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基酚、氯化苯汞以及其他汞制劑形成汞制劑衍生物，與其他巰基化合物形成混合二硫化物，與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其他取代的馬來酰亞胺反應(yīng)，用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化和在堿性pH下用氰酸酯氨甲?；姆椒ǘ揎棥?/p>

色氨酸殘基可以例如通過使用2-羥基-5-硝基芐基溴或磺酰鹵化物的吲哚環(huán)烷基化或通過使用N-溴代丁二酰亞胺氧化進(jìn)行修飾。

酪氨酸殘基可以通過與四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物來修飾。

組氨酸殘基的咪唑環(huán)可以通過使用焦碳酸二乙酯的N-乙氧羰基化或使用碘乙酸衍生物的烷基化而修飾。

在多肽合成過程中摻入非天然氨基酸和衍生物的實(shí)例包括但不限于使用4-氨基丁酸、6-氨基己酸、4-氨基-3-羥基-5-苯基戊酸、4-氨基-3-羥基-6-庚酸、叔丁基甘氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D異構(gòu)體。

適合蛋白化學(xué)衍生化的方法的實(shí)例見CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE的第15章，Coligan等人編輯，John Wiley&Sons NY(1995-2001)。

分離的蛋白復(fù)合物及其各個(gè)蛋白組分(包括片段、變體、衍生物及同源物)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員己知的任何合適方法制備。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過化學(xué)合成生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成技術(shù)在本領(lǐng)域中是熟知的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Coligan等人編輯，John Wiley&Sons NY(1995-2001)第18章中合適的方法學(xué)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以制備為重組蛋白。

重組蛋白的生產(chǎn)在本領(lǐng)域中是己知的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考標(biāo)準(zhǔn)步驟，例如Sambrook等人,MOLECULAR CLONING A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，l989)，尤其是第16和17節(jié)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY Ausubel等人編輯，(John Wiley&Sons，Inc.1995-1999)，尤其是第10和16章以及CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Coligan等人編輯，(John Wiley&Sons，Inc.1995-1999)，尤其是第1、5和6章中描述的。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過如下方法產(chǎn)生重組蛋白，所述方法包括步驟：

(i)制備表達(dá)構(gòu)建體，其包含在表達(dá)載體中與一或多個(gè)調(diào)控核苷酸序列可操作地連接的編碼所述蛋白質(zhì)的核酸；

(ii)用所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；和

(iii)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述重組蛋白。

“表達(dá)載體”可以是自我復(fù)制的染色體外載體如質(zhì)粒，或者是整合至宿主基因組中的載體。

“可操作地連接”或“可操作地連結(jié)”是指所述調(diào)控核苷酸序列位于相對(duì)于本發(fā)明的重組核酸以起始、調(diào)節(jié)或以其他方式控制核酸轉(zhuǎn)錄或所述核酸編碼的蛋白的翻譯的位置。

通常調(diào)控核苷酸序列是適合于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的。對(duì)于許多宿主細(xì)胞，本領(lǐng)域己知很多類型的適合的表達(dá)載體和適合的調(diào)控序列。

典型地，所述一或多個(gè)調(diào)控核苷酸序列可以包括但不限于啟動(dòng)子序列、前導(dǎo)序列或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、剪接供體/受體序列以及增強(qiáng)子或激活子序列。

組成型啟動(dòng)子(例如CMV、RSV、腺病毒、SV40以及人類延長(zhǎng)因子啟動(dòng)子)和誘導(dǎo)型/抑制型啟動(dòng)子(例如tet-抑制型啟動(dòng)子和IPTG-、金屬硫蛋白-或蛻皮激素-誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)在本領(lǐng)域中是己知的并且預(yù)期在本發(fā)明中。應(yīng)當(dāng)理解的是啟動(dòng)子也可以是一種以上的啟動(dòng)子元件的雜合啟動(dòng)子。

表達(dá)構(gòu)建體還可以包括融合配偶體(典型地是由表達(dá)載體所提供)以使本發(fā)明的重組蛋白表達(dá)為與所述融合配偶體一起的融合蛋白。融合配偶體的主要優(yōu)點(diǎn)是它們有助于所述融合蛋白的鑒定和/或純化。

融合蛋白的己知實(shí)例包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)以及六組氨酸(HIS₆)，其特別用于通過親和層析分離融合蛋白。為了通過親和層析純化融合蛋白，用于親和層析的相關(guān)基質(zhì)分別為谷胱甘肽-、直鏈淀粉-和鎳-或鈷-軛合樹脂。許多這樣的基質(zhì)是以“試劑盒”形式提供，如QIAexpress ^TM系統(tǒng)(Qiagen)，可與HIS₆融合配偶體和Pharmacia GST純化系統(tǒng)一起使用。

在一些情況下，融合配偶體還可具有蛋白酶切割位點(diǎn)，例如X_a因子或凝血酶，其使得相關(guān)蛋白酶能夠部分地消化本發(fā)明的融合蛋白并由此釋放本發(fā)明的重組多肽。釋放的蛋白質(zhì)可以通過后續(xù)的層析分離方法將其從融合配偶體中分離。

本發(fā)明的融合配偶體還包括“表位標(biāo)簽”，其通常是可獲得特異性抗體的短肽序列。可以容易地獲得特異性單克隆抗體的表位標(biāo)簽的己知實(shí)例包括c-myc、血凝素和FLAG標(biāo)簽。

盡管不限于此，但適于表達(dá)的宿主細(xì)胞可以是原核或真核的，例如大腸桿菌(Escherichia coli)(諸如DH5α)、酵母細(xì)胞、使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的Sf9細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS、CV-1、NIH3T3和293細(xì)胞。

表達(dá)構(gòu)建體還可以包括一或多個(gè)選擇標(biāo)記核苷酸序列，其使轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞對(duì)于選擇劑具有抗性。盡管不限于此，但可用于選擇轉(zhuǎn)化細(xì)菌的選擇標(biāo)記包括bla、kanR和tetR，而轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞可以通過例如潮霉素、G418和嘌呤霉素等標(biāo)記來選擇。

就將遺傳材料引入到宿主細(xì)胞而言，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”一般是用于描述將遺傳材料引入到宿主細(xì)胞。有很多己知方法可以將外源遺傳材料引入到宿主細(xì)胞中，包括但不限于磷酸鈣沉淀，電穿孔，lipofectamine、lipofectin和其他親脂劑傳送，磷酸鈣沉淀，DEAE-Dextran轉(zhuǎn)染，微粒轟擊，顯微注射和原生質(zhì)體融合。

本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的合成的嵌合蛋白的分離的核酸，包括其變體及同源物。

如本文所用的，術(shù)語“核酸”是指單鏈或雙鏈mRNA、RNA、cRNA、RNAi和DNA，包括cDNA和基因組DNA以及DNA-RNA雜種。

“多核苷酸”是具有80或更多個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”含有少于80個(gè)連續(xù)核苷酸。

“探針”可以是單鏈或雙鏈寡核苷酸或多核苷酸，為了例如在RNA印跡或DNA印跡中檢測(cè)互補(bǔ)序列而被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記。

“引物”通常是單鏈寡核苷酸，優(yōu)選具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸，其能夠退火至互補(bǔ)的核酸“模板”并在DNA聚合酶例如Taq聚合酶、RNA依賴性DNA聚合酶或Sequenase^TM作用下以模板依賴性方式延伸。

如本領(lǐng)域中己熟知的，本發(fā)明的合成核酸可以通過化學(xué)合成方法產(chǎn)生或者通過利用核酸序列擴(kuò)增技術(shù)的重組方法或通過其組合產(chǎn)生。

根據(jù)本發(fā)明的化學(xué)合成引物和寡核苷酸、合成物以及相關(guān)技術(shù)通?？稍诖蠖鄶?shù)實(shí)驗(yàn)室獲得或者可以購自商業(yè)來源。

盡管不限于此，適合的核酸擴(kuò)增技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的第15章Ausubel等人編輯，(John Wiley&Sons，Inc.1995-1999)所描述的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和連接酶鏈反應(yīng)(LCR)；例如美國專利5,422,252描述的鏈置換擴(kuò)增(SDA)；例如Liu等人(1996，J.Am.Chem.Soc.118:1587)、國際申請(qǐng)WO92/01813和WO97/19193所描述的滾環(huán)復(fù)制(RCR)；例如Sooknanan等人(1994，Biotechniques 17 1077)所描述的基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)以及例如Tyagi等人(1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:5395-4000)所描述的Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增。

優(yōu)選的核酸序列擴(kuò)增技術(shù)是PCR。

如本文所用的，“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指由核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。

在本發(fā)明核酸的產(chǎn)生和表達(dá)中，可利用密碼子序列冗余方面的優(yōu)勢(shì)，以使本文所舉例的核酸可以在不改變編碼的氨基酸序列的情況下進(jìn)行修飾。

在特定實(shí)施方案中，如本領(lǐng)域所熟知的，可根據(jù)宿主細(xì)胞的偏好“密碼子使用”來優(yōu)化核酸，以用于重組表達(dá)。這可以在偏好密碼子使用影響蛋白表達(dá)時(shí)有效地為特定生物體或其細(xì)胞中的最優(yōu)表達(dá)“定制”核酸。

因此，本發(fā)明包括與本文舉例的核酸同源的合成核酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸同源物與編碼本文所描述的合成嵌合蛋白構(gòu)建體中任一個(gè)的核酸具有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、甚至更優(yōu)選至少95％的序列同一性。

優(yōu)選地，序列同一性測(cè)量超過本發(fā)明的編碼核酸的至少70％、更優(yōu)選至少80％、甚至優(yōu)選至少90％、95％或有益地基本上是全長(zhǎng)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，在高嚴(yán)格性條件下，核酸同系物能與編碼本文所描述的合成嵌合蛋白質(zhì)構(gòu)建體中的任一個(gè)的核酸雜交。

本文使用的“雜交(Hybridize)和雜交(hybridization)”用于表明產(chǎn)生DNA-DNA、RNA-RNA或DNA-RNA雙鏈體的至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列的配對(duì)。如本領(lǐng)域中熟知的，雜交的序列通過互補(bǔ)的嘌呤和嘧啶之間的堿基配對(duì)發(fā)生。

在這方面，應(yīng)當(dāng)理解的是修飾的嘌呤(例如肌苷、甲基肌苷和甲基腺嘌呤)和修飾的嘧啶(硫基尿嘧啶和甲基胞嘧啶)同樣可以參與堿基配對(duì)。

如本文所用的，“嚴(yán)格性”是指在雜交時(shí)的溫度和離子強(qiáng)度條件以及是否存在某些有機(jī)溶劑和/或去污劑。嚴(yán)格性越高，雜交核苷酸序列之間也就需要越高的互補(bǔ)性水平。

“嚴(yán)格性條件”是指只有具有高互補(bǔ)堿基頻率的核酸雜交的那些條件。

本文的高嚴(yán)格性條件包括和涵蓋：

(i)至少約31％v/v至至少約50％v/v的甲酰胺和至少約0.01M至至少約0.15M的鹽用于在42℃雜交以及至少約0.01M至至少約0.15M的鹽用于在42℃洗脫；

(ii)1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHP04(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃雜交，以及(a)0.1x SSC、0.1％SDS或(b)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO₄(pH 7.2)、1％SDS用于在高于65℃的溫度洗脫大約1個(gè)小時(shí)，以及

(iii)0.2x SSC、0.1％SDS用于在68℃或高于68℃下洗脫約20分鐘。

通常，洗脫在T_m＝69.3+0.41(G+C)％-12℃進(jìn)行。通常，雙鏈DNA的T_m隨錯(cuò)配堿基數(shù)每增加1％而降低約l℃。

盡管如此，嚴(yán)格性條件是本領(lǐng)域熟知的，例如在CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY的第2.9和2.10章尤其是2.9.1頁至2.9.20頁中描述的，Ausubel等人編輯(John Wiley&Sons Inc NY,1995-1999)。

本發(fā)明還預(yù)期針對(duì)本發(fā)明的合成嵌合蛋白包括嵌合蛋白或其片段、變體和/或衍生物的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆或單克隆的。可以找到可用于抗體生產(chǎn)、純化和使用的己知方案，例如在Coligan等人，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons NY，1991-1994)第2章以及Harlow，E.&Lane，D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。

通常，本發(fā)明的抗體與本發(fā)明的多肽、片段、變體或衍生物結(jié)合或軛合。例如，抗體可以包括多克隆抗體。這些抗體可以通過例如將本發(fā)明的多肽、片段、變體或衍生物注射到生產(chǎn)物種中以獲得多克隆抗血清來制備，所述物種可以包括小鼠或兔。生產(chǎn)多克隆抗體的方法是為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。能夠使用的示例性方法例如描述于Coligan等人，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons NY,1991-1994)以及Harlow,E.&Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Cold Spring Harbor Laboratory,1988中。

作為在生產(chǎn)物種中獲得的多克隆抗血清的替代，單克隆抗體也可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法來生產(chǎn)，例如(1975，Nature 256:495-97)所描述的，或通過其更多近期的修改的方法來生產(chǎn)，例如在Coligan等人，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(John Wiley&Sons NY,1991-1994)中所描述的)通過使來源于已經(jīng)接種一或多種本發(fā)明的多肽、片段、變體或衍生物的生產(chǎn)物種的脾細(xì)胞或其他抗體生產(chǎn)細(xì)胞永生化。

本發(fā)明在其范圍內(nèi)包括如上文所述的多克隆或單克隆抗體的Fc或Fab片段?？蛇x擇地，抗體可包括針對(duì)本發(fā)明的蛋白的單鏈Fv抗體(scFv)。這些scFv可以例如根據(jù)分別描述于美國專利5,091,513、歐洲專利239,400或Winter&Milstein(1991，Nature 349:293-99)的文章描述的方法制備。

可以將標(biāo)記與抗體或抗體片段連接。

標(biāo)記可以選自如下的組，包括：發(fā)色團(tuán)、催化劑、酶、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光分子、鑭系離子例如銪(Eu³⁴)、放射性同位素和直接可見的標(biāo)記。在直接可見的標(biāo)記的實(shí)例中，可使用膠體金屬或非金屬粒子、染料顆粒、酶或底物、有機(jī)聚合物、乳膠顆粒、脂質(zhì)體或其他含有產(chǎn)生信號(hào)的物質(zhì)的小泡以及類似物。

有很多可以用作標(biāo)記的酶在美國專利4,366,241、美國專利4,843,000和美國專利4,849,338中公開。本發(fā)明可以使用的酶標(biāo)記包括堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、熒光素酶、b-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶以及類似物。這些酶標(biāo)記可以單獨(dú)使用或與第二種酶在溶液中組合使用。

例如，雖然不限于此，熒光團(tuán)可以是異硫氰酸熒光素(FITC)、俄勒岡綠、四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITL)、別藻藍(lán)蛋白(APC)和R-藻紅蛋白(RPE)。

本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物，包括其變體和衍生物。

雖然不限于此，這些分離的蛋白復(fù)合物可以是任何形式，包括本發(fā)明的合成嵌合蛋白。

本發(fā)明的藥物組合物可以用于促進(jìn)或以其他方式有利于細(xì)胞遷移、組織再生和傷口愈合?？蛇x擇地，可以施用藥物組合物以通過防止或抑制腫瘤細(xì)胞遷移到第二部位來預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移。

該組合物根據(jù)需要可用于治療性或預(yù)防性治療。例如，藥物組合物可以以治療制品或化妝品制品的形式應(yīng)用于皮膚修復(fù)、傷口愈合、燒傷愈合和其他皮膚病學(xué)治療。

在這方面，藥物組合物可以與生物材料、生物聚合物、無機(jī)材料例如羥基磷灰石或其衍生物、外科植入物、假體、傷口或燒傷敷料、壓縮物、繃帶以及類似物共同施用或作為其成分(其適當(dāng)?shù)亟浮换蛞云渌绞桨鏊幬锝M合物)。

適合地，所述藥物組合物包括適合的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

優(yōu)選所述藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑適合于施用于哺乳動(dòng)物、更優(yōu)選人類。

“藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”是指能夠安全地用于系統(tǒng)施用的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。根據(jù)施用的特定途徑，本領(lǐng)域熟知的很多載體都可以使用。這些載體可以選自以下列的組，包括糖，淀粉，纖維素及其衍生物，麥芽，明膠，滑石粉，硫酸鈣，植物油，合成油，多元醇，褐藻酸，磷酸鹽緩沖溶液，乳化劑，等滲鹽水和鹽例如無機(jī)酸鹽包括氫氯化物、溴化物和硫酸鹽，有機(jī)酸例如乙酸、丙酸和丙二酸以及無熱原水。

一篇描述藥學(xué)上可接受載體、稀釋劑和賦形劑的有用參考文獻(xiàn)是Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)。

可以使用任一種安全施用途徑給患者提供本發(fā)明的組合物。例如，可使用口服、直腸、胃腸外、舌下、口腔、靜脈、關(guān)節(jié)內(nèi)、肌肉、皮內(nèi)、皮下、吸入、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦室內(nèi)、透皮以及類似途經(jīng)。

劑型包括片劑、分散劑、懸浮液、注射劑、溶液、糖漿、錠劑、膠囊、栓劑、氣溶膠、經(jīng)皮貼片以及類似劑型。這些劑型也包括專門為該目的而設(shè)計(jì)的注射或移植控制釋放裝置或者以這種方式作用的改進(jìn)的其他形式的移植物。治療劑的控制釋放可能通過例如用疏水聚合物包被而實(shí)現(xiàn)，所述疏水聚合物包括丙烯酸樹脂、蠟、高級(jí)脂肪醇、聚乳酸和聚羥基酸和某些纖維素衍生物例如羥丙基甲基纖維素。此外，還可以使用其他聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球?qū)崿F(xiàn)控制釋放。

上述組合物可以以與所述劑型相容的方式并且以藥學(xué)有效量施用。在本發(fā)明的背景下，施用給患者的劑量應(yīng)當(dāng)足以在一段合適的時(shí)間內(nèi)在患者中實(shí)現(xiàn)有益的響應(yīng)。藥物的施用量可以取決于待治療的個(gè)體，包括其年齡、性別、體重以及一般健康狀況和取決于醫(yī)生所判斷的因素。

關(guān)于用于傷口愈合的藥物組合物，特別的參考文獻(xiàn)是美國專利5,936,064和國際公開WO99/62536。

本發(fā)明的藥物組合物還可以包括表達(dá)載體例如病毒載體例如牛痘以及基因治療中使用的病毒載體。后者包括腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒(AAV)例如Braun-Falco等人(1999，Gone Thor.6:432-41)所描述的，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體例如guchshacher等人(2000，Blood 95:2499-504)所描述的，來源于單純皰疹病毒和巨細(xì)胞病毒的載體。在Stone等人(2000，J.Endocrinol.164:103-18)中全面概述了用于內(nèi)分泌基因治療的病毒載體。

本發(fā)明還可以利用特定的表達(dá)載體，該載體能夠?qū)⒒虮磉_(dá)靶向表皮細(xì)胞，例如美國專利5,958,764所描述的以及用于體內(nèi)傷口愈合應(yīng)用，例如美國專利5,962,427所描述。

本發(fā)明提供了使用分離的蛋白復(fù)合物(包括本發(fā)明的合成嵌合蛋白)進(jìn)行治療的方法。這些方法特別旨在哺乳動(dòng)物更特別地人類的治療性和/或預(yù)防性治療。

然而，本發(fā)明的治療應(yīng)用也可以用于哺乳動(dòng)物例如家養(yǎng)動(dòng)物和伴侶動(dòng)物，表演動(dòng)物例如如馬、駱駝和灰狗，牲畜，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和用作異種移植的細(xì)胞、器官和組織來源的動(dòng)物。

本發(fā)明還涉及美容治療方法，其中分離的蛋白復(fù)合物，包括本發(fā)明的合成的嵌合蛋白，被施用以改善或提高皮膚質(zhì)量或皮膚外觀。

這種治療可能包括由于皮膚細(xì)胞異常增殖所造成的皮膚疾病例如牛皮癬和增生性疤痕的預(yù)防或補(bǔ)救。

可選擇地，預(yù)期治療方法，其中通過阻斷腫瘤細(xì)胞向第二部位遷移而預(yù)防或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。另外，還預(yù)期通過阻斷細(xì)胞增殖來治療癌癥的方法。

在特定實(shí)施方案中，治療性和/或預(yù)防性治療可以將分離的蛋白復(fù)合物，包括本發(fā)明的合成嵌合蛋白與下列聯(lián)合使用或作為下列的成分：適當(dāng)?shù)赜盟龇蛛x的蛋白質(zhì)復(fù)合物浸漬、包被或以其他方式包含所述分離的蛋白質(zhì)復(fù)合物的生物材料、生物聚合物、無機(jī)材料如氟羥基磷灰石、外科植入物、假體、傷口或燒傷敷料、壓縮物、繃帶和類似物。

這些方法包括施用如前文所定義的藥物組合物，可以通過例如美國專利6,090,790所描述的對(duì)特定組織位點(diǎn)的微針注射，例如美國專利6,054,122所描述的應(yīng)用于傷口、燒傷或潰瘍的局部藥膏、洗劑或密封敷料或例如國際公開WO99/47070所描述的釋放組合物的移植物進(jìn)行。

在這方面基因治療同樣可適用，例如根據(jù)美國專利5,929,040和美國專利5,962,427中的方法。

也還存在為了產(chǎn)生皮膚替代品而對(duì)皮膚細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾的方法，例如遺傳工程化所需生長(zhǎng)因子表達(dá)(Supp等人，2000,J.Invest.Dermatol.114:5-13)。對(duì)于這個(gè)領(lǐng)域的綜述的實(shí)例由Bevan等人(1999,Biotechnol.Gent.Eng.Rev.16:231-56)提供。

同樣預(yù)期的是用轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化細(xì)胞“種植”受體，例如國際公開WO99/11789所描述的。

這些方法可用于刺激細(xì)胞遷移并由此促進(jìn)或進(jìn)行傷口和燒傷愈合，修復(fù)皮膚病變例如潰瘍，組織置換和移植例如通過體外培養(yǎng)自體皮膚，內(nèi)部器官例如腎臟和肺的重新上皮化以及修復(fù)損傷的神經(jīng)組織。

皮膚置換治療在本領(lǐng)域中已經(jīng)變得熟知，其可以使用共培養(yǎng)的上皮細(xì)胞/角質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞系，例如Kehe等人(1999,Arch.Dermatol.Res.291:600-05)所描述或者體外培養(yǎng)原代(通常是自體)表皮細(xì)胞、真皮細(xì)胞和/或角質(zhì)化細(xì)胞。這些技術(shù)還可利用工程化的生物材料和合成的聚合物“支架”。

該領(lǐng)域綜述的實(shí)例通常在Terskikh&Vasiliev(1999,Int.Rev.Cytol.188:41-72)和Eaglestein&Falanga(1998,Cutis 62:1-8)中提供。

更特別地，用于顱面手術(shù)中口腔粘膜替代物的生產(chǎn)描述于Izumi等人(2000,J.Dent.Res.79:798-805)中。胎兒角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮膚成纖維細(xì)胞可以在體外擴(kuò)增以產(chǎn)生用于移植的皮膚以治療皮膚病變，例如Fauza等人(1998,J.Pediatr.Surg.33:357-61)中所描述的，而來源于在透明質(zhì)酸衍生的生物材料上體外培養(yǎng)的真皮和表皮皮膚元件的皮膚替代物已經(jīng)顯示出在治療燒傷中可能是有用的(Zacchi等人,1998,J.Biomed.Mater.Res.40:187-94)。

同樣預(yù)期聚合物支架，其目的在于促進(jìn)置換皮膚工程化，例如Sheridan等人(2000,J.Control Release 64:91-102)和Fauza等人(998,J.Pediatr.Surg.33:357-61)所描述的，以及作為用于將皮膚細(xì)胞遞送至傷口和燒傷部位的藥劑的微球(LaFrance&Armstrong,1999,Tissue Eng.5:153-70)。

本發(fā)明預(yù)期使用分離的蛋白復(fù)合物(包括本發(fā)明的合成嵌合蛋白)鑒定、篩選、設(shè)計(jì)或以其他方式生產(chǎn)包含角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子和玻連蛋白的復(fù)合物的拮抗劑或激動(dòng)劑。這些劑可以是“模擬物”。如本領(lǐng)域中所熟知的，本文使用的術(shù)語“模擬物”是指被設(shè)計(jì)用于模擬蛋白質(zhì)或多肽的特定功能區(qū)的分子，并且在其范圍內(nèi)包括術(shù)語“激動(dòng)劑”、“類似物”和“拮抗劑”。

在一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)了通過KGF:VN復(fù)合物模擬角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和VN受體結(jié)合的激動(dòng)劑。這些分子可以用作例如傷口愈合、皮膚再生等所需的細(xì)胞遷移的刺激物。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，生產(chǎn)了通過KGF:VN復(fù)合物防止或抑制與角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和整聯(lián)蛋白受體結(jié)合的拮抗劑。這些分子具有作為細(xì)胞遷移和/或細(xì)胞增殖的抑制劑并由此可構(gòu)成有用的抗腫瘤劑的使用以及在由異常細(xì)胞增殖導(dǎo)致的皮膚疾病例如牛皮癬和增生性疤痕的治療中的使用。

上述模擬物、激動(dòng)劑、拮抗劑和類似物可能是具有所需生物學(xué)活性和半衰期的肽、多肽或其他有機(jī)分子，優(yōu)選有機(jī)小分子。

計(jì)算機(jī)輔助結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫搜索越來越多地被用于鑒定模擬物的程序。從原理上說，數(shù)據(jù)庫搜索方法可適于鑒定模擬物，這些方法可參見國際公開WO 94/18232(旨在生產(chǎn)HIV抗原模擬物)、美國專利5,752,019以及國際公開WO 97/41526(旨在鑒定EPO模擬物)。

其他方法包括多種鑒定分子相互作用的生物物理學(xué)技術(shù)。這些方法使得可以根據(jù)例如候選分子是否影響KGF:VN復(fù)合物的成來篩選候選分子。CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE Coligan等人編輯(John Wiley&Sons，1997)第20章提供了適用這些潛在有用技術(shù)的方法，例如競(jìng)爭(zhēng)性放射配體結(jié)合測(cè)定(相關(guān)方法參見Upton等人,1999,Endocrinology 140:2928-31)，分析性超離心，微量熱法，表面等離子體共振和基于光學(xué)生物傳感器的方法。

因此，為了本發(fā)明可以更容易理解和實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考下列非限制性實(shí)施例。

實(shí)施例

實(shí)施例1

KGF:VN嵌合物刺激細(xì)胞遷移和增殖

KGF:VN chimeras stimulate cell migration和proliferation

將分離的人類角質(zhì)化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(分別是P1和P3)應(yīng)用于用不同劑量的VN:KGF嵌合物和對(duì)照預(yù)處理的培養(yǎng)孔中接種環(huán)的內(nèi)室。接觸4小時(shí)后，移開接種環(huán)并且允許細(xì)胞響應(yīng)于對(duì)角質(zhì)化細(xì)胞超過24小時(shí)和對(duì)成纖維細(xì)胞超過48小時(shí)的預(yù)結(jié)合處理而向外遷移。從至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞測(cè)定數(shù)據(jù)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)具有一式三份獨(dú)立的測(cè)試并且結(jié)果表示為大于SG/SFM(陰性對(duì)照)的百分比并且示于圖4A和4B。誤差條表示SEM。SG＝處理的綠色培養(yǎng)基，SFM＝無血清培養(yǎng)基(兩者均為陰性對(duì)照)。就使用分離的人類皮膚角質(zhì)化細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)而言，VN:KGF嵌合物證明功能上與各個(gè)組分(VN+KGF)的等摩爾組合相當(dāng)，表明正確的蛋白表達(dá)、純化和加工。檢測(cè)分離的皮膚成纖維細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明VN:KGF嵌合物誘導(dǎo)顯著(p＝<0.05)高于各個(gè)組分(VN+KGF)等摩爾混合的細(xì)胞遷移。

為了評(píng)價(jià)誘導(dǎo)VN:KGF嵌合物的潛力的增殖，分離的人類角質(zhì)化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞(分別是P1和P3)以15,000個(gè)細(xì)胞/cm²的密度被接種至用不同劑量的VN:KGF嵌合物和對(duì)照預(yù)處理的孔中。使得角質(zhì)化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分別增殖超過72和48小時(shí)并且之后移除培養(yǎng)基并將培養(yǎng)板于-80℃迅速冷卻。當(dāng)解凍板時(shí)，將細(xì)胞溶解物和GR染料(Invitrogen，CYQUANT試劑盒)的混合物加至每個(gè)孔并且于室溫孵育5分鐘。之后將板通過在485nm激發(fā)來探測(cè)熒光并且在520nm讀取吸光率。從至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞測(cè)定數(shù)據(jù)，每個(gè)具有一式三份獨(dú)立的測(cè)試并且結(jié)果表示為超過SG/SFM(陰性對(duì)照)的百分比并且示于圖4C和4D。誤差條表示SEM。SG＝處理的綠色培養(yǎng)基，SFM＝無血清培養(yǎng)基(兩者均為陰性對(duì)照)。檢測(cè)分離的人類皮膚角質(zhì)化細(xì)胞中的增殖的實(shí)驗(yàn)證明VN:KGF嵌合物功能上等同于各個(gè)組分(VN+GF)的等摩爾組合。使用分離的皮膚成纖維細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)表明VN:KGF嵌合物(150nM)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖顯著(p＝0.05)高于各個(gè)組分的等摩爾混合和四聚的VN:IGFBP-3:IGF-i:EGF復(fù)合物

實(shí)施例2

VN:KGF信號(hào)

為了評(píng)估VN:KGF嵌合蛋白對(duì)ERK1/2和AKT信號(hào)通路的影響，使用CELISA(Millipore)試劑盒。簡(jiǎn)單地，20,000個(gè)初級(jí)角質(zhì)化細(xì)胞或10,000個(gè)成纖維細(xì)胞被接種于96孔黑底熒光板的孔中并且使其于37℃生長(zhǎng)過夜。之后將細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基(SFM)清洗兩次并且在SFM中孵育過夜以使細(xì)胞血清饑餓。約16小時(shí)后，將血清饑餓培養(yǎng)基用100μl如下的蛋白處理替換：僅VN(1 5nM，相當(dāng)于1125ng/mL)、VN(15nM，相當(dāng)于1125ng/mL)和KGF(50nM，相當(dāng)于820.4ng/mL)以及VN:KGF(50nM，相當(dāng)于1318.9ng/mL)。將細(xì)胞暴露于蛋白處理10分鐘、30分鐘和60分鐘的時(shí)間點(diǎn)，之后用溶于TBS的4％甲醛替換處理溶液以固定細(xì)胞。之后使用基于抗體的方法(ELISA)按照操作手冊(cè)將細(xì)胞的活化的(磷酸化的)ERK 1/2和AKT水平分別測(cè)定為總ERK1/2和AKT的分?jǐn)?shù)。

實(shí)施例3

合成嵌合玻連蛋白:角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白

本文提供的是VN:KGF嵌合物形式的本發(fā)明的合成嵌合蛋白。

合成嵌合蛋白包括與角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合的任何全長(zhǎng)或截短形式的VN，具有或不具有氨基酸殘基修飾。此外，VN和角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子可與或不與不同的肽連接體融合。

設(shè)計(jì)一系列的嵌合表達(dá)構(gòu)建體，其中不同長(zhǎng)度的VN蛋白與全長(zhǎng)的成熟GF蛋白或KGF蛋白能夠與角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體結(jié)合的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域連接，在每個(gè)實(shí)例中，VIM片段優(yōu)選地經(jīng)由連接體與KGF序列連接，例如Gly₄Ser(SEQ ID NO:4)連接體、Gly₄Ser₃(SEQ ID NO:5連接體、(Gly₄Ser)₃(SEQ ID NO:6連接體或(Gly₄Ser)₄(SEQ ID NO:7)連接體。

示例性的合成嵌合蛋白包括但不限于：

A)1-459VN:[連接體；例如(G₄S)₄]:1-163KGF:[連接體；例如G₄SG₄]:6H

B)1-311VN:[連接體；例如(G₄S)₄]:1-163KGF:[連接體；例如G₄SG₄]:6H

C)1-125VN:[連接體；例如(G₄S)₄]:1-163KGF:[連接體；例如G₄SG₄]:6H

D)1-64VN:[連接體；例如(G₄S)₄]:1-163KGF:[連接體；例如G₄SG₄]:6H

E)1-64VN:[連接體；例如(G₄S)₄]:343-376VN:[連接體；例如(G₄S)₄]:1-163

KGF:[連接體；例如G₄SG₄]:6H。

整個(gè)說明書的目的在于描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案而不是將本發(fā)明限制為任何一個(gè)實(shí)施方案或特定特征的集合。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是根據(jù)本公開內(nèi)容?？梢詫?duì)所舉出的特定實(shí)施方案進(jìn)行各種修飾和改變而不背離本發(fā)明的范圍。

本文引用的所有計(jì)算機(jī)程序、算法、專利和科學(xué)文獻(xiàn)均通過引用并入本文。