本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地，涉及一種重組蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性心肌梗死(AMI)是冠狀動脈粥樣硬化疾病(CAD)的更嚴(yán)重表現(xiàn)，是世界頭號致死因數(shù)之一。單單在美國，每年620，000個美國人中就會增加一個MI病人。295，000人為復(fù)發(fā)性心肌梗死，并且將近400，000的心肌梗死病人會因為它的突然性發(fā)作導(dǎo)致死亡。此外，每年估計有150，000人次的心梗病人沒有被記載。急性心肌梗死是由冠狀動脈閉塞導(dǎo)致的。它使得流向心肌處的冠狀動脈血流紊亂，最后導(dǎo)致心肌細胞壞死及心功能損傷。

近期的統(tǒng)計顯示，急性心肌梗死已經(jīng)超過瓣膜病變性心臟疾病及動脈高血壓

成為了如今導(dǎo)致心力衰竭的主要因素。雖然隨著醫(yī)療條件的提高，新藥的研發(fā)，PCI(經(jīng)皮冠狀動脈介入)治療及冠狀動脈旁路血管移植術(shù)的普及，急性心肌梗死病人的生存率得到了顯著的提高。但是，現(xiàn)存的各種治療手段都只能緩解心肌細胞的凋亡，對于已經(jīng)受損的心肌細胞缺乏修復(fù)效果。而已經(jīng)壞死的心肌細胞將成為瘢痕結(jié)締組織，導(dǎo)致心臟重構(gòu)發(fā)生，進一步造成正常的心肌細胞凋亡，最終病人發(fā)展成慢性心衰。并且12％的病人因為不合適的閉塞形式，彌漫性的冠狀動脈粥樣硬化，小血管閉塞或者一些其他復(fù)發(fā)病變，導(dǎo)致他們并不適合于PCI或者CABG治療。因此，一種新的血管生成術(shù)治療手段有益于這類患者。

血管生成術(shù)治療被認為在CAD及MI的治療中作為一種引人關(guān)注的新的 治療策略。血管生成術(shù)治療被定義為：利用血管生長因子去促進新生毛細血管及旁系血管的生長，使它們作為一種內(nèi)源的旁路血管去提高血流量，并且增加缺血組織的血液灌注。然而，目前為止，還沒有一種FDA認可的血管生成術(shù)治療能對應(yīng)對CAD，MI及其他的缺血類疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明提供了一種重組蛋白及其應(yīng)用，其目的在于通過所述重組蛋白的促血管生成作用制備抗心肌梗死及抑制血管滲漏藥物，由此解決現(xiàn)有藥物無法通過促進血管生成從而制備抗心肌梗死及血管滲漏藥物的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種重組蛋白，編碼所述重組蛋白的核酸序列為：

(1)由SEQ ID No.1所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)；或

(2)與序列SEQ ID No.1限定的核酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質(zhì)的核酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的核酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個或多個氨基酸密碼子具有同等活性的由(1)衍生的序列。

優(yōu)選地，編碼所述重組蛋白的核酸序列為：

由SEQ ID No.1所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。

按照本發(fā)明的另一份方面，提供了所述的重組蛋白的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備促血管生成藥物。

按照本發(fā)明的另一份方面，提供了所述的重組蛋白的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備抗心肌梗死藥物。

按照本發(fā)明的另一份方面，提供了所述的重組蛋白的應(yīng)用，其應(yīng)用于制備抑制血管滲漏藥物。

總體而言，通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的重組AGGF1蛋白能通過促進急性心肌梗死小鼠心臟中的血管生成， 改善小鼠心功能，抑制心肌細胞凋亡和心臟纖維化。因此，本發(fā)明含有His標(biāo)簽的重組AGGF1蛋白能制備促血管生成藥物，用于缺血性疾病的治療。同時本發(fā)明中的含有His標(biāo)簽的重組AGGF1蛋白能通過抑制心臟缺血再灌注手術(shù)后，心肌內(nèi)血管的滲漏及水腫，改善小鼠心功能，抑制心臟纖維化。因此，本發(fā)明提供的重組AGGF1蛋白能制備抑制血管滲漏藥物，用于心臟缺血再灌導(dǎo)致血管滲漏，水腫及功能紊亂的治療。

附圖說明

圖1是實施例3新生成血管結(jié)果圖，其中圖1A為免疫組化照片，圖1B為統(tǒng)計結(jié)果；

圖2是實施例3假手術(shù)組和治療組的急性心肌梗死小鼠生存曲線圖；

圖3是實施例3治療組心臟功能生理指標(biāo)數(shù)據(jù)圖，其中圖3A是射血分數(shù)，圖3B是縮短分數(shù)，圖3C是左室舒張內(nèi)徑，圖3D是收縮期內(nèi)徑；

圖4是實施例3重組AGGF1蛋白抑制心肌梗死導(dǎo)致的心臟纖維化結(jié)果圖，其中圖4A是Masson染色照片，圖4B是統(tǒng)計數(shù)據(jù)，圖4C是左室室壁厚度減少結(jié)果統(tǒng)計；

圖5是實施例3的TUNEL實驗結(jié)果，其中圖5A為使用重組AGGF1蛋白治療心肌梗死能抑制心肌細胞凋亡，圖5B為統(tǒng)計數(shù)據(jù)；

圖6是實施例5AGGF1敲除小鼠促進血管滲漏結(jié)果圖，其中圖6A是不同組小鼠腦，胰腺及肝臟的照片，圖6B是不同組小鼠爪子及耳朵Evans藍注射后血管滲漏情況的照片，及統(tǒng)計圖，圖6C左是AGGF1敲除小鼠及野生型小鼠內(nèi)皮細胞中western blot檢測VE-Cadherin磷酸化結(jié)果，圖6C右是AGGF1敲除小鼠及野生型小鼠內(nèi)皮細胞中western blot檢測VE-Cadherin的膜蛋白結(jié)果。圖6D左是AGGF1蛋白處理內(nèi)皮細胞后western blot檢測VE-Cadherin磷酸化結(jié)果，圖6D右是AGGF1蛋白處理內(nèi)皮細胞后western blot檢測VE-Cadherin的膜蛋白結(jié)果，圖6E是AGGF1蛋白處理內(nèi)皮細胞后免疫熒光實驗檢測VE-Cadherin的內(nèi)吞結(jié)果。

圖7是實施例5重組AGGF1蛋白抑制缺血再灌手術(shù)后心臟中血管的滲 漏結(jié)果圖；

圖8是實施例5重組AGGF1蛋白改善心肌梗死后，缺血再灌注小鼠的心功能，其中心臟功能生理指標(biāo)數(shù)據(jù)圖，其中圖8A是射血分數(shù)，圖8B是縮短分數(shù)；

圖9是實施例5重組AGGF1蛋白抑制缺血后再灌小鼠心臟梗死面積，其中圖9A為小鼠心臟Masson染色的顯微鏡照片，圖9B為心肌梗死面積的統(tǒng)計圖；

圖10是實施例5重組AGGF1蛋白治療能顯著抑制小鼠心臟缺血再灌手術(shù)后、心臟的壞死、滲漏及水腫結(jié)果圖，其中圖10A為心臟壞死情況評分統(tǒng)計圖，其中圖10B為心臟滲漏情況評分統(tǒng)計圖，其中圖10C為心臟水腫情況評分統(tǒng)計圖；

圖11是重組AGGF1蛋白治療能顯著抑制小鼠心臟缺血再灌手術(shù)后心肌細胞的炎癥激活，其中圖11A為假手術(shù)組免疫組織化學(xué)顯微鏡照片，圖11B為缺血后再灌注手術(shù)組照片，圖11C為重組AGGF1蛋白治療組照片。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

為了解決那部分不適合PCI及CABG治療的心肌梗死病人的治療問題，本發(fā)明提供一種體外純化的重組蛋白，即AGGF1蛋白，制備促血管生成藥物，所述藥物通過促心肌內(nèi)血管生成，具有治療急性心肌梗死的效果。本發(fā)明提供的一種重組蛋白，編碼所述重組蛋白的核酸序列為：

(1)由SEQ ID No.1所示的核酸序列編碼的蛋白質(zhì)；或

(2)與序列SEQ ID No.1限定的核酸序列同源性在80％至100％編碼相 同功能蛋白質(zhì)的核酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的核酸序列經(jīng)增加、缺失或替換一個或多個氨基酸密碼子具有同等活性的由(1)衍生的序列。

所述重組蛋白命名為AGGF1蛋白，其編碼基因通過基因連鎖定位分析，在先天性靜脈畸形骨肥大綜合征(Klippel-Trenaunay syndrome，簡稱KTS)中發(fā)現(xiàn)并克隆出的新基因。AGGF1蛋白在內(nèi)皮細胞，平滑肌細胞及成骨細胞中有著極高的表達量。并且在各種組織的血管中，都能檢測到AGGF1的較高表達量。雞胚絨毛實驗研究發(fā)現(xiàn)，重組的AGGF1蛋白和VEGF一樣，有強烈的促血管生成能力。并且AGGF1裸質(zhì)粒注射能顯著提高后肢缺血小鼠的缺血后肢血流灌注并且抑制缺血后肢的組織壞死。但是使用AGGF1的純化蛋白對心肌梗死等相關(guān)疾病形成促血管生成治療目前尚無報道。

以下為實施例：

實施例1AGGF1重組蛋白的制備

在大腸桿菌BL21中表達AGGF1蛋白表達質(zhì)粒pet28-AGGF1，其中AGGF1序列如SEQ NO.1所示。將表達菌株在20ml卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。第二天，將這20ml培養(yǎng)基加入到1L卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)2.5小時。然后加入1mM的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達。IPTG是一種高度穩(wěn)定的乳糖類似物，它可以抑制lac阻遏蛋白，誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶的合成。這種酶能促進乳糖的利用。IPTG能用來誘導(dǎo)被lac操縱子調(diào)控的目的基因的表達。加入IPTG誘導(dǎo)后，大腸桿菌在培養(yǎng)基中繼續(xù)生長5.5小時。再離心培養(yǎng)基，4000rpm，4℃，10mins。如果不立即分離蛋白，則把大腸桿菌沉淀儲存在-20℃。純化重組蛋白采用的是QIAexpressionist高水平表達和六聯(lián)組氨酸標(biāo)記蛋白純化手冊(Qiagen)。配制6ml緩沖液((50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,20mM imidazole,0.05％Tween-20,pH 8.0)，加入蛋白酶抑制劑混合物(6μg/ml chymostatin,1μg/ml E64,2μg/ml aprotinin,0.5μg/ml phosphoramidon,1μg/ml pepstatin A,5μg/ml leupeptin,5μg/ml antipain,0.1mM benzamidine(Sigma))。將緩沖液加入到1L培養(yǎng)基離心后的大腸桿菌沉淀中，重懸菌體，在懸浮液中加入1mg/ml溶菌酶(Invitrogen)，冰浴30分鐘。利用超聲波破碎儀的超聲探頭破碎懸浮液。功率300W，每次超聲時間10s，間隙時間10s，進行6次。將破碎后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入EP管中，離心，12000rpm，4℃，50mins。吸取上清液，保存在冰上。Ni-NTA瓊脂糖珠用來從上清液中純化帶his-tag標(biāo)簽的蛋白。Ni-NTA金屬螯合親和層析對帶有六聯(lián)組氨酸標(biāo)簽的生物分子有非常高的親和力。Ni-NTA珠子用5ml的PBS洗兩次，將上清液加入到珠子中(每份珠子加1ml上清液)，混合液在4℃搖床孵育過夜。第二天，離心棄上清。珠子用緩沖液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl,20mM imidazole,0.05％Tween-20,pH 8.0)洗三次，減少非特異性結(jié)合蛋白。6X-his tag標(biāo)記蛋白用1ml洗脫液(50mM NaH₂PO₄,300mM NaCl,250mM imidazole,0.05％Tween-20,pH 8.0)洗脫。洗脫下來的蛋白透析兩次，在4℃1X PBS中用Spectra/Por dialysis tubing(Spectrum Laboratories,Inc.,USA)進行透析。透析后將純化的蛋白質(zhì)分裝保存在-80℃，即為本發(fā)明提供的重組蛋白。

實施例2AGGF1同源重組蛋白制備

對含有AGGF1重組蛋白質(zhì)氨基酸序列有100％，99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％，81％及81％同源性的蛋白質(zhì)制備。構(gòu)建獲得AGGF1同源性蛋白質(zhì)的pet28蛋白表達質(zhì)粒，按照全長的AGGF1蛋白重組方式，進行制備，制備方法同實施例1。

實施例3

實施例1中合成的重組蛋白促血管生成效果及在制備抗心肌梗死藥物中的應(yīng)用

將C57BL/6小鼠分為3組：假手術(shù)組(Sham)，心肌梗死手術(shù)給安慰劑組(MI+IgG)，心肌梗死手術(shù)給重組AGGF1蛋白組(MI+AGGF1),每組小鼠12只。在手術(shù)前及心肌梗死手術(shù)后，用小動物超聲成像系統(tǒng)對小鼠的心功能進行評估。手術(shù)后一天，小鼠用超聲檢測，確定心梗手術(shù)成功。手術(shù)成功一周后，小鼠尾靜脈注射重組AGGF1蛋白或者相同劑量的IgG做為對照，一周兩次，持續(xù)2周。蛋白給藥劑量為：0.25mg/kg。

比較了假手術(shù)組小鼠，用重組AGGF1蛋白治療的急性心肌梗死小鼠及使用對照IgG治療的急性心肌梗死小鼠心臟中，新生成血管的多少(CD31染色)，如圖1A所示，統(tǒng)計結(jié)果如圖1B所示。發(fā)現(xiàn)和對照IgG治療組的小鼠相比，重組AGGF1蛋白治療的急性心肌梗死小鼠的心臟中，新生血管明顯增多。

同時，本發(fā)明實施例中，對比了假手術(shù)組小鼠，用重組AGGF1蛋白治療的急性心肌梗死小鼠及使用對照IgG治療的急性心肌梗死小鼠的生存率。生存曲線數(shù)據(jù)如圖2所示，顯示重組AGGF1蛋白治療能顯著抑制急性心肌梗死小鼠的死亡。

此外，本發(fā)明實施例中，對比了假手術(shù)組小鼠，用重組AGGF1蛋白治療的急性心肌梗死小鼠及使用對照IgG治療的急性心肌梗死小鼠的心功能。相比對照IgG治療組的小鼠，重組AGGF1蛋白治療的急性心肌梗死小鼠心功能有明顯好轉(zhuǎn)，射血分數(shù)LVEF(圖3A)，縮短分數(shù)(圖3B)升高，并且左室舒張末期內(nèi)徑LVEDD(圖3C)及收縮期內(nèi)徑LVESD(圖3D)顯著降低。重組AGGF1蛋白治療的急性心肌梗死小鼠能顯著抑制心肌梗死導(dǎo)致的心臟纖維化(圖4A),其統(tǒng)計數(shù)據(jù)為圖4B，并且能夠抑制心肌梗死小鼠心臟左室室壁厚度的減少(圖4C)。圖5A，TUNEL實驗顯示使用重組AGGF1蛋白治療心肌梗死能抑制心肌細胞凋亡，圖5B為統(tǒng)計數(shù)據(jù)。Caspase3活性檢測也說明，AGGF1能抑制心肌細胞中的凋亡信號活性。

綜上所述，本發(fā)明中的含有His標(biāo)簽的重組AGGF1蛋白能通過促進急 性心肌梗死小鼠心臟中的血管生成，改善小鼠心功能，抑制心肌細胞凋亡和心臟纖維化。因此，本發(fā)明含有His標(biāo)簽的重組AGGF1蛋白能制備促血管生成藥物，用于缺血性疾病的治療。

實施例4

實施例2中合成的重組蛋白促血管生成效果及在制備抗心肌梗死藥物中的應(yīng)用

實驗方法如實施例3所示。結(jié)果顯示實施例2中制備的重組蛋白，有著不同程度的促血管生成作用，能應(yīng)用于制備抗心肌梗死藥物。

實施例5AGGF1蛋白質(zhì)在制備抑制血管滲漏藥物中的應(yīng)用

通過對AGGF1基因敲除小鼠Aggf1^GEO/+及野生小鼠Aggf1^+/+的研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠中Aggf1缺失會導(dǎo)致小鼠腦部，胰臟及肝臟血管滲漏加強(圖6A)。Evans藍染色實驗顯示，Aggf1缺失會導(dǎo)致小鼠爪子及耳朵血管滲漏加強(圖6B)。

機制上研究發(fā)現(xiàn)，小鼠中Aggf1缺失會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞中VE-Cadherin的磷酸化增加，細胞膜上VE-Cadherin降低(圖6C)。使用重組的AGGF1蛋白質(zhì)處理內(nèi)皮細胞，可以降低VE-Cadherin磷酸化，并且促進VE-Cadherin的上膜(圖6D)。免疫熒光實驗也顯示出Aggf1缺失的內(nèi)皮細胞中，VE-Cadherin內(nèi)吞增加，重組AGGF1蛋白質(zhì)處理能抑制VE-Cadherin的內(nèi)吞(圖6E)。

小鼠心肌缺血后再灌注實驗：

實驗分為3組：假手術(shù)組(Sham)，缺血再灌組(IR+Veh)及缺血再灌后AGGF1蛋白治療組(IR+AGGF1)。結(jié)果顯示，IR手術(shù)后，心臟中血管的血管滲漏增強，AGGF1蛋白治療能顯著抑制這種效果(圖11)。同時AGGF1蛋白治療能夠顯著提高心臟缺血再灌手術(shù)后的心功能(圖8)。同時重組的AGGF1蛋白能夠抑制心臟缺血再灌手術(shù)后心肌細胞的梗死(圖9)。對不同組小鼠的心臟中的壞死，滲漏及水腫進行評分，發(fā)現(xiàn)重組AGGF1蛋白治療 能顯著抑制小鼠心臟缺血再灌手術(shù)后，心臟的壞死，滲漏及水腫(圖10)并且抑制炎癥的激活(圖11)。

綜上所述，本發(fā)明中的含有His標(biāo)簽的重組AGGF1蛋白能通過抑制心臟缺血再灌注手術(shù)后，心肌內(nèi)血管的滲漏及水腫，改善小鼠心功能，抑制心臟纖維化。因此，本發(fā)明含有His標(biāo)簽的重組AGGF1蛋白能制備抑制血管滲漏藥物，用于心臟缺血再灌導(dǎo)致血管滲漏，水腫及功能紊亂的治療。

實施例6

實施例2中合成的重組蛋白在制備抑制血管滲漏藥物中的應(yīng)用

實驗方法如實施例3所示。結(jié)果顯示實施例2中制備的重組蛋白，有著不同程度的抑制血管滲漏的作用，能應(yīng)用于制備抑制血管滲漏藥物。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。