本發(fā)明涉及一種亞硝酸鹽還原酶基因，尤其是一種Bacillus amyloliquefaciens H47亞硝酸鹽還原酶基因的克隆表達(dá)及應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

亞硝酸鹽可引發(fā)嬰兒高鐵血紅蛋白癥，嬰兒先天畸形，甲狀腺腫并與蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物二級(jí)胺反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物亞硝胺。水體及食品中亞硝酸鹽有限量標(biāo)準(zhǔn)。亞硝酸還原酶廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為NO或銨，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對(duì)生物體的毒害作用。

按照參與途徑和反應(yīng)產(chǎn)物的不同可將亞硝酸還原酶分為三類:(1)銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiRs)和細(xì)胞色素cd1型亞硝酸還原酶(cd1NiRs)分別由nirK和NirS編碼參與反硝化途徑，催化亞硝酸鹽降解為NO。(2)NirBD和NrfAH參與亞硝酸鹽異化途徑，催化亞硝酸鹽降解為銨。(3)NIT-6和NirA參與亞硝酸鹽同化途徑，催化亞硝酸鹽降解為銨。不同微生物中含有亞硝酸鹽還原酶的種類及種數(shù)不盡相同。本實(shí)驗(yàn)室從蜂蜜中分離得到一種解淀粉芽孢桿菌可降解亞硝酸鹽并測(cè)定其降解亞硝酸鹽產(chǎn)物為銨鹽。反硝化細(xì)菌中含有銅型亞硝酸還原酶(Cu-NiRs)或細(xì)胞色素cd1型亞硝酸還原酶(cd1NiRs)，已被廣泛研究。然而國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于解淀粉芽孢桿菌所含有的亞硝酸鹽還原酶的種類及性質(zhì)的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為研究解淀粉芽孢桿菌中亞硝酸鹽還原酶的種類及解淀粉芽孢桿菌降解亞硝酸鹽的機(jī)理。本發(fā)明通過(guò)對(duì)Bacillus amyloliquefaciens H47中亞硝酸鹽還原酶基因編碼基因在大腸桿菌中克隆表達(dá)及酶活性測(cè)定來(lái)研究該菌中含有亞硝酸鹽還原酶的種類及降解亞硝酸鹽的途徑，并通過(guò)親和層析純化出較高純度的亞硝酸鹽還原酶，為研究其酶學(xué)性質(zhì)，改良Bacillus amyloliquefaciens H47亞硝酸鹽降解率奠定基礎(chǔ)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種解淀粉芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶的基因，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并表達(dá)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的重組蛋白。

一種解淀粉芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶，由權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)。

含有上述解淀粉芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶基因的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒中含組氨酸標(biāo)簽。

所述基因編碼的蛋白質(zhì)及含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、基因工程菌、表達(dá)載體或克隆載體均屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

一種產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的重組大腸桿菌及其構(gòu)建、表達(dá)方法，包括如下步驟：

(1)以解淀粉芽孢桿菌亞硝酸鹽還原酶編碼基因?yàn)槟０?，進(jìn)行上下游引物的設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)為NdeI、BamHI；

(2)提取解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens H47的總基因DNA，以其為模版，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到2830bp的亞硝酸鹽還原酶的基因片段nirBD；

(3)利用NdeI、BamHI工具酶將擴(kuò)增片段和質(zhì)粒pColdⅡ于37℃下分別切成具有兩個(gè)粘性末端的片段；采用回收試劑盒回收以上兩個(gè)片段,并用T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pColdⅡ-NiRBD，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，通過(guò)氨芐抗生素平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化并測(cè)序驗(yàn)證；

(4)分別將陽(yáng)性克隆，加IPTG誘導(dǎo)的含有空質(zhì)粒的BL21組(陰性對(duì)照組)，不加IPTG誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的BL21組(陽(yáng)性對(duì)照組)接種到LB液體培養(yǎng)基中(含0.15g/L NaNO₂，50mg/L氨芐青霉素)于37℃條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4，隨后轉(zhuǎn)入15℃培養(yǎng)并加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)24h，轉(zhuǎn)速200rpm。4℃，8000rpm離心10min得發(fā)酵液上清，按照GB 5009.33—2010所述方法2——分光光度法(略微改動(dòng))對(duì)發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，并收集菌體。

(5)所述分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量的方法為：取3mL上清液加去離子水至28.5mL，加亞鐵腈化鉀(106g/L)0.75mL，乙酸鋅溶液(106g/L)0.75mL，混勻反應(yīng)30min。8000r/min離心10min。取2mL上清于25mL比色管中加2mL對(duì)氨基苯磺酸鈉溶液(4g/L)顛倒均勻反應(yīng)3min再加1mL鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L)，用去離子水定容至25mL，顛倒均勻，反應(yīng)15min，于波長(zhǎng)538nm處測(cè)吸光度。

所述Bacillus amyloliquefaciens H47是從蜂蜜中篩選出的，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地點(diǎn)武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC M 2013283，保藏日期2013年6月24日。

所述PCR引物為：

m1：5’-GCCGCATATGATGGGAAAAAAACAGCTAGTC-3’，(SEQ ID NO.3)

m2：5’-GCCGGGATCCTCAATACAGGATGTATACATTCTC-3’(SEQ ID NO.4)。

所述重組菌生產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的步驟為：利用IPTG對(duì)重組菌產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)后，超聲破碎菌體，利用Ni⁺柱親和層析法純化得到可溶性酯酶，咪唑洗脫濃度為500mM；所述誘導(dǎo)表達(dá)條件為將含重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)在37℃、200rpm條件下培養(yǎng)至OD600＝0.4，隨后轉(zhuǎn)入15℃培養(yǎng)至加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)24h，轉(zhuǎn)速200rpm；

酶活測(cè)定方法：以NaNO₂為底物，以甲基紫精為電子供體，2mL反應(yīng)體系包含50mM磷酸緩沖液1.6mL，甲基紫精(0.01％)100μL，酶液50μL，NaNO₂(1mM)50μL，NaHCO₃及低亞硫酸鈉溶液(0.8％)200μL，37℃反應(yīng)30min。劇烈震蕩終止反應(yīng)，加1mL對(duì)氨基苯磺酸鈉溶液(4g/L)顛倒均勻反應(yīng)3min再加0.5mL鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L)，顛倒均勻，反應(yīng)15min，以不加酶液組調(diào)零，于波長(zhǎng)538nm處測(cè)吸光度。

LB培養(yǎng)基成分為：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH7.2。

與其他技術(shù)相比，該發(fā)明的積極效果在于：

(1)本發(fā)明從Bacillus amyloliquefaciens H47中分離、純化了亞硝酸鹽還原酶基因。該基因包括兩個(gè)相鄰的開(kāi)放閱讀框。通過(guò)對(duì)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的含空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的大腸桿菌及不加IPTG誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的大腸桿菌粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析及親和層析技術(shù)來(lái)驗(yàn)證工程菌可以誘導(dǎo)表達(dá)NiRBD重組蛋白。

(2)本發(fā)明可以通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到大量的細(xì)胞內(nèi)NiRBD，可以應(yīng)用到工業(yè)中進(jìn)行大量生產(chǎn)。

(3)本發(fā)明利用親和層析作用純化得到純度較高的NiRBD重組蛋白，解決了從解淀粉芽孢桿菌中分離亞硝酸鹽還原酶和含量較高NiRBD的難題。

(4)本發(fā)明得到的工程菌表達(dá)純化的重組蛋白要添加電子供體才能有效地降解亞硝酸鹽。

(5)本發(fā)明為研究Bacillus amyloliquefaciens H47降解亞硝酸鹽的機(jī)制及調(diào)控提供了保障。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中利用Bacillus amyloliquefaciens H47基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定圖，其中1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖2為重組質(zhì)粒pColdII-NiRBD酶切驗(yàn)證圖。

圖3為Bacillus amyloliquefaciens H47亞硝酸鹽還原酶的大腸桿菌重組表達(dá)。

圖4為純化后NiRBD蛋白質(zhì)的SDS-PAGE電泳圖。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。

下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。

一般性說(shuō)明：實(shí)施例所涉及的酶均購(gòu)自TaKaRa公司，質(zhì)粒試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司，操作完全按照相應(yīng)說(shuō)明進(jìn)行。引物合成與質(zhì)粒測(cè)序由上海桑尼公司完成。

實(shí)施例1：Bacillus amyloliquefaciens H47亞硝酸鹽還原酶基因的克隆表達(dá)，步驟如下：

應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(TaKaRa公司)按照其操作提取Bacillus amyloliquefaciens H47菌體基因組總DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其質(zhì)量和純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。根據(jù)全基因測(cè)序設(shè)計(jì)上下游引物：m1(SEQ ID NO:3,5’-GCCGCATATGATGGGAAAAAAACAGCTAGTC-3’)與m2(SEQ ID NO:4,5’-GCCGGGATCCTCAATACAGGATGTATACATTCTC-3’)，應(yīng)用PCR方法，以上述Bacillus amyloliquefaciens H47基因組為模板，以上述m1和m2為特異性引物，擴(kuò)增Bacillus amyloliquefaciens H47亞硝酸鹽還原酶基因全長(zhǎng)編碼框序列。PCR反應(yīng)條件為：以基因組DNA為模板，在50μL反應(yīng)體系中，加入10×ExTaqBuffer 5μL、25mM MgCl₂ 2μL、2.5mM dNTP混合物4μL、20μM上下游引物各1μL、Ex Taq酶(Takara公司)1μL及DNA模板1μL、補(bǔ)水至50μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min，再進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延伸3min)，最后于72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖1所示，在2000與3000bp之間有明顯的DNA條帶，大小約為2800。用割膠回收試劑盒回收該DNA條帶，經(jīng)測(cè)序，結(jié)果如序列。

將割膠回收所得的NiRBD基因的DNA序列與商業(yè)化表達(dá)質(zhì)粒pColdII分別進(jìn)行NdeI、BamHI雙酶切，于37℃反應(yīng)1h，接著分別回收片段DNA和質(zhì)粒DNA。

將上述兩個(gè)片段進(jìn)行連接，在連接反應(yīng)體系中，于16℃下進(jìn)行連接14～16h，即獲得重組質(zhì)粒pColdⅡ-NiRBD，所述的連接體系為：回收酶切pColdII 2μL，回收目的基因片段6μL，T4DNA連接酶1μL，T4DNA連接酶緩沖液2μL，補(bǔ)水至20μL；

將20μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至100μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，然后混勻，冰浴30min，然后42℃熱激90s，再冰浴5min，加入880μL的LB培養(yǎng)基用于感受態(tài)細(xì)胞的復(fù)蘇。細(xì)胞培養(yǎng)液放置在37℃，200rpm的搖床中培養(yǎng)40min后，取75μL涂布于Amp抗性平板上，37℃培養(yǎng)8～12h后，對(duì)長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行驗(yàn)證，并進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證基因序列是否正確。

質(zhì)粒pColdⅡ-NiRBD用單酶切和雙酶切方法鑒定，鑒定結(jié)果如圖2所示，泳道1為雙酶切產(chǎn)物，泳道2為雙酶切產(chǎn)物。從圖中清楚可見(jiàn)重組質(zhì)粒經(jīng)單酶切后有一個(gè)條帶，且分子量與理論中重組質(zhì)粒大小7200bp吻合；重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后有兩條條帶，且一條約為4300bp，一條約為2800bp，說(shuō)明構(gòu)建好的載體經(jīng)酶NdeI、BamHI雙酶切成兩條片段，重組質(zhì)粒pColdⅡ-NiRBD構(gòu)建成功。

實(shí)施列2：Bacillus amyloliquefaciens H47亞硝酸鹽還原酶的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)，具體如下：

將實(shí)施例1所得的陽(yáng)性克隆菌接種于3mlLB液體培養(yǎng)基中(含50mg/L氨芐青霉素)于37℃，200rpm下過(guò)夜培養(yǎng)，然后以2％接種量接種到LB液體培養(yǎng)基中(含0.15g/L NaNO₂及50mg/L氨芐青霉素)于37℃條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4，隨后轉(zhuǎn)入15℃培養(yǎng)并加入終濃度為0.5mM的IPTG，誘導(dǎo)表達(dá)24h，轉(zhuǎn)速200rpm。4℃，8000rpm離心10min得發(fā)酵液上清按照GB 5009.33—2010所述方法2——分光光度法(略微改動(dòng))對(duì)發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定。并收集菌體。同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，一組為加IPTG誘導(dǎo)的含有空質(zhì)粒的BL21組(陰性對(duì)照組)，另一組為不加IPTG誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的BL21組(陽(yáng)性對(duì)照組)，按本實(shí)施例的誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的菌體發(fā)酵液進(jìn)行相同條件的操作，測(cè)定發(fā)酵液亞硝酸鹽含量結(jié)果如表1?？梢缘贸龊亟M質(zhì)粒的BL21組亞硝酸鹽還原酶基因成功進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并具有酶學(xué)活性。

表1

所述分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量的方法為：取3mL上清液加去離子水至28.5mL，加亞鐵腈化鉀(106g/L)0.75mL，乙酸鋅溶液(106g/L)0.75mL，混勻反應(yīng)30min。8000r/min離心10min。取2mL上清于25mL比色管中加2mL對(duì)氨基苯磺酸鈉溶液(4g/L)顛倒均勻反應(yīng)3min再加1mL鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L)，用去離子水定容至25mL，顛倒均勻，反應(yīng)15min，于波長(zhǎng)538nm處測(cè)吸光度。

LB培養(yǎng)基成分為：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化鈉(NaCl)10g/L，pH 7.2。

實(shí)施例3：重組菌中粗蛋白的提取，純化及酶活測(cè)定

將實(shí)施例2中所獲得的重組菌體及對(duì)照組菌體用無(wú)菌水洗滌兩次，按每100ml培養(yǎng)液加10ml，4℃預(yù)冷的0.02M的磷酸緩沖液(pH7.0)冰浴超生破碎5min，破碎后于4℃8000rpm離心5min，取其上清為NiR粗蛋白液，在相同濃度下進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，泳道1為加IPTG誘導(dǎo)的含空質(zhì)粒的BL21組粗酶液，泳道3為不加IPTG誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的BL21組粗酶液，泳道5為加IPTG誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的BL21組粗酶液，說(shuō)明基因工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后有兩條明顯的特異表達(dá)條帶，且條帶分子量與預(yù)期大小分子量一致。

利用Ni+柱親和層析法純化得到可溶性亞硝酸鹽還原酶，咪唑洗脫濃度為500mM。純化后的產(chǎn)物以亞硝酸鈉為底物，甲基紫精為電子供體測(cè)其酶活，重組蛋白檢測(cè)到活性，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)其純度，結(jié)果如圖4所示。泳道6為純化后蛋白，泳道7為不加IPTG誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21組菌體破壁后上清液，泳道8為加IPTG誘導(dǎo)的含有重組質(zhì)粒的BL21組菌體破壁后上清液。對(duì)照泳道6，7，8條帶說(shuō)明泳道6中箭頭所指的條帶為重組蛋白的兩個(gè)亞基。

酶活測(cè)定方法：以NaNO₂為底物，以甲基紫精為電子供體，2mL反應(yīng)體系包含50mM磷酸緩沖液1.6mL，甲基紫精(0.01％)100μL，酶液50μL，NaNO₂(1mM)50μL，NaHCO₃及低亞硫酸鈉溶液(0.8％)200μL，37℃反應(yīng)30min。劇烈震蕩終止反應(yīng)，加1mL對(duì)氨基苯磺酸鈉溶液(4g/L)顛倒均勻反應(yīng)3min再加0.5mL鹽酸萘乙二胺溶液(2g/L)，顛倒均勻，反應(yīng)15min，以不加酶液組調(diào)零，于波長(zhǎng)538nm處測(cè)吸光度。