技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種與水稻GS3功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記及檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

水稻作為人類最重要的糧食作物，改良水稻品質(zhì)、提高水稻產(chǎn)量一直是作物育種學(xué)研究主要內(nèi)容，由于我國(guó)耕地減少人口卻增多，糧食產(chǎn)量不高，因此提高水稻產(chǎn)量有著特別重要的戰(zhàn)略性意義，也是保障糧食安全的重要路徑。因此，對(duì)水稻的研究，特別是對(duì)水稻產(chǎn)量的主要影響因素如水稻穂數(shù)、每穗的粒數(shù)、每粒重量等的研究從位間斷。而水稻的粒重是由水稻的長(zhǎng)和圓等性狀所決定的,GS3基因定位于水稻第3染色體近著絲粒區(qū)（康美花,王豐,賀浩華等.稻米外觀品質(zhì)性狀的遺傳與標(biāo)記定位研究進(jìn)展[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,37(5):168-170.），影響著水稻種子籽粒大小，經(jīng)過(guò)研究證實(shí)了水稻的GS3基因控制水稻籽粒的長(zhǎng)粒和圓粒，從而影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，水稻GS3基因作為負(fù)調(diào)節(jié)控制水稻籽粒的大小，性狀表現(xiàn)為長(zhǎng)粒的水稻不含有GS3蛋白（丁丹,張亞?wèn)|,鄭佳等.水稻粒長(zhǎng)基因GS3和qGL3功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)及應(yīng)用[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,(6):1191-1197.）。這些研究成果對(duì)水稻品種改良及水稻產(chǎn)量提升等育種方面有著重要作用。

稻谷粒形的遺傳基礎(chǔ)比較復(fù)雜，是典型的數(shù)量性狀。利用分子標(biāo)記技術(shù)可以對(duì)控制數(shù)量性狀的QTL(Quantitative Trait Locus) 進(jìn)行定位和分解，將復(fù)雜的數(shù)量性狀分解為簡(jiǎn)單的孟德?tīng)栆蜃觼?lái)進(jìn)行研究。利用這種方法，近年來(lái)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和克隆了部分控制稻谷粒形的QTLs?？傮w來(lái)看，已克隆與粒形有關(guān)的基因主要有3 類：第一類為多效基因，對(duì)粒形的影響只是其作用之一，但效應(yīng)可能很大。其典型代表為矮稈小?；?，如 d11(Tanabe et al.2005.A Novel Cytochrome P450Is Implicated in Brassinosteroid Biosynthesis via the Characterization of a Rice Dwarf Mutant,dwarf11,with Reduced Seed Length.The Plant Cell3:776-790)、d1(Ueguchi-Tanaka et al.2000.Rice dwarf mutant d1,which is defective in theαsubunit of the heterotrimeric G protein,affects gibberellin signal transduction.Proc Natl Acad Sci USA 21:11638-11643) 等，均表現(xiàn)植株矮化，谷粒短而圓。此類基因一般難以直接應(yīng)用于生產(chǎn)；第二類為粒寬主效控制基因，可能對(duì)水稻的籽粒灌漿速度有一定影響，對(duì)其它農(nóng)藝性狀的影響較小。已克隆的基因主要有 GW2(Song et al.2007.A QTL for rice grain width and weight encodes a previously unknown RING-type E3ubiquitin ligase.Nature Genetics 39:623-630)、GW5(Weng et al.2008.Isolation and initial characterization of GW5,a major QTL associated with rice grain width and weight.Cell Research 12:1199-1209)、GS5(Li et al.2011.Natural variation in GS5plays an important role in regulating grain size and yield in rice.Nature Genetics 12:1266-1269) 和 qGW8(Wang et al.2012. Control of grain size,shape and quality by OsSPL16in rice.Nature Genetics 8:950-954)；第三類為粒長(zhǎng)主效控制基因，可能對(duì)粒寬或水稻的籽粒灌漿速度有一定影響，對(duì)其它農(nóng)藝性狀的影響較小。已克隆的基因主要有 GS3(Zhang et al. 2013.Fine mapping of GS3, a dominant gene for big grain rice. The Crop Journal 1:160-165)。

基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記因其具有的獨(dú)特優(yōu)越性而成為解決這些科學(xué)問(wèn)題的有力工具之一。其優(yōu)越性體現(xiàn)在 ：①表現(xiàn)穩(wěn)定，多態(tài)性直接以 DNA 形式表現(xiàn)，無(wú)組織器官、發(fā)育時(shí)期特異性，不受環(huán)境條件、基因互作影響 ；②數(shù)量多，理論上遍及整個(gè)基因組 ；③多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無(wú)需專門人為創(chuàng)造特殊遺傳材料，這為大量重要性狀基因 緊密連鎖的標(biāo)記篩選創(chuàng)造了條件 ；④對(duì)目標(biāo)性狀表達(dá)無(wú)不良影響，與不良性狀無(wú)必然連鎖 ；⑤部分標(biāo)記遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體與雜合體 ；⑥成本低，一般實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。 對(duì)于特定探針或引物可引進(jìn)或根據(jù)發(fā)表的特定序列自行合成。 基于這些特點(diǎn)，分子標(biāo)記現(xiàn)已被廣泛用于水稻有關(guān)功能基因標(biāo)記、基因克隆、遺傳圖譜和物理圖譜的繪制、農(nóng)藝性狀的分子標(biāo)記輔助選擇、生物進(jìn)化、遺傳多樣性研究等許多方面研究。

盡管已克隆出一批控制水稻粒形的基因，然而目前對(duì)其遺傳基礎(chǔ)的了解還相當(dāng)有限。因此，迫切需要應(yīng)用數(shù)量較大的種質(zhì)資源，挖掘更多新的水稻粒形控制基因位點(diǎn)，篩選出相關(guān)的特異性標(biāo)記，可為水稻GS3功能基因分子標(biāo)記輔助選擇的開(kāi)展提供極大的便利，并可為理解控制水稻粒形的基因得遺傳基礎(chǔ)提供條件，也為更好更快地培育具有理想粒形的水稻新品種提供基因資源和技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供水稻GS3功能基因分子標(biāo)記及檢測(cè)方法，通過(guò)檢測(cè)這些與水稻GS3功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，從而獲得水稻圓粒和長(zhǎng)粒功能基因的確切標(biāo)記，為水稻圓粒和長(zhǎng)粒品種選育奠定理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供一種水稻GS3功能基因分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的名稱分別為HGS3F3R3、HGS3F7R7、HGS3F10R10、HGS3F15R15，與其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。

所述分子標(biāo)記HGS3F3R3的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .2所示序列，反向引物如Seq ID No .3所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F7R7的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .5所示序列，反向引物如Seq ID No .6所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F10R10的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .8所示序列，反向引物如Seq ID No .9所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F15R15的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .11所示序列，反向引物如Seq ID No .12所示序列。

所述Seq ID No .2：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’，

Seq ID No .3：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’；

Seq ID No .5：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’，

Seq ID No .6：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’；

Seq ID No .8：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’，

Seq ID No .9：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’；

Seq ID No .11：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’，

Seq ID No .12：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’。

所述分子標(biāo)記是由上述引物對(duì)以水稻基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。

所述分子標(biāo)記如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。

本發(fā)明的與水稻GS3功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，即水稻粒形主效基因位點(diǎn) GS3的分子標(biāo)記（HGS3F1R1、HGS3F2R2、HGS3F3R3、HGS3F4R4、HGS3F5R5、HGS3F6R6、HGS3F7R7、HGS3F8R8、HGS3F9R9、HGS3F10R10、HGS3F11R11、HGS3F12R12、HGS3F13R13、HGS3F14R14、HGS3F15R15、HGS3F16R16、HGS3F17R17、HGS3F18R18、HGS3F19R19、HGS3F20R20、HGS3F21R21、HGS3F22R22、GS3-FR1、GS3-FR2、gS3-F1R），由下述之一的引物對(duì)經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得：

1) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F1R1

Seq ID No .：5’- TACTCGTTGGAAGTGTGCGT -3’

Seq ID No .：5’- TTGGGGTTGGGCGTAAATGA -3’

2) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F2R2

Seq ID No .：5’- CCAAAAACGGCAATCCCCTC-3’

Seq ID No .：5’-CCATTGCCATGTCACTCCGAA -3’

3) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F3R3

Seq ID No .：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’

Seq ID No .：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’

4) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F4R4

Seq ID No .：5’- CAGTTCCCCAAAAACTGCTCC-3’

Seq ID No .：5’- ACTGGTGTGTTAGTGCAGTG-3’。

5) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F5R5

Seq ID No .：5’- GCGTCCCTCCACCTAAACTC-3’

Seq ID No .：5’- ACTCCACAAACCGCTAGAGA-3’

6) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F6R6

Seq ID No .：5’- GCTGGTCCACGCTAGTTTCT-3’

Seq ID No .：5’- ATATGCATGCGCTGCTTGAG-3’

7) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F7R7

Seq ID No .：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’

Seq ID No .：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’

8) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F8R8

Seq ID No .：5’- CATGCCCATCTCCCTCGTTT-3’

Seq ID No .：5’- TCATGATCAAAAACTGGGGTAAGT-3’。

9) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F9R9

Seq ID No .：5’- CCAGCACATTTAATTTCTGAACG-3’

Seq ID No .：5’- AACTTGCTCTTACGGGAGGAC-3’

10) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F10R10

Seq ID No .：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’

Seq ID No .：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’

11) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F11R11

Seq ID No .：5’- CCTTGGACTAATTCGCGAGAC-3’

Seq ID No .：5’- TTTTAGCCCATGTCATATCGGA-3’

12) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F12R12

Seq ID No .：5’- AAGCCAAGTCACGTGTGGAA-3’

Seq ID No .：5’- CCGGCCGGTACATAACACAA-3’。

13) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F13R13

Seq ID No .：5’- AAAGCAATGTCTATGTTAATGGT-3’

Seq ID No .：5’- TGGCCCACAATACGCAAGTA-3’

14) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F14R14

Seq ID No .：5’- ACTTCGTCGATTGTGTGTGGACT-3’

Seq ID No .：5’- TCGCTTCTCCGATGAACTGC-3’

15) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F15R15

Seq ID No .：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’

Seq ID No .：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’

16) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F16R16

Seq ID No .：5’- ATGTGCAAGACCAGCGATCA-3’

Seq ID No .：5’- GCTCCGATCCACCTCAAACA-3’。

17) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F17R17

Seq ID No .：5’- TGAACAATGACGCTGTCTCT-3’

Seq ID No .：5’- TCGACGTTTTGTACATGTTTGAGG-3’

18) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F18R18

Seq ID No .：5’- ACTGGACCACGAACTCATTG-3’

Seq ID No .：5’- TGAAGGGTAGGAAGAGAAGGTT-3’

19) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F19R19

Seq ID No .：5’- TCTGCCACCAGTGAATGCAA-3’

Seq ID No .：5’- GGCCATTTCGGTGGAACCTA-3’

20) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F20R20

Seq ID No .：5’- TAGAACGATAAGTAATTTGAAGCGG-3’

Seq ID No .：5’- CACTTGCTCTGCACAAACAG-3’。

21) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F21R21

Seq ID No .：5’- GGCGTCCCTCGTGCTG -3’

Seq ID No .：5’- AGTACGCGCGCAGCTC-3’。

22) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F22R22

Seq ID No .：5’- GCTGCCATGATGAGTACGTG -3’

Seq ID No .：5’- GCTCTCGCATGAGAGCCAA-3’。

23) 分子標(biāo)記名稱，GS3-FR1

Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’

Seq ID No .：5’- AGGGCTGGCTTACTCGCTG-3’。

24) 分子標(biāo)記名稱，GS3-FR2

Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’

Seq ID No .：5’- CAGCAGGCTGGCTTACTCTATT-3’。

25) 分子標(biāo)記名稱，gS3-F1R

Seq ID No .：5’- GCTGCCTCCAGATGCCGC-3’

Seq ID No .：5’- CAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’。

本發(fā)明還提供一種鑒定和選育水稻大粒品種的方法，包括以下步驟 ：

1) 分別以水稻功能基因GS3 的供體、受體材料作為親本，提取親本基因組 DNA，利用HGS3F3R3、HGS3F7R7、HGS3F10R10、HGS3F15R15用于 PCR 擴(kuò)增與水稻功能基因GS3 緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，選取在供體材料與受體材料間擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、易于鑒定識(shí)別的引物對(duì)作為檢測(cè)標(biāo)記 ；

2) 提取待測(cè)水稻的基因組 DNA，利用步驟 1) 中篩選到的檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

如果待測(cè)水稻具有純合 GS3 供體帶型，判定其基因型為 GS3GS3，如果待測(cè)水稻具有雜合帶型，判定其基因型為 GS3gs3，如果待測(cè)水稻具有純合受體帶型，判定其基因型為gs3gs3。

PCR 擴(kuò)增體系按 20μl 計(jì)為 ：正向、Seq ID No .各1.5μl、0.2μl dNTP（10mM）、2μl 10×PCR 緩沖液、 0.1μl Taq DNA 聚合酶（5U/μl），用 ddH2O 補(bǔ)齊至 18μl，最后加模板DNA 2μl。

PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?：94℃預(yù)變性 5 分鐘 ；94℃變性 30 秒、55℃退火 30 秒、72℃延伸45秒，35 個(gè)循環(huán) ；72℃延伸 7 分鐘。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 6％聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色法檢測(cè)，或采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明中涉及的水稻功能基因GS3 的供體材料包括世紀(jì)五豐公司提供的22中品系的水稻攜帶功能基因GS3 的衍生材料及其它具有功能基因GS3 的材料，具體包括13種長(zhǎng)粒水稻 7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38，9種圓粒水稻1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。在水稻插栽10-15天時(shí)，每株取上部1～3片長(zhǎng)約5～10cm的幼葉葉尖，每種材料取4個(gè)樣。

發(fā)明中涉及的水稻功能基因GS3 的受體材料包括稻屬所有材料，例如栽培稻及野生稻。

本發(fā)明還提供水稻粒形主效基因位點(diǎn) GS3 的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，即用上述之一的引物對(duì)擴(kuò)增功能基因GS3 的供體 ( 包括‘川大?！捌鋽y帶功能基因GS3 的衍生材料 ) 及受體 ( 包括栽培稻及野生稻在內(nèi)的稻屬所有材料 ) 基因組 DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、易于辨別的引物對(duì)即可作為檢測(cè)標(biāo)記，選用其中 1-2 個(gè)引物對(duì)作為檢測(cè)標(biāo)記。待測(cè)材料具有 GS3純合供體帶型說(shuō)明其基因型為 GS3GS3，雜合帶型 ( 既有供體帶型又有受體帶型 ) 說(shuō)明其基因型為 GS3gs3，純合受體帶型說(shuō)明其基因型為gs3gs3。

篩選上述標(biāo)記引物的過(guò)程如下 ：

（1）DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

將提取到的DNA原液10μl稀釋到2ml,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值，DNA在260nm處有吸收峰，DNA檢測(cè)OD260/OD280在1.8至2.0時(shí)，提取的DNA樣質(zhì)量比較純，電泳時(shí)，跑出來(lái)的條帶比較清晰，帶型完整。

（2）GS3特異PCR擴(kuò)增結(jié)果

回收用于測(cè)序的水稻DNA樣品包括HGS3F3R3引物擴(kuò)增的圓粒，HGS3F7R7引物擴(kuò)增的長(zhǎng)粒，HGS3F7R7引物擴(kuò)增的圓粒，HGS3F10R10引物擴(kuò)增的圓粒，HGS3F15R15引物擴(kuò)增的圓粒。

（3）序列比對(duì)分析

雙向測(cè)序的序列通過(guò)ContigExpres軟件進(jìn)行序列拼接，將拼接的序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information）美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心檢測(cè)，目的基因與已知基因比較其差異性。

一種水稻GS3功能基因分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括步驟：根據(jù)權(quán)利要求1的分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以被檢測(cè)水稻基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記；其中所述分子標(biāo)記HGS3F3R3的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .2所示序列，反向引物如Seq ID No .3所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F7R7的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .5所示序列，反向引物如Seq ID No .6所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F10R10的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .8所示序列，反向引物如Seq ID No .9所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F15R15的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .11所示序列，反向引物如Seq ID No .12所示序列。

本發(fā)明提供了一種篩選大粒水稻的方法，利用本發(fā)明提供的上述 23 個(gè)引物對(duì)之一進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增供體、受體及待檢水稻基因組 DNA，如果供體和受體水稻基因組 DNA 的擴(kuò)增產(chǎn)物存在易于識(shí)別、穩(wěn)定的多態(tài)性，該引物對(duì)即可用于檢測(cè)待檢水稻。如果均為大粒基因GS3 供體帶型，說(shuō)明為純合大粒基因型 GS3GS3 ；如果既有供體帶型又有受體帶型，說(shuō)明為雜合基因型 GS3GS3 ；如果均為受體帶型，說(shuō)明為純合小?；蛐?GS3GS3。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了與功能基因GS3 緊密連鎖的分子標(biāo)記，借助分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)可有目的地進(jìn)行大?；虻膶?dǎo)入和聚合，培育大粒 ( 或長(zhǎng)粒 ) 型水稻新品種 ( 或親本 )。本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)在 ：

( 1 ) 本發(fā)明首次精細(xì)定位了水稻材料中的功能基因 GS3。

(2 ) 通過(guò)本發(fā)明分子標(biāo)記定位的主效基因位置明確，鑒定方便。通過(guò)檢測(cè)與 GS3基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記，即可預(yù)測(cè)水稻的粒形，可用于苗期早期篩選、檢測(cè)基因型純合與否及進(jìn)行多基因聚合育種。在聚合多個(gè)長(zhǎng)粒 ( 或大粒 ) 基因培育 ( 或創(chuàng)制 ) 高檔特長(zhǎng)粒品種 ( 或親本 ) 時(shí)效果尤其顯著。而且，本發(fā)明檢測(cè)方便快速，不受環(huán)境影響。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例水稻總DNA檢測(cè)結(jié)果；

圖2為實(shí)施例引物HGS3F3R3擴(kuò)增DNA條帶；

圖3為實(shí)施例引物HGS3F7R7擴(kuò)增DNA條帶；

圖4為實(shí)施例引物HGS3F10R10擴(kuò)增DNA條帶；

圖5為實(shí)施例引物HGS3F15R15擴(kuò)增DNA條帶。

具體實(shí)施方式

本實(shí)施例提供水稻GS3功能基因分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記分別如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。

所述分子標(biāo)記HGS3F3R3的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .2所示序列，反向引物如Seq ID No .3所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F7R7的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .5所示序列，反向引物如Seq ID No .6所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F10R10的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .8所示序列，反向引物如Seq ID No .9所示序列；所述分子標(biāo)記HGS3F15R15的引物對(duì)的正向引物如Seq ID No .11所示序列，反向引物如Seq ID No .12所示序列。

所述引物對(duì)分別為：

Seq ID No .2：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’，

Seq ID No .3：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’；

Seq ID No .5：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’，

Seq ID No .6：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’；

Seq ID No .8：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’，

Seq ID No .9：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’；

Seq ID No .11：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’，

Seq ID No .12：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’。

所述分子標(biāo)記是上述的引物對(duì)以水稻基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的。

所述分子標(biāo)記如Seq ID No .1、Seq ID No .4、Seq ID No .7、Seq ID No .10所示序列。

本實(shí)施例的與水稻GS3功能基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，即水稻粒形主效基因位點(diǎn) GS3的分子標(biāo)記（HGS3F1R1、HGS3F2R2、HGS3F3R3、HGS3F4R4、HGS3F5R5、HGS3F6R6、HGS3F7R7、HGS3F8R8、HGS3F9R9、HGS3F10R10、HGS3F11R11、HGS3F12R12、HGS3F13R13、HGS3F14R14、HGS3F15R15、HGS3F16R16、HGS3F17R17、HGS3F18R18、HGS3F19R19、HGS3F20R20、HGS3F21R21、HGS3F22R22、GS3-FR1、GS3-FR2、gS3-F1R），由下述之一的引物對(duì)經(jīng) PCR 擴(kuò)增獲得：

1) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F1R1

Seq ID No .：5’- TACTCGTTGGAAGTGTGCGT -3’

Seq ID No .：5’- TTGGGGTTGGGCGTAAATGA -3’

2) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F2R2

Seq ID No .：5’- CCAAAAACGGCAATCCCCTC-3’

Seq ID No .：5’-CCATTGCCATGTCACTCCGAA -3’

3) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F3R3

Seq ID No .：5’- CTCCACCGCGAGATCGGATT -3’

Seq ID No .：5’- AAGGAGTGGTTTTAAGCTGGGG-3’

4) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F4R4

Seq ID No .：5’- CAGTTCCCCAAAAACTGCTCC-3’

Seq ID No .：5’- ACTGGTGTGTTAGTGCAGTG-3’。

5) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F5R5

Seq ID No .：5’- GCGTCCCTCCACCTAAACTC-3’

Seq ID No .：5’- ACTCCACAAACCGCTAGAGA-3’

6) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F6R6

Seq ID No .：5’- GCTGGTCCACGCTAGTTTCT-3’

Seq ID No .：5’- ATATGCATGCGCTGCTTGAG-3’

7) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F7R7

Seq ID No .：5’- GCTCAAAGCATCTGTTTTGGAATTG-3’

Seq ID No .：5’- AGCAAGTACTGTCACTGCTAATG-3’

8) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F8R8

Seq ID No .：5’- CATGCCCATCTCCCTCGTTT-3’

Seq ID No .：5’- TCATGATCAAAAACTGGGGTAAGT-3’。

9) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F9R9

Seq ID No .：5’- CCAGCACATTTAATTTCTGAACG-3’

Seq ID No .：5’- AACTTGCTCTTACGGGAGGAC-3’

10) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F10R10

Seq ID No .：5’- CTACTGCGTCTTGGAGTCCG-3’

Seq ID No .：5’- CCAAACAGGCCCTAAGTTCCA-3’

11) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F11R11

Seq ID No .：5’- CCTTGGACTAATTCGCGAGAC-3’

Seq ID No .：5’- TTTTAGCCCATGTCATATCGGA-3’

12) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F12R12

Seq ID No .：5’- AAGCCAAGTCACGTGTGGAA-3’

Seq ID No .：5’- CCGGCCGGTACATAACACAA-3’。

13) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F13R13

Seq ID No .：5’- AAAGCAATGTCTATGTTAATGGT-3’

Seq ID No .：5’- TGGCCCACAATACGCAAGTA-3’

14) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F14R14

Seq ID No .：5’- ACTTCGTCGATTGTGTGTGGACT-3’

Seq ID No .：5’- TCGCTTCTCCGATGAACTGC-3’

15) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F15R15

Seq ID No .：5’- CTGCACTGTGCTAATTGGTGT-3’

Seq ID No .：5’- GACCACGTCGATCATCAAGGA-3’

16) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F16R16

Seq ID No .：5’- ATGTGCAAGACCAGCGATCA-3’

Seq ID No .：5’- GCTCCGATCCACCTCAAACA-3’。

17) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F17R17

Seq ID No .：5’- TGAACAATGACGCTGTCTCT-3’

Seq ID No .：5’- TCGACGTTTTGTACATGTTTGAGG-3’

18) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F18R18

Seq ID No .：5’- ACTGGACCACGAACTCATTG-3’

Seq ID No .：5’- TGAAGGGTAGGAAGAGAAGGTT-3’

19) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F19R19

Seq ID No .：5’- TCTGCCACCAGTGAATGCAA-3’

Seq ID No .：5’- GGCCATTTCGGTGGAACCTA-3’

20) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F20R20

Seq ID No .：5’- TAGAACGATAAGTAATTTGAAGCGG-3’

Seq ID No .：5’- CACTTGCTCTGCACAAACAG-3’。

21) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F21R21

Seq ID No .：5’- GGCGTCCCTCGTGCTG -3’

Seq ID No .：5’- AGTACGCGCGCAGCTC-3’。

22) 分子標(biāo)記名稱，HGS3F22R22

Seq ID No .：5’- GCTGCCATGATGAGTACGTG -3’

Seq ID No .：5’- GCTCTCGCATGAGAGCCAA-3’。

23) 分子標(biāo)記名稱，GS3-FR1

Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’

Seq ID No .：5’- AGGGCTGGCTTACTCGCTG-3’。

24) 分子標(biāo)記名稱，GS3-FR2

Seq ID No .：5’- CTGTATATATATTTCTTGCAGGTG-3’

Seq ID No .：5’- CAGCAGGCTGGCTTACTCTATT-3’。

25) 分子標(biāo)記名稱，gS3-F1R

Seq ID No .：5’- GCTGCCTCCAGATGCCGC-3’

Seq ID No .：5’- CAAAGTTCATGATCAAAAACTGGGG-3’。

本實(shí)施例還提供一種鑒定和選育水稻大粒品種的方法，包括以下步驟 ：

1) 分別以水稻功能基因GS3 的供體、受體材料作為親本，提取親本基因組 DNA，利用權(quán)利要求 1 所述的用于 PCR 擴(kuò)增與水稻功能基因GS3 緊密連鎖的分子標(biāo)記的引物對(duì)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，選取在供體材料與受體材料間擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、易于鑒定識(shí)別的引物對(duì)作為檢測(cè)標(biāo)記 ；

2) 提取待測(cè)水稻的基因組 DNA，利用步驟 1) 中篩選到的檢測(cè)標(biāo)記進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

如果待測(cè)水稻具有純合 GS3 供體帶型，判定其基因型為 GS3GS3，如果待測(cè)水稻具有雜合帶型，判定其基因型為 GS3gs3，如果待測(cè)水稻具有純合受體帶型，判定其基因型為gs3gs3。

PCR 擴(kuò)增體系按 20μl 計(jì)為 ：正向、Seq ID No .各1.5μl、0.2μl dNTP（10mM）、2μl 10×PCR 緩沖液、 0.1μl Taq DNA 聚合酶（5U/μl），用 ddH2O 補(bǔ)齊至 18μl，最后加模板DNA 2μl。

PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?：94℃預(yù)變性 5 分鐘 ；94℃變性 30 秒、55℃退火 30 秒、72℃延伸45秒，35 個(gè)循環(huán) ；72℃延伸 7 分鐘。

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 6％聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染顯色法檢測(cè)，或采用本領(lǐng)域已知的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。

本實(shí)施例中涉及的水稻功能基因GS3 的供體材料包括世紀(jì)五豐公司提供的22中品系的水稻攜帶功能基因GS3 的衍生材料及其它具有功能基因GS3 的材料，具體包括13種長(zhǎng)粒水稻 7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38，9種圓粒水稻1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。在水稻插栽10-15天時(shí)，每株取上部1～3片長(zhǎng)約5～10cm的幼葉葉尖，每種材料取4個(gè)樣。

實(shí)施例中涉及的水稻功能基因GS3 的受體材料包括稻屬所有材料，例如栽培稻及野生稻。

本實(shí)施例還提供水稻粒形主效基因位點(diǎn) GS3 的分子標(biāo)記檢測(cè)方法，即用上述之一的引物對(duì)擴(kuò)增功能基因GS3 的供體 ( 包括‘川大粒’及其攜帶功能基因GS3 的衍生材料 ) 及受體 ( 包括栽培稻及野生稻在內(nèi)的稻屬所有材料 ) 基因組 DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性好、易于辨別的引物對(duì)即可作為檢測(cè)標(biāo)記，選用其中 1-2 個(gè)引物對(duì)作為檢測(cè)標(biāo)記。待測(cè)材料具有 GS3純合供體帶型說(shuō)明其基因型為 GS3GS3，雜合帶型 ( 既有供體帶型又有受體帶型 ) 說(shuō)明其基因型為 GS3gs3，純合受體帶型說(shuō)明其基因型為gs3gs3。

篩選上述標(biāo)記引物的過(guò)程如下 ：

（1）DNA提取與質(zhì)量檢測(cè)

將提取到的DNA原液10μl稀釋到2ml,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定230 nm、260 nm及280 nm的吸光值，DNA在260nm處有吸收峰，DNA檢測(cè)OD260/OD280在1.8至2.0時(shí)，提取的DNA樣質(zhì)量比較純，電泳時(shí)，跑出來(lái)的條帶比較清晰，帶型完整。圖1為水稻總DNA檢測(cè)結(jié)果，其中泳道：1～22分別代表水稻品種7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85。

（2）GS3特異PCR擴(kuò)增結(jié)果

回收用于測(cè)序的水稻DNA樣品包括HGS3F3R3引物擴(kuò)增的圓粒，HGS3F7R7引物擴(kuò)增的長(zhǎng)粒，HGS3F7R7引物擴(kuò)增的圓粒，HGS3F10R10引物擴(kuò)增的圓粒，HGS3F15R15引物擴(kuò)增的圓粒。DNA樣在6%聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2-5所示：圖2為引物HGS3F3R3擴(kuò)增DNA條帶，其中M:分子量標(biāo)記， 泳道：1～22分別代表水稻品種7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；圖3為引物HGS3F7R7擴(kuò)增DNA條帶M:分子量標(biāo)記， 泳道：1～22分別代表水稻品種7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；圖4為引物HGS3F10R10擴(kuò)增DNA條帶，其中M:分子量標(biāo)記， 泳道：1～22分別代表水稻品種7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；圖5為引物HGS3F15R15擴(kuò)增DNA條帶，其中M:分子量標(biāo)記， 泳道：1～22分別代表水稻品種7-1、7-2、8、10、13、13-1、13-2、14-1、14-2、14-3、35、36、38、1、15、HP11、HP25、HP26、HP27、HP41、HP63、HP85；其中，表1對(duì)聚丙烯酰胺電泳結(jié)果的多態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

表1聚丙烯酰胺電泳結(jié)果多態(tài)統(tǒng)計(jì)表

（3）序列比對(duì)分析

雙向測(cè)序的序列通過(guò)ContigExpres軟件進(jìn)行序列拼接，拼接序列結(jié)果：

1.HGS3F3R3圓粒樣品序列拼接：

TTCTCCACCGCGAGATCGGATTCCTCGAGCGTACTGTCTATATCACTACCATTCATACTCCTTCGATCTTGCTTCAAAACAAAAAAAGATATATTTCCTACTTCATATTCATATACACACGTACGGCTTGCTATCTGTCGAATTGTTTGCTTCTGCATGCATGCATCACTCTCATTGTAAGTTTTCCCCAGCTTAAAACCACTCCTTTGA

2.HGS3F7R7長(zhǎng)粒樣品序列拼接：

CTTGCAGTCTCTGGACGTTGGTTGGTTGTACGAGACGGTAGACAAAGGCGCGAGTTACTGAATGGACTCCTGACTGAGCTAGCATGGTGGGTACCTTGTGCCTTTGCACTTGAAGCAGGACCATTTTTCTCATCTACAGTCTTAGATACTGCCTGATTGTTCTCCTTTTTAGTGTCCACCAGATCTGAAAATCAAGCAAGTAAAAGAAAATGCTAAGGCAGATATCAATCAGTATCGATTTAGGAGGCATAGATCTTAGTGCTAATATGATAGCATTAGCAGTGAAGTACTTGCT；

3.HGS3R7R7圓粒樣品序列拼接：

TTGCAAGTACTGTCACTGCTAATGAACAAACACAACATATACAGTTAGGTTGCAGTGTCGTACTTTACTTAGGTTAATTTTAGAAGCTTTAAAAATGGTGCTAATTAAAACGGAGTAGTTTTACTCCTAATAGCACAGGAAATCAAGCCAATAAATAAATTATTGGAGGAAAAAAAAGCTGGGCATCACCATTTAAATTATTTTAATTATAAAGGCGAATATTGACAATTCCAAAACAGATGCTTTGAGCAG；

4.HGS3F10R10圓粒樣品序列拼接：

TCTACTGCGTCTTGGAGTCCGTGCTATAGCTGACTACAAATCTATAGCCCGCTGCTCTTCTCTCTCCTTATTTATCTCCTTAAAATATGTTTGCAGCTGGCTGATAGCCTGCTATTGTACCTGCTCTAAAAACAGTGCAGAGACTGTTCAAAAAGTCATTGCACAATAACTATTCACATGGAACTGTGAAAAGTATATATTGGAACTTAGGGCCTGTTTGG；

5.HGS3F15R15圓粒樣品序列拼接：

TCTGCACTGTGCTAATTGGTGTACACATTATGTGATCATCAGTCCAAGTTAATTATTACTTACAAAACTGAACTAATAAACACTAGAAAATATGTAACTTGCAAAGTACATATTGAATCAGGGATTCATATATAGAACTCCACCTGCAGATTTCTTCCAATATATATATGCTGTCACCATGTTTTCACTTGTCACCTAGTACACCTTTCCTTGATGATCGACGTGGTCA。

將拼接的序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information）美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心檢測(cè)，目的基因與已知基因比較其差異性結(jié)果，結(jié)果如表2-7所示：

表2 HGS3F3R3圓?；騁S3基因比對(duì)檢測(cè)結(jié)果

表3 HGS3F7R7圓?；騁S3基因比對(duì)檢測(cè)結(jié)果

表4 HGS3F10R10圓?；騁S3基因比對(duì)檢測(cè)結(jié)果

表5 HGS3F15R15圓?；騁S3基因比對(duì)檢測(cè)結(jié)果

表6 目的基因比對(duì)序列統(tǒng)計(jì)表

其中所有的圓粒水稻基因序列比對(duì)上的序列為同一個(gè)水稻品種ARC7291，是水稻粒長(zhǎng)GS3基因序列，由數(shù)據(jù)可知，試驗(yàn)中所測(cè)的目的序列與比對(duì)上的序列相似度可達(dá)98%以上，其同源關(guān)系可信度極高，可能為同一種基因；而HGS3F7R7長(zhǎng)粒的基因序列比對(duì)另一種粳稻高產(chǎn)的品種基因序列。

表7 HGS3F7R7長(zhǎng)粒與HGS3F7R7圓粒序列比對(duì)結(jié)果如下

如表7所示，Query為HGS3F7R7長(zhǎng)?；蛐蛄?，Sbjct為HGS3F7R7圓?；蛐蛄?，其中HGS3F7R7長(zhǎng)粒序列長(zhǎng)度為294bp,比對(duì)上了20bp；HGS3F7R7圓粒基因序列長(zhǎng)度為152bp,比對(duì)上21bp,所以HGS3F7R7長(zhǎng)?；蚝虷GS3F7R7圓?；蛴酗@著的差異性?？纱_認(rèn)的GS3功能基因的確切標(biāo)記。

一種水稻GS3功能基因分子標(biāo)記的檢測(cè)方法，包括步驟：根據(jù)上述分子標(biāo)記的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，以被檢測(cè)水稻基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，并判斷擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在該分子標(biāo)記；其中所述引物為上述的引物對(duì)。

本實(shí)施例提供了一種篩選大粒水稻的方法，利用本實(shí)施例提供的上述 23 個(gè)引物對(duì)之一進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增供體、受體及待檢水稻基因組 DNA，如果供體和受體水稻基因組 DNA 的擴(kuò)增產(chǎn)物存在易于識(shí)別、穩(wěn)定的多態(tài)性，該引物對(duì)即可用于檢測(cè)待檢水稻。如果均為大?；騁S3 供體帶型，說(shuō)明為純合大?；蛐?GS3GS3 ；如果既有供體帶型又有受體帶型，說(shuō)明為雜合基因型 GS3gs3 ；如果均為受體帶型，說(shuō)明為純合小?；蛐?gs3gs3。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 惠州學(xué)院，惠州市世紀(jì)五豐農(nóng)業(yè)科技股份有限公司

<120> 一種水稻GS3功能基因分子標(biāo)記及檢測(cè)方法

<130> 2016

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttctccaccg cgagatcgga ttcctcgagc gtactgtcta tatcactacc attcatactc 60

cttcgatctt gcttcaaaac aaaaaaagat atatttccta cttcatattc atatacacac 120

gtacggcttg ctatctgtcg aattgtttgc ttctgcatgc atgcatcact ctcattgtaa 180

gttttcccca gcttaaaacc actcctttga 210

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctccaccgcg agatcggatt 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaggagtggt tttaagctgg gg 22

<210> 4

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttgcaagtac tgtcactgct aatgaacaaa cacaacatat acagttaggt tgcagtgtcg 60

tactttactt aggttaattt tagaagcttt aaaaatggtg ctaattaaaa cggagtagtt 120

ttactcctaa tagcacagga aatcaagcca ataaataaat tattggagga aaaaaaagct 180

gggcatcacc atttaaatta ttttaattat aaaggcgaat attgacaatt ccaaaacaga 240

tgctttgagc ag 252

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctcaaagca tctgttttgg aattg 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcaagtact gtcactgcta atg 23

<210> 7

<211> 221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tctactgcgt cttggagtcc gtgctatagc tgactacaaa tctatagccc gctgctcttc 60

tctctcctta tttatctcct taaaatatgt ttgcagctgg ctgatagcct gctattgtac 120

ctgctctaaa aacagtgcag agactgttca aaaagtcatt gcacaataac tattcacatg 180

gaactgtgaa aagtatatat tggaacttag ggcctgtttg g 221

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctactgcgtc ttggagtccg 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccaaacaggc cctaagttcc a 21

<210> 10

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tctgcactgt gctaattggt gtacacatta tgtgatcatc agtccaagtt aattattact 60

tacaaaactg aactaataaa cactagaaaa tatgtaactt gcaaagtaca tattgaatca 120

gggattcata tatagaactc cacctgcaga tttcttccaa tatatatatg ctgtcaccat 180

gttttcactt gtcacctagt acacctttcc ttgatgatcg acgtggtca 229

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctgcactgtg ctaattggtg t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gaccacgtcg atcatcaagg a 21