本發(fā)明涉及一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白制備抗血清的方法及其應(yīng)用。一種檢測被尖吻蝮蛇咬傷抗血清的制備方法，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：尖吻蝮蛇又名俗稱五步蛇(Agkistrodonacutus)，屬于蝮亞科、蝮屬，是我國特有蛇種，為血循環(huán)型毒蛇，劇毒。該蛇分布于我國長江以南地區(qū)，包括中國臺灣，因蛇毒中含有多種出血毒素，被咬傷后傷口和內(nèi)臟出血，繼而壞死，被該蛇咬傷后如不及時治療，致死、致殘率極高。尖吻蝮蛇棲息地還有其他毒蛇，如江浙蝮蛇、眼鏡蛇、眼睛王蛇、蝰蛇、竹葉青、烙鐵頭、金環(huán)蛇和銀環(huán)蛇，被毒蛇咬傷有的患者有時不能夠確定是被哪種毒蛇咬傷，因此不能夠?qū)ΠY治療，耽誤了治療的寶貴時間。如果能夠生產(chǎn)一種抗血清，該抗血清中的抗體能夠與尖吻蝮蛇毒中的某種成分結(jié)合，與其他蛇毒成分都不結(jié)合，因此可以通過酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的方法確定是否為尖吻蝮蛇咬傷。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明公開了一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白制備抗血清的方法及應(yīng)用。本發(fā)明通過CM-SEphadexC50離子交換層析和制備凝膠電泳分離出尖吻蝮蛇毒中特異的蛋白質(zhì)，注射免疫小鼠制備抗血清，由于該蛋白質(zhì)僅僅存在于尖吻蝮蛇毒中，其他蛇毒如江浙蝮蛇毒、眼鏡蛇蛇毒、眼睛王蛇毒、蝰蛇毒、竹葉青蛇毒、烙鐵頭蛇毒、金環(huán)蛇毒和銀環(huán)蛇毒不含這種蛋白質(zhì)，取含蛇毒的傷口流出液進(jìn)行ELISA檢測就可以確定是否被尖吻蝮蛇咬傷，避免誤診。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白制備抗血清的方法，其特征在于包括以下步驟：a、用CM-SEphadexC50離子交換層析法初步純化尖吻蝮蛇毒特異蛋白，用0.2MNaCl的0.05MpH5.6HAc-NaAc洗脫獲得初步純化的尖吻蝮蛇毒特異蛋白；b、用12%PAGE制備凝膠電泳并用考馬斯亮藍(lán)染色，第二條帶為獲得的尖吻蝮蛇毒特異蛋白；c、將含有特異蛋白的聚丙烯酰胺凝膠磨細(xì)后直接免疫注射小鼠，共注射4次，每次間隔7天，第4次注射后3天斷頭取血，血液放置5-7小時后離心獲得抗血清。所述的一種利用尖吻蝮蛇毒特異蛋白制備抗血清的方法制得的抗血清。所述的抗血清在檢測判斷被尖吻蝮蛇咬傷上的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)效果體現(xiàn)在二個方面：1、鑒定方法簡單、結(jié)果準(zhǔn)確由于從尖吻蝮蛇毒中純化的蛋白質(zhì)是特異的，其他蛇毒不含這種蛋白質(zhì)，也沒有與此有親緣關(guān)系的蛋白質(zhì)，因此制備的抗血清中的抗體僅僅能夠與尖吻蝮蛇毒中的這個特異蛋白質(zhì)結(jié)合，與其他蛇毒不結(jié)合，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于檢測采用常規(guī)的酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）的方法,從傷口取少量液體（含毒液）通過常規(guī)ELISA檢測即可。2、鑒定費用很低需要的主要試劑為抗血清，據(jù)估算，一只小鼠產(chǎn)生的抗血清能夠滿足800次的檢測，因此檢測費用很低。具體實施方式一、特異性蛇毒蛋白的純化取1克皖南產(chǎn)尖吻蝮蛇毒，用15mL0.05MpH5.6HAc-NaAc緩沖液溶解，13000轉(zhuǎn)/分鐘離心去除不溶性雜質(zhì)，將蛇毒溶液上長60cm,直徑2cm的CM-SephandexC50離子交換層析柱，用3倍柱體積的0.05MpH5.6HAc-NaAc緩沖液充分洗脫未結(jié)合的酸性蛋白，然后用用1.5倍柱體積的含0.1MNaCl的0.05MpH5.6HAc-NaAc洗脫不需要的雜蛋白，然后用1.5倍柱體積的含0.2MNaCl的0.05MpH5.6HAc-NaAc洗脫，特異蛋白被洗脫下來。收集洗脫溶液，透析袋濃縮至5mL，然后對0.05MpH5.6HAc-NaAc緩沖液透析12小時去除多余的鹽，獲得初步純化的尖吻蝮蛇特異性蛋白，1mL/管分裝，-20℃冷凍備用。取1管蛇毒分離物進(jìn)行12%PAGE制備電泳（配制見表1，濃縮膠不插梳子），電泳后考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后獲得三條藍(lán)色蛋白質(zhì)條帶，第二條為特異性蛋白條帶，用手術(shù)刀片切下蛋白質(zhì)條帶，膠體含特異性蛋白，將膠條分成4份冷凍備用。表112%PAGE試劑分離膠(12%)36mL濃縮膠（5%）10mLddH2O11.886.830%丙烯酰胺14.41.71.5MTris-HCl（pH8.8）9.01.0MTris-HCl（pH6.8）1.2510%過硫酸胺0.360.1TEMED0.0150.01二、免疫小鼠并制備抗血清取1份含特異蛋白的膠體，加2mL生理鹽水，于研缽內(nèi)充分磨細(xì)，吸入到5mL規(guī)格的一次性注射器中，免疫注射18-22克規(guī)格的小鼠，每只小鼠0.5mL，第一次注射每只小鼠皮下注射0.25mL,腹腔注射0.25mL，第二、第三、第四間隔7天，均為腹腔注射，每只小鼠腹腔注射0.5mL，第四次注射后第3天斷頭取血，6小時后離心獲得抗血清，冷凍保存。三、抗血清特異性的篩選將常見的蛇毒江浙蝮蛇毒、眼鏡蛇蛇毒、眼睛王蛇毒、蝰蛇毒、竹葉青蛇毒、烙鐵頭蛇毒、金環(huán)蛇毒和銀環(huán)蛇毒8種蛇毒分別用包被液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6）配制成0.1%濃度溶液作為樣品抗原，進(jìn)行常規(guī)ELISA檢測，以沒有抗原的包被液作為陰性對照孔，0.1%濃度尖吻蝮蛇作為陽性對照孔，用制備的抗血清作為一抗（抗尖吻蝮蛇特異性蛋白），羊抗兔IgG-堿性磷酸酶為二抗，1mg/mL的p-NPP為底物，顯色45分鐘后在酶標(biāo)儀上測定OD405值，以陰性對照OD405值為標(biāo)準(zhǔn)，樣品值超過2.1倍陰性對照OD405值確定為陽性，否則為陰性。結(jié)果表明：8種蛇毒均顯色陰性結(jié)果，尖吻蝮蛇抗原顯色陽性結(jié)果，說明8種蛇毒都不含與尖吻蝮蛇毒特異蛋白相同或者抗原性相同的蛋白質(zhì)，制備的抗血清僅能夠與尖吻蝮蛇毒中的特異蛋白結(jié)合。四、模擬檢測實施例一：第一步：咬傷模擬用3公斤雄性實驗家兔模擬實驗，將腿部毛剃除，用1公斤重尖吻蝮蛇咬家兔腿部，傷口簡單沖洗；第二步：檢測樣品的獲得30分鐘后從傷口取約50uL血液，離心去除細(xì)胞等顆粒，加200uL包被液稀釋作為待測樣品溶液；第三步：ELISA檢測分別設(shè)二個陰性對照孔（包被液）、二個陽性對照孔（0.1%尖吻蝮蛇毒）、二個樣品孔。用制備的抗血清作為一抗（抗尖吻蝮蛇特異性蛋白），羊抗兔IgG-堿性磷酸酶為二抗，1mg/mL的p-NPP為底物，顯色45分鐘后在酶標(biāo)儀上測定OD405，平均值分別為，OD405陰性對照＝0.045;OD405陽性對照＝1.246；OD405樣品＝1.421；說明制備的抗血清能夠檢測被尖吻蝮蛇咬傷的動物。實施例二：第一步：咬傷模擬用2.8公斤雌性實驗家兔模擬實驗，將腿部毛剃除，用另一條1.1公斤重尖吻蝮蛇咬家兔腿部，傷口簡單沖洗；第二步：檢測樣品的獲得40分鐘后從傷口取約50uL血液，離心去除細(xì)胞等顆粒，加200uL包被液稀釋作為抗原溶液；第三步：ELISA檢測與“實施例一”第三步相同。顯色45分鐘后在酶標(biāo)儀上測定OD405平均值分別為，OD405陰性對照＝0.050;OD405陽性對照＝1.189；OD405樣品＝1.240；說明制備的抗血清能夠檢測被尖吻蝮蛇咬傷的動物。實施例三：第一步：咬傷模擬用2.9公斤雌性實驗家兔模擬實驗，將腿部毛剃除，用另一條0.9公斤重尖吻蝮蛇咬家兔腿部，傷口簡單沖洗；第二步：檢測樣品的獲得50分鐘后從傷口取約50uL血液，離心去除細(xì)胞等顆粒，加200uL包被液稀釋作為抗原溶液；第三步：ELISA檢測與“實施例一”第三步相同。顯色45分鐘后在酶標(biāo)儀上測定OD405平均值分別為，OD405陰性對照＝0.048;OD405陽性對照＝1.521；OD405樣品＝1.210；說明制備的抗血清能夠檢測被尖吻蝮蛇咬傷的動物。本發(fā)明三個實施例用不同重量家兔、不同重量的尖吻蝮蛇、不同時間取樣品獲得的檢測結(jié)果相似，說明該發(fā)明制備的抗血清能夠檢測尖吻蝮蛇咬傷，穩(wěn)定且可靠。當(dāng)前第1頁1 2 3