本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及TREM-2基因在鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒易感性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起，于1987年最早出現(xiàn)在美國，隨后在歐洲出現(xiàn)報(bào)道。我國于1996年由郭寶清等首次分離到PRRSV，將分離毒株命名為CH-1a，證實(shí)了該病在我國存在。早在1992年，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International Des Epizooties，OIE）就將該病列為B類傳染病。目前，PRRS是養(yǎng)豬業(yè)中最重要的傳染病之一，在全球?qū)︷B(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2005年，PRRS對(duì)美國養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)56,000萬美元，而現(xiàn)在，每年損失估計(jì)將高達(dá)66,400萬美元。PRRS幾乎分布在所有的養(yǎng)豬國家。豬感染PRRSV后，一般會(huì)繼發(fā)細(xì)菌如副豬嗜血桿菌、鏈球菌等感染。在臨床上，PRRS與豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）混合感染病例較多。2006年，我國大部分省份及越南爆發(fā)了豬高熱?。≒orcine high fever syndrome，PHFS），給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，此病是由變異的PRRSV引起，命名為高致病型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）。HP-PRRSV特征為高熱、高致病性及高死亡率。目前，農(nóng)業(yè)部已將該病列入重大動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃。

PRRSV的防控是目前我國乃至世界的難題。PRRSV難于防控主要表現(xiàn)在以下幾方面：（1）嗜巨噬細(xì)胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染豬的肺泡巨噬細(xì)胞（Porcine alveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫細(xì)胞，破壞PAMs，從而破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)，從而引起免疫抑制；（2）抗原變異性，目前PRRSV變異較快，弱毒疫苗的使用是促使病毒變異的一個(gè)原因，最近有文獻(xiàn)報(bào)道，美國出現(xiàn)了藍(lán)耳新毒株NADC30，而我國也分離到類似美國的新毒株，命名為NADC30-like，而另有文獻(xiàn)報(bào)道從豬場(chǎng)中分離到與疫苗毒基因組高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增強(qiáng)，分析有可能是疫苗毒反強(qiáng)或重組并散毒；（3）疫苗沒有交叉保護(hù)力，目前市場(chǎng)上PRRSV疫苗幾乎無交叉保護(hù)力，不同毒株間不交叉保護(hù)力；（4）抗體依賴性增強(qiáng)，PRRSV的感染會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但低效價(jià)的抗體不但不能中和病毒，反而對(duì)病毒的增殖有促進(jìn)作用；（5）病毒持續(xù)性感染，PRRSV感染后，能夠長時(shí)間在豬體內(nèi)檢測(cè)到病毒血癥，PRRSV在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長達(dá)5個(gè)月；（6）混合感染，目前臨床上多見藍(lán)耳與其他疾病混合感染，特別是圓環(huán)病毒、副豬嗜血桿菌、豬肺疫等與PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控難上加難。

目前研究顯示，PRRSV感染的必需受體為CD163，故若能找到調(diào)控CD163表達(dá)的基因即可調(diào)節(jié)PRRSV感染，從而可針對(duì)此基因開展新的豬藍(lán)耳病防控技術(shù)。并且，若能找到調(diào)控CD163表達(dá)的基因，還可以以此基因作為豬對(duì)PRRSV抗性或易感性的判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選豬對(duì)藍(lán)耳病病毒的抗性或者易感性，這可能是未來藍(lán)耳病防治的重要途徑之一，通過建立豬對(duì)PRRSV抗性或易感性的判定標(biāo)準(zhǔn)，為PRRSV抗病育種奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有豬藍(lán)耳病防治技術(shù)的缺陷和不足，提供TREM-2基因在鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒易感性的應(yīng)用，TREM-2基因通過調(diào)控CD163表達(dá)進(jìn)而調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制，PRRSV感染PAMs細(xì)胞后促進(jìn)TREM-2基因表達(dá)。TREM-2基因的表達(dá)量與PRRSV的復(fù)制息息相關(guān)，有望成為一種新型的判定豬對(duì)PRRSV易感性的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)PRRSV抗性豬的篩選和培育具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明的目的是提供TREM-2基因在鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒易感性中的應(yīng)用。

本發(fā)明的另一目的是提供一種鑒別評(píng)價(jià)豬對(duì)藍(lán)耳病毒易感性的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供TREM-2基因在提高豬對(duì)藍(lán)耳病毒抗性以及在制備提高豬對(duì)藍(lán)耳病毒抗性的藥物或制劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的是提供TREM-2基因在培育對(duì)藍(lán)耳病毒具有抗性的豬品種方面的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

TREM-2基因在鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒（PRRSV）易感性中的應(yīng)用。所述豬TREM-2基因的序列號(hào)為NM_001256777.1。

所述藍(lán)耳病毒包括經(jīng)典毒株和高致病性毒株。

一種鑒別評(píng)價(jià)豬對(duì)藍(lán)耳病毒易感性的方法（也即上述應(yīng)用的方法），是檢測(cè)豬體內(nèi)TREM-2基因的表達(dá)水平，根據(jù)TREM-2基因的表達(dá)水平鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒（PRRSV）是具有抗性還是具有易感性。

所述鑒別的標(biāo)準(zhǔn)是：TREM-2表達(dá)量低時(shí)，豬對(duì)藍(lán)耳病毒（PRRSV）具有抗性；反之具有易感性。

另外，本發(fā)明對(duì)于TREM-2基因表達(dá)量的檢測(cè)方法不作限制。可以是本領(lǐng)域內(nèi)任意的基因表達(dá)量檢測(cè)方法。

作為一種可優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)豬TREM-2基因表達(dá)量的引物組，所述引物組包括上游引物TREM2-F和下游引物TREM2-R，序列分別如SEQ ID NO.1~2所示。

另外，以下所述的應(yīng)用均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)：

TREM-2基因在提高豬對(duì)藍(lán)耳病毒抗性方面的應(yīng)用。

TREM-2基因在制備提高豬對(duì)藍(lán)耳病毒抗性的藥物或制劑方面的應(yīng)用。

TREM-2基因在篩選和/或培育對(duì)藍(lán)耳病毒具有抗性的豬品種方面的應(yīng)用。

TREM-2基因表達(dá)抑制劑在提高豬對(duì)藍(lán)耳病毒抗性方面的應(yīng)用。

TREM-2基因表達(dá)抑制劑在制備提高豬對(duì)藍(lán)耳病毒抗性的藥物或制劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明經(jīng)過大量的研究和探索，首次發(fā)現(xiàn)豬體內(nèi)TREM-2可以通過調(diào)控金屬蛋白酶ADAM17活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)CD163表達(dá)，最終影響調(diào)節(jié)PRRSV的復(fù)制；PRRSV感染靶細(xì)胞后促進(jìn)TREM-2基因表達(dá)，以利于病毒復(fù)制。即TREM-2基因表達(dá)量與PRRSV感染息息相關(guān)，當(dāng)TREM-2表達(dá)量低時(shí)，豬對(duì)PRRSV具有抗性，反之易感。

本發(fā)明還通過體外siRNA干擾和過表達(dá)分析了TREM-2基因與PRRSV復(fù)制的關(guān)系。另外還研究了TREM-2基因調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制的分子機(jī)制，TREM-2基因通過激活金屬蛋白酶ADAM17，進(jìn)而切割CD163胞外域，最終抑制PRRSV復(fù)制。

另外，本發(fā)明選用了不同品種豬研究TREM-2基因在鑒別豬對(duì)PRRSV易感性中的應(yīng)用。分別選取我國地方品種通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬為例，進(jìn)行PRRSV攻毒，根據(jù)TCID₅₀及PRRSV N蛋白表達(dá)水平確定通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬對(duì)PRRSV感染力，根據(jù)TREM-2基因表達(dá)水平研究其與4種品種豬對(duì)PRRSV感染力關(guān)系。結(jié)果顯示，本發(fā)明說明的利用TREM-2基因鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒的抗性或易感性的方法是可靠的、準(zhǔn)確的。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次研究發(fā)現(xiàn)了豬體內(nèi)TREM-2基因表達(dá)量與PRRSV感染息息相關(guān)，TREM-2可以通過調(diào)控金屬蛋白酶ADAM17活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)CD163表達(dá)，最終影響PRRSV復(fù)制；PRRSV感染靶細(xì)胞后促進(jìn)TREM-2基因表達(dá)。因此TREM-2基因可以作為一種新型的判定PRRSV易感性的標(biāo)準(zhǔn)；當(dāng)TREM-2表達(dá)量低時(shí)，豬對(duì)PRRSV具有抗性，反之易感。

本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)為鑒別豬對(duì)PRRSV易感性以及PRRSV抗病育種奠定基礎(chǔ)，對(duì)PRRSV抗性豬的篩選和培育具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于豬藍(lán)耳病的防控具有重要的意義。同時(shí)，本發(fā)明也為TREM-2基因提供了一種新的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為LPS刺激PAMs細(xì)胞后以及PRRSV感染PAMs細(xì)胞后，TREM-2表達(dá)量變化。圖中，A和B表示PAMs經(jīng)LPS刺激后，TREM-2基因表達(dá)水平顯著下降； C和D表示PAMs經(jīng)LPS刺激后，PRRSV復(fù)制被抑制；E和F表示PRRSV感染PAMs后，TREM-2基因表達(dá)量顯著升高。

圖2為LPS刺激PAMs細(xì)胞后，金屬蛋白酶ADAM17和CD163表達(dá)量變化。（A）LPS刺激PAMs細(xì)胞后，ADAM17表達(dá)量升高；（B）LPS刺激PAMs細(xì)胞后，抑制CD163表達(dá)。

圖3為TREM-2基因經(jīng)siRNA干擾后，TREM-2表達(dá)量下降，同時(shí)PRRSV復(fù)制受到抑制；（A）siRNA干擾后，相對(duì)于NC對(duì)照組，S1與S2干擾組TREM-2基因mRNA表達(dá)量顯著地被抑制；（B）siRNA干擾后，相對(duì)于NC對(duì)照組，S1與S2干擾組PRRSV N基因mRNA表達(dá)量顯著地被抑制。

圖4為LPS刺激細(xì)胞后，TREM-2基因調(diào)控PRRSV機(jī)制圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

本發(fā)明以下實(shí)施例的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有試驗(yàn)至少3次獨(dú)立重復(fù)，結(jié)果采用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用單因素方差分析和T檢測(cè)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用以P<0.05作為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分析軟件為SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

實(shí)施例1 PAMs細(xì)胞分離和培養(yǎng)

1、經(jīng)檢測(cè)無PRRSV、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬瘟病毒（CSFV）等特定病原感染的SPF級(jí)6-8周齡的斷奶仔豬綁定后，前腔靜脈放血致死，結(jié)扎氣管，剖開胸部，連同心臟取出完整的肺臟，用無菌PBS液充分漂洗肺表面，清除血塊和污物，清除完畢后摘除心臟。灌入PBS緩沖液，輕輕拍打捏揉肺表面5-10 min，回收支氣管肺泡灌洗液。重復(fù)步驟2至3次，直至共回收約1000 mL灌洗液。將回收得到的肺泡灌洗液用移液器輕輕來回吹打，使細(xì)胞團(tuán)塊分開，4℃，1000 rpm離心灌洗液10 min，棄去上清。RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，4℃，1000 rpm離心5 min，棄去上清。用含20%的FBS的 RPMI-1640 營養(yǎng)液輕輕吹打重懸細(xì)胞，為防止操作污染，加入雙抗，將分離得到的細(xì)胞均勻分到培養(yǎng)板中，于37℃、5% CO₂加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、觀察PAMs細(xì)胞形態(tài)、活性，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例2 TREM-2基因體外調(diào)節(jié)PRRSV復(fù)制的研究

1、用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細(xì)胞，加入LPS刺激2 h后，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，分別對(duì)TREM-2基因和PRRSV N蛋白做qRT-PCR和Western-Blot檢測(cè)。結(jié)果如圖1中A、B、C、D所示，LPS刺激PAMs細(xì)胞后，TREM-2基因表達(dá)量下降，同時(shí)PRRSV被抑制。

2、另外，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細(xì)胞，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，分別對(duì)TREM-2基因做qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)。結(jié)果如圖1中E、F所示，PRRSV感染PAMs細(xì)胞后，TREM-2表達(dá)量顯著升高。

實(shí)施例3 TREM-2基因與ADAM17及CD163關(guān)系驗(yàn)證

1、用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細(xì)胞，加入LPS刺激2 h后，以MOI=0.1接毒PRRSV，在2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，分別對(duì)CD163及ADAM17基因做qRT-PCR檢測(cè)。

2、結(jié)果如圖2所示，LPS刺激PAMs細(xì)胞后，金屬蛋白酶ADAM17表達(dá)量升高，而CD163表達(dá)被抑制。

實(shí)施例4 體外TREM-2基因干擾

1、將設(shè)計(jì)好的3對(duì)TREM-2 siRNA（S1、S2、S3）及1對(duì)Negative Control （NC對(duì)照）送Thermo Fisher Scientific公司合成，使用Lipofectamine? RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher Scientific），在2個(gè)6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細(xì)胞至60-70%密度，分別將siRNA（3對(duì)siRNA和1個(gè)對(duì)照）及Lipofectamine? RNAiMAX用Opti-MEM^?Reduced Serum Medium稀釋，稀釋后按1：1比例混合并室溫培養(yǎng)5 min，然后加入到換有新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液的PAMs細(xì)胞上37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，棄上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞通過qRT-PCR驗(yàn)證TREM-2干擾效果。另外一個(gè)6孔板培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入PRRSV，再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞通過qRT-PCR驗(yàn)證TREM-2干擾后對(duì)PRRSV復(fù)制影響。

2、結(jié)果如圖3所示，TREM-2基因經(jīng)siRNA干擾后，相對(duì)于NC對(duì)照組，siRNA S1、S2都顯著性地抑制了TREM-2 mRNA表達(dá)（圖3 A所示）。同時(shí)，TREM-2基因干擾后，PRRSV接毒，相對(duì)于NC對(duì)照組，S1與S2干擾組PRRSV N基因mRNA表達(dá)都顯著地被抑制了（圖3 B所示）。綜上所述，TREM-2基因經(jīng)siRNA干擾后，PRRSV復(fù)制被抑制。

實(shí)施例5 體外TREM-2基因過表達(dá)

1、構(gòu)建pcDNA3.1-TREM-2過表達(dá)載體，在2個(gè)6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)PAMs細(xì)胞至60-70%密度，使用Lipofectamine? 2000 （Thermo Fisher Scientific）分別將pcDNA3.1-TREM-2和pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)入PAMs細(xì)胞，在37℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，棄上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞檢測(cè)過表達(dá)效果。另外一個(gè)6孔板培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基中加入PRRSV，再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞檢測(cè)TREM-2過表達(dá)后對(duì)PRRSV復(fù)制影響。

2、根據(jù)結(jié)果可判斷，TREM-2轉(zhuǎn)染PAMs細(xì)胞過表達(dá)后使TREM-2表達(dá)量升高；同時(shí)，TREM-2過表達(dá)后，使PRRSV 復(fù)制升高。

另外，經(jīng)過大量的研究顯示，LPS刺激細(xì)胞后，TREM-2基因調(diào)控PRRSV復(fù)制的機(jī)制如圖4所示。

實(shí)施例6 TREM-2基因在鑒別豬對(duì)PRRSV易感性中的應(yīng)用

1、選取我國地方品種通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，驗(yàn)證本發(fā)明利用TREM-2基因鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒易感性的方法。

其中，已知通城豬和梅山豬對(duì)藍(lán)耳病毒不易感，即具有抗性；而長白豬和大白豬對(duì)藍(lán)耳病毒更易感。

2、實(shí)驗(yàn)方法

選擇通城豬、梅山豬、長白豬、大白豬各6頭，每3頭1組，即分成2組，其中1組進(jìn)行PRRSV攻毒，另外1組不做任何處理（對(duì)照），分別在攻毒后第7、14、21、28 d采血，對(duì)照組同步采血，第28 d處死，采集肺組織。

取一部分血清進(jìn)行TCID₅₀測(cè)定，剩余血清及肺組織提取RNA、反轉(zhuǎn)，對(duì)TREM-2基因及PRRSV N蛋白進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。

根據(jù)TCID₅₀及PRRSV N蛋白表達(dá)水平確定通城豬、梅山豬及國外品種長白豬、大白豬對(duì)PRRSV感染力，根據(jù)TREM-2基因表達(dá)水平研究其與4種品種豬對(duì)PRRSV感染力關(guān)系。

3、根據(jù)結(jié)果可判斷，通城豬和梅山豬對(duì)藍(lán)耳病毒不易感，而長白豬和大白豬對(duì)藍(lán)耳病毒更易感。

同時(shí)，TREM-2基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果顯示，通城豬和梅山豬體內(nèi)TREM-2基因表達(dá)水平顯著低于長白豬和大白豬。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大學(xué)

<120> TREM-2基因在鑒別豬對(duì)藍(lán)耳病毒易感性中的應(yīng)用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctgagtctcc tggttctg 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

acacacaaat ctccacttc 19