本發(fā)明涉及生物技術(shù)和合成生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一套將質(zhì)粒上的表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)優(yōu)化，無(wú)痕插入染色體從而得到完全替代原質(zhì)粒功能的重組大腸桿菌構(gòu)建方法。。

背景技術(shù)：

大腸桿菌是科學(xué)研究中重要的模式生物，為了研究其生命活動(dòng)，人們借助許多外源系統(tǒng)來(lái)開發(fā)研究手段和工具，導(dǎo)入大腸桿菌體內(nèi)進(jìn)行活細(xì)胞的研究。例如Lei Wang,Peter G Schultz等人開發(fā)了遺傳密碼擴(kuò)展技術(shù)，將一對(duì)正交的氨酰tRNA合成酶－tRNA引入大腸桿菌中，使其可以識(shí)別人工合成的具有特定功能的非天然氨基酸，并將其插入目標(biāo)蛋白質(zhì)的特定位置，來(lái)研究體內(nèi)蛋白質(zhì)的功能和對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾調(diào)控。在合成生物學(xué)領(lǐng)域，人們也會(huì)向大腸桿菌體內(nèi)導(dǎo)入一些具有特定功能的控制元件(通常是蛋白質(zhì)或者核酸)，得到具有特殊功能的菌體。同樣在工業(yè)生產(chǎn)中，大腸桿菌是重要的生產(chǎn)載體，導(dǎo)入可表達(dá)的外源基因后作為宿主細(xì)胞，可以生產(chǎn)大量的生物制劑，如重組人胰島素、酶類等。

因此向大腸桿菌體內(nèi)導(dǎo)入外源系統(tǒng)有非常廣泛的用途，然而目前基本都是依靠于質(zhì)粒載體進(jìn)行所需外源基因的表達(dá)，不僅需要加入抗生素進(jìn)行質(zhì)粒的篩選和維持，同時(shí)由于質(zhì)粒復(fù)制子類型和篩選抗性類型的限制，多質(zhì)粒無(wú)法共存，給研究帶來(lái)了很多不便。為了不依賴于質(zhì)粒載體，外源基因可以通過(guò)重組至大腸桿菌染色體上而穩(wěn)定的存在于菌體內(nèi)。但如果外源基因在細(xì)菌染色體上插入的位置不當(dāng)，不僅可能會(huì)造成外源系統(tǒng)欠表達(dá)或過(guò)表達(dá)，同時(shí)也會(huì)造成某些內(nèi)源蛋白質(zhì)或者核酸的表達(dá)缺陷，干擾大腸桿菌宿主的正常生長(zhǎng)。

現(xiàn)有技術(shù)常選擇非必需的基因或者某些目前未知功能的基因位置進(jìn)行插入替換，例如在大腸桿菌代謝乳糖的lacZ基因處插入木聚糖酶，或者在未知功能的基因yihP處插入蔗糖代謝酶等等。因此內(nèi)源的基因表達(dá)會(huì)被破壞，菌體會(huì)缺失原本正常表達(dá)出來(lái)的某種蛋白質(zhì)，盡管在一般研究所使用的培養(yǎng)條件下，并未出現(xiàn)嚴(yán)重的生長(zhǎng)障礙，但因缺乏充分的檢查和驗(yàn)證，很可能菌株存在潛在的生長(zhǎng)障礙和代謝問題，會(huì)在某種實(shí)際應(yīng)用的條件下突顯出來(lái)，從而阻礙科學(xué)研究或者工業(yè)生產(chǎn)。此外，重組時(shí)如果留下篩選標(biāo)記(通常是抗性基因)，菌體會(huì)有潛在的抗生素抗性擴(kuò)散危險(xiǎn)，并且殘留的無(wú)關(guān)核酸序列會(huì)限制菌體進(jìn)一步的重組改造。

因此，亟需研發(fā)一種將有價(jià)值的基因從現(xiàn)有多拷貝質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到大腸桿菌染色體的方法，包括：無(wú)痕的重組大腸桿菌構(gòu)建方法；經(jīng)過(guò)測(cè)試不影響大腸桿菌菌體生長(zhǎng)和代謝的染色體重組位置；合適的啟動(dòng)子和終止子序列使其在單拷貝基因組上的表達(dá)量能與多拷貝質(zhì)粒相當(dāng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建染色體上插入外源表達(dá)系統(tǒng)的大腸桿菌的方法，可以完全替代使用質(zhì)粒的表達(dá)效果，既不影響大腸桿菌生長(zhǎng)代謝又不會(huì)造成任何無(wú)關(guān)核酸序列的殘留。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供一種構(gòu)建染色體上無(wú)痕插入外源表達(dá)系統(tǒng)的重組大腸桿菌的方法，包括如下步驟(重組過(guò)程均參照雙質(zhì)粒重組系統(tǒng))：

S1、將大腸桿菌菌株染色體上的tolC基因敲除，獲得缺失tolC基因的菌株A；

S2、將帶有大腸桿菌自身啟動(dòng)子序列的tolC基因重組至菌株A染色體上的insH11基因處，完全替換insH11基因序列，利用SDS進(jìn)行篩選，得到菌株B；

S3、再將擬重組的外源基因重組至菌株B中，完全替換菌株B染色體上的tolC基因，利用大腸桿菌素colicin E1進(jìn)行篩選，得到菌株C；

S4、將完整的野生型tolC基因重組回菌株C原有tolC基因缺失的位置，利用SDS進(jìn)行篩選，即無(wú)任何無(wú)關(guān)核酸序列殘留并且重組了外源基因的改造菌株。

為了保證外源基因插入的染色體位置不破壞任何已知或未知的蛋白質(zhì)或RNA的功能，不給菌體帶來(lái)任何的影響和改變，本發(fā)明參考大腸桿菌菌體內(nèi)已有轉(zhuǎn)座子插入的位置進(jìn)行外源基因插入位置的選擇。在進(jìn)化過(guò)程中，某些DNA片段(如來(lái)自噬菌體的遺傳物質(zhì))可以隨機(jī)插入細(xì)菌染色體的某些位置，這些DNA片段就是轉(zhuǎn)座子，最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子不含轉(zhuǎn)座酶以外的任何基因序列，直接被稱作插入序列(IS)，它們?cè)诩?xì)菌染色體上的位置經(jīng)過(guò)了漫長(zhǎng)的自然演化與選擇，能夠保存在細(xì)菌染色體上的插入序列成為細(xì)菌染色體的正常組成部分，被認(rèn)為對(duì)細(xì)菌正常的生長(zhǎng)繁殖無(wú)干擾。因此本發(fā)明選擇細(xì)菌染色體上的轉(zhuǎn)座子位置進(jìn)行替換插入。并且為了保證插入的外源基因表達(dá)不會(huì)受到抑制，可以允許高強(qiáng)度表達(dá)，插入位置選擇距離染色體復(fù)制起始位點(diǎn)較近的區(qū)域。

對(duì)研究常用的大腸桿菌K12菌系已測(cè)序的MG1655菌株進(jìn)行染色體插入序列的檢索，發(fā)現(xiàn)其染色體上在不同位置有多個(gè)IS5插入序列，其中一個(gè)被標(biāo)示為insH11基因，插入了染色體yhiS基因序列中，將yhiS序列分隔成yhiS1和yhiS2兩個(gè)片段，并且insH11距離染色體復(fù)制起始位點(diǎn)較近，78.68minutes，第299,094bp-300,110bp

(gb|CP014225.1，基于大腸桿菌K12菌系菌株MG1655)?；诖宋恢脤?duì)于K12菌系而言，天然就存在yhiS基因的插入失活，而且經(jīng)過(guò)了自然界漫長(zhǎng)的各種條件的篩選，充分驗(yàn)證了在這個(gè)位置外源序列的插入對(duì)菌體生長(zhǎng)代謝的干擾可能性很小。并且此插入序列和yhiS序列在其他很多菌株中都是保守存在的(如DH10B等)，因此選擇將擬整合的外源基因放在此處。

利用雙質(zhì)粒重組系統(tǒng)(本發(fā)明涉及的雙質(zhì)粒重組系統(tǒng)已公開于該文獻(xiàn)中：Gene doctoring:a method for recombineering in laboratory and pathogenic Escherichia coli strains)，最終將insH11序列用擬插入的外源基因完全替換，而改造后菌株不殘留任何無(wú)關(guān)核酸序列，構(gòu)建過(guò)程中利用大腸桿菌的tolC蛋白進(jìn)行正篩和負(fù)篩。具有完整tolC蛋白的菌株可以對(duì)抗SDS，沒有tolC蛋白的菌體在SDS脅迫下無(wú)法存活。大腸桿菌素colicin E1會(huì)導(dǎo)致具有tolC蛋白的菌株無(wú)法存活，但缺少tolC蛋白的菌株可以在大腸桿菌素處理時(shí)存活。

所述S2具體包括如下步驟：

S21、利用引物分別擴(kuò)增insH11基因及其上游272bp和下游264bp的序列，通過(guò)RF cloning插入重組質(zhì)粒pDOC-H中，獲得質(zhì)粒pDOC-insH11；

S22、利用引物擴(kuò)增帶有自身啟動(dòng)子的tolC基因，通過(guò)RF cloning替換pDOC-insH11質(zhì)粒上insH11基因的編碼序列，得到重組質(zhì)粒pDOC-insH11:tolC；

S23、將菌株A與S22所得重組質(zhì)粒pDOC-insH11:tolC采用雙質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行重組，利用加入0.01％SDS的培養(yǎng)平板進(jìn)行篩選，得到菌株B。

在重組不同的外源基因時(shí)均可以使用菌株B，并且構(gòu)建菌株B所使用的重組質(zhì)粒pDOC-insH11:tolC通用，只需將tolC基因的序列更換成外源基因序列，重組同源臂序列不變，即可用做插入外源基因的重組質(zhì)粒。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了利用前述方法中的S2步驟構(gòu)建得到的菌株B和重組質(zhì)粒pDOC-insH11:tolC，以及所述菌株B在構(gòu)建無(wú)任何無(wú)關(guān)核酸序列殘留的重組大腸桿菌中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了大腸桿菌染色體基因組的insH11基因位點(diǎn)在插入外源表達(dá)系統(tǒng)中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用具體為：將外源基因重組至大腸桿菌染色體基因組的insH11基因處，完全替換insH11基因序列，可在不影響菌體的生長(zhǎng)和代謝的情況下，對(duì)外源基因?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)，從而完全代替原始質(zhì)粒的功能。

需要說(shuō)明的是，某些大腸桿菌菌株的染色體上具有與所述insH11基因的序列(該序列參考已測(cè)序完整的MG1655菌株的insH11基因序列，gb|CP014225.1，第299,094bp-300,110bp)相同的序列，但該段序列可能未被明確標(biāo)注，或被標(biāo)注為其他名稱，這些情況均不影響本發(fā)明所述方法與應(yīng)用的實(shí)現(xiàn)，也均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

第二方面，本發(fā)明提供了一種可供外源基因在大腸桿菌染色體上表達(dá)的啟動(dòng)子和終止子序列，將可插入非天然氨基酸的正交氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)基因構(gòu)建在此啟動(dòng)子與終止子序列之間，插入染色體后此單元可以得到有效的表達(dá)，在菌體內(nèi)進(jìn)行非天然氨基酸的插入，其效果與在多拷貝質(zhì)粒上表達(dá)的效果相當(dāng)。本發(fā)明在具體實(shí)施方式中提供一種無(wú)痕的可插入非天然氨基酸p-苯甲酰苯丙氨酸(縮寫為pBpa)的菌株(菌株名稱為L(zhǎng)Y928)。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明尋找到一個(gè)普遍存在的可插入外源基因的大腸桿菌染色體位置，以及一套將質(zhì)粒上的表達(dá)系統(tǒng)經(jīng)過(guò)優(yōu)化無(wú)痕插入此位置從而得到完全替代原質(zhì)粒功能的重組大腸桿菌構(gòu)建方法、相關(guān)重組菌株和基因重組質(zhì)粒。經(jīng)測(cè)試重組菌在廣泛使用的培養(yǎng)條件下無(wú)生長(zhǎng)和代謝障礙。并且理論分析可知，此位置進(jìn)行外源基因的插入在任何條件下都不會(huì)干擾菌體的生長(zhǎng)和代謝。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明提供的在染色體上插入外源基因的位置。

圖2為本發(fā)明提供的重組流程示意圖(以實(shí)施例為例)。

圖3為L(zhǎng)Y928菌株與野生型菌株BW25113生長(zhǎng)速率的比較。

圖4為L(zhǎng)Y928菌株與原質(zhì)粒系統(tǒng)對(duì)于非天然氨基酸pBpa插入效率的比較。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。需要理解的是以下實(shí)施例的給出僅是為了起到說(shuō)明的目的，并不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和替換。如使用不同的出發(fā)菌株，或者插入不同的外源基因，這些均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1LY928菌株的構(gòu)建

具體步驟如下：

1.使用K12菌系的BW25113菌株作為出發(fā)菌株，將其染色體上的tolC基因進(jìn)行敲除，構(gòu)建菌株A。出發(fā)菌株BW25113由日本Nara科技中心(Institute of Science and Technology)免費(fèi)向公眾提供。

利用野生型菌株BW25113作為模板，引物tolC-5’和tolC-3’通過(guò)PCR擴(kuò)增出分別帶有上游324bp同源臂序列和下游280bp同源臂序列的tolC基因片段，將此片段通過(guò)RF cloning(本發(fā)明涉及的RF cloning方法已公開于該文獻(xiàn)中：RF cloning:a restriction-free method for inserting target genes into plasmids)插入重組質(zhì)粒pDOC-H中，得到質(zhì)粒pDOC-tolC。利用引物tolC-kana-5’和tolC-kana-3’擴(kuò)增卡那抗性基因，利用RF cloning將卡那霉素抗性基因替換pDOC-tolC質(zhì)粒上tolC基因編碼序列，獲得敲除質(zhì)粒pDOC-deltatolC:kana。所述pDOC-deltatolC:kana質(zhì)粒重組所需的序列如SEQ ID NO.1～3所示。引物詳見表1。

利用pDOC-deltatolC:kana質(zhì)粒參考雙質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行重組。重組子的篩選利用加入卡那霉素的培養(yǎng)平板，可以存活的即為陽(yáng)性重組子，然后進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)重組子菌落，得到菌株A。

2.將菌株A中insH11基因用tolC基因表達(dá)單元替換，構(gòu)建菌株B。

為了保證tolC蛋白的表達(dá)量可以滿足重組過(guò)程中進(jìn)行的正反篩選，因此仍利用原始BW25113菌株染色體上tolC基因的啟動(dòng)子序列，保證其表達(dá)量與野生型的一致。用此tolC表達(dá)單元完全替換insH11的表達(dá)單元(包含其啟動(dòng)子序列)。用野生型BW25113菌株的基因組為PCR擴(kuò)增模板，利用引物isceI-insH11-up-5’和insH11-down-isceI-3’通過(guò)PCR擴(kuò)增出分別帶有上游272bp同源臂序列和下游264bp同源臂序列的insH11基因片段，將此片段通過(guò)RF cloning插入重組質(zhì)粒pDOC-H中，得到質(zhì)粒pDOC-insH11。利用引物insH11-up-tolCp-5’和Tolc-insH11-down-3’擴(kuò)增帶有啟動(dòng)子序列的tolC基因，利用RF cloning將此片段替換pDOC-insH11質(zhì)粒上insH11基因編碼序列，獲得質(zhì)粒pDOC-insH11:tolC。

所述pDOC-insH11:tolC質(zhì)粒的重組所需序列如SEQ ID NO.4～6所示。引物詳見表1。

利用質(zhì)粒pDOC-insH11:tolC參考雙質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行重組。重組子的篩選利用加入0.01％SDS的培養(yǎng)平板，可以存活的即為陽(yáng)性重組子，然后進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)重組子菌落，得到菌株B。

3.修改可識(shí)別插入非天然氨基酸pBpa的氨酰tRNA合成酶-tRNA表達(dá)單元的啟動(dòng)子以及終止子序列，調(diào)整至合適的表達(dá)強(qiáng)度。

質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)遠(yuǎn)多于只有一個(gè)拷貝的染色體，把在質(zhì)粒上的外源表達(dá)系統(tǒng)原封不動(dòng)的轉(zhuǎn)移到染色體上，外源系統(tǒng)的表達(dá)量會(huì)大大降低，可能達(dá)不到所需要求的表達(dá)量。因此需要增強(qiáng)外源系統(tǒng)的表達(dá)效率，使其整合至染色體后仍可表達(dá)出可以發(fā)揮功能的量。

在研究體內(nèi)蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，通過(guò)非天然氨基酸pBpa介導(dǎo)的光交聯(lián)是非常有效的研究手段，而pBpa需要被在體內(nèi)表達(dá)的一對(duì)正交的氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)識(shí)別后才可插入目標(biāo)蛋白中，而目前氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)的表達(dá)依賴于質(zhì)粒載體，為了使該氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)整合至染色體后仍可高效率的插入pBpa，本發(fā)明對(duì)此外源系統(tǒng)的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化，修改了其啟動(dòng)子和終止子序列。

利用輔助質(zhì)粒pSup-BpaRS-6TRN(由Peter G Schultz饋贈(zèng))，依據(jù)已公開的文獻(xiàn)An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E.coi，將pSup-BpaRS-6TRN質(zhì)粒上可插入非天然氨基酸pBpa的氨酰tRNA合成酶-tRNA進(jìn)行優(yōu)化改造，得到質(zhì)粒pSuper。質(zhì)粒pSuper作為PCR擴(kuò)增的模板，利用引物InsH11-pSuper-5’和pSuper-insH11-down-3’將氨酰tRNA合成酶-tRNA表達(dá)單元片段擴(kuò)增出來(lái)，通過(guò)RF cloning插入重組質(zhì)粒pDOC-H中，得到質(zhì)粒pDOC-insH11:Bpa。以質(zhì)粒pDOC-insH11:Bpa為模板，通過(guò)RF cloning，利用引物tac-sd-psuper-5’，insH-tac-3’，psuper-term-3’和term-tRNA-5’修改氨酰tRNA合成酶-tRNA表達(dá)單元的啟動(dòng)子和終止子序列，得到重組質(zhì)粒pDOC-insH11:opt-Bpa。引物詳見表1，表達(dá)單元的具體序列為：

氨酰tRNA合成酶的啟動(dòng)子序列、氨酰tRNA合成酶基因序列和氨酰tRNA合成酶的終止子序列如SEQ ID NO.7～9所示。tRNA的啟動(dòng)子序列、tRNA序列和tRNA的終止子序列如SEQ ID NO.10～12所示。

需要注意的是，該啟動(dòng)子和終止子的組合，并不限于使用在可識(shí)別插入pBpa的氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)上，其余所有的識(shí)別插入非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)均可使用此表達(dá)單元，進(jìn)而重組至細(xì)菌染色體上發(fā)揮功能。

4.用可識(shí)別插入pBpa的氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)表達(dá)單元替換菌株B中的tolC基因，構(gòu)建上述菌株C。

利用重組質(zhì)粒pDOC-insH11:opt-Bpa，在菌株B中參考雙質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行重組，篩選重組子時(shí)加入大腸桿菌素colicin E1，可以存活的即為陽(yáng)性重組子，然后進(jìn)一步測(cè)序確認(rèn)重組子菌落，得到菌株C。

5.將tolC基因重組回菌株C中，得到LY928菌株。

利用步驟1中所得的重組質(zhì)粒pDOC-tolC，在菌株C中參考雙質(zhì)粒重組系統(tǒng)進(jìn)行重組，篩選重組子時(shí)使用加入0.01％SDS的培養(yǎng)平板，可以存活的即為陽(yáng)性重組子，然后使用引物L(fēng)Y928-seq-5’和LY928-seq-3’測(cè)序確認(rèn)陽(yáng)性重組子菌落，得到LY928菌株，引物詳見表1。

表1

6.確認(rèn)LY928菌株的生長(zhǎng)速率是否受到影響

分別挑取LY928以及BW25113野生型菌株單菌落，接入LB培養(yǎng)基中，37度過(guò)夜培養(yǎng)。次日，同時(shí)1:100稀釋LY928以及BW25113菌液重新接種至LB培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)，分別1小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)，4小時(shí)，6小時(shí)，8小時(shí)和25小時(shí)這7個(gè)時(shí)間點(diǎn)，同時(shí)取樣測(cè)量菌液在600nm處的光密度值，LY928以及BW25113均各有三組平行樣品進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)據(jù)見表2所示，結(jié)果顯示，LY928的生長(zhǎng)速率與BW25113菌株無(wú)區(qū)別，將insH11基因替換成修改后的氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)表達(dá)單元，對(duì)菌體無(wú)影響，LY928菌株無(wú)生長(zhǎng)缺陷。

表2

7.確認(rèn)LY928菌株對(duì)于非天然氨基酸pBpa的插入效率

在蛋白翻譯的過(guò)程中，氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)需要識(shí)別琥珀密碼子TAG，將非天然氨基酸pBpa插入目標(biāo)蛋白中。為了測(cè)試LY928的插入效率，利用可表達(dá)大腸桿菌ATP合酶ε亞基的質(zhì)粒載體，使用商業(yè)化的點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將ε亞基的?21位氨基酸的密碼子突變?yōu)殓昝艽a子TAG，此質(zhì)粒命名為pRoc-ε-121-TAG。將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至LY928菌株中，同時(shí)將此質(zhì)粒與pSuper質(zhì)粒(可表達(dá)氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)的質(zhì)粒載體)共轉(zhuǎn)入BW25113菌株中。分別挑取這兩種轉(zhuǎn)化子，接入LB培養(yǎng)基中，37度過(guò)夜培養(yǎng)。次日，同時(shí)1:100稀釋至LB培養(yǎng)基中，每種菌液各接兩份，分別一份加入終濃度100uM的pBpa，另一份不加pBpa，37度培養(yǎng)，長(zhǎng)至OD₆₀₀約0.6時(shí)，各取1ml菌液，使用SDS制樣緩沖液制樣，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳以及免疫印跡進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果顯示，未加入pBpa時(shí)，菌體內(nèi)表達(dá)出來(lái)的是分子量約16kDa的ε亞基截?cái)嗟鞍?121位無(wú)法插入氨基酸而導(dǎo)致翻譯在此位點(diǎn)中止)。加入pBpa時(shí)，通過(guò)菌體內(nèi)表達(dá)出來(lái)的氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)識(shí)別，將pBpa插入121位點(diǎn)，從而翻譯出來(lái)分子量約18kDa的完整的ε亞基。LY928菌株插入pBpa的效率與使用pSuper質(zhì)粒的效率相近，并且稍好一些。說(shuō)明染色體上整合的氨酰tRNA合成酶－tRNA對(duì)可以正常表達(dá)發(fā)揮功能，LY928菌株可以完全替代質(zhì)粒完成非天然氨基酸的插入。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。