本發(fā)明涉及抗腫瘤免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種EB病毒特異性TCR及其重組慢病毒載體與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

EB病毒(epstein-barr virus,EBv)，是Epstein和Barr于1964年首次成功地將Burkitt非洲兒童淋巴瘤細(xì)胞通過(guò)體外懸浮培養(yǎng)而建株，并在建株細(xì)胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒，認(rèn)為該病毒是多種惡性腫瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人類(lèi)口咽部的上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。在中國(guó)南方鼻咽癌患病人群中大多都檢測(cè)到有EB病毒基因組存在。

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是中國(guó)南部常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。流行病學(xué)調(diào)查顯示，鼻咽癌可見(jiàn)于世界的許多國(guó)家和地區(qū)，但是大部分地區(qū)發(fā)病率較低，一般在1/10萬(wàn)以下。我過(guò)南部(廣東、廣西、福建、香港、湖南和江西)是世界鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，其發(fā)病率高達(dá)50/10萬(wàn)，其中以廣東省為最高。世界衛(wèi)生組織(WTO)于1991年提出將鼻咽癌分為：角化性鱗狀細(xì)胞癌、非角化性癌和未分化癌，其中非角化性癌在鼻咽癌高發(fā)區(qū)常見(jiàn)。

EB病毒與非角化性鼻咽癌密切相關(guān)。表現(xiàn)在：鼻咽癌患者活檢組織中可發(fā)現(xiàn)EB病毒DNA基因產(chǎn)物表達(dá)，特別是在非角質(zhì)化癌中EB病毒檢出率幾乎為100％，應(yīng)用原位雜交或多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，鼻咽癌患者的血清/血漿中科院定量檢測(cè)到游離的EBV DNA,EB病毒的DNA水平可預(yù)測(cè)鼻咽癌預(yù)后和生存率；在鼻咽癌血清/血漿中可檢測(cè)到較高滴度的EBV特異性抗體，尤其是EBV早期抗原(EA)和病毒衣殼抗原(VCA)的IgA抗體的陽(yáng)性率很高。EB病毒相關(guān)的腫瘤感染都處于潛伏期，EB病毒的潛伏感染分為3種類(lèi)型：I型感染表達(dá)EBNA1和EBERs，相關(guān)的惡性腫瘤是Burkitt’s淋巴瘤；II型感染表達(dá)EBNA1、LMP1、LMP2及Bam HI片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，見(jiàn)于非角化性NPC和何杰氏病(HD)；III型感染表達(dá)所有潛伏期基因，包括6種核抗原(EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C、EBNA-LP)，2種潛伏膜蛋白(LMP1、LMP2)和2種小核糖核酸(EBER1、EBER2)，見(jiàn)于傳染性單核細(xì)胞增多癥(IM)、PTLD及部分艾滋病(AIDS)相關(guān)淋巴瘤等。鼻咽癌中病毒以潛伏II型方式存在，表達(dá)EBNA1、LMP1、LMP2及Bam HI片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等病毒產(chǎn)物。EBNA1在維持病毒感染中具有重要作用，是唯一在EB病毒陽(yáng)性細(xì)胞中始終表達(dá)的抗原。EBNA1內(nèi)部存在甘氨酸-丙氨酸重復(fù)區(qū)域，其抑制蛋白酶體復(fù)合物對(duì)抗原的加工和MHC-I類(lèi)分子限制的抗原遞呈作用，從而逃避殺傷性T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。LMP1是明確的癌基因，有促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化及惡變的作用，參與了EB病毒致癌過(guò)程。LMP2基因編碼兩種蛋白：LMP2A和LMP2B，兩者僅N端第一個(gè)外顯子不同。BamHI的一段區(qū)域的這種轉(zhuǎn)錄在所有EB病毒陽(yáng)性的腫瘤中都存在，特別是NPC中。這段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物編碼至少三個(gè)多肽(BARF0，RPMS1和A73)，但是這些當(dāng)愛(ài)是否真的存在還沒(méi)有得到最終確證。

鼻咽癌患者針對(duì)EBNA、VCA、EA、MA及DNase均產(chǎn)生相應(yīng)的IgG和IgA抗體，體液免疫能阻止外源性病毒感染，卻不能消滅病毒的潛伏感染，研究這些抗體，對(duì)早期篩查和診斷鼻咽癌及監(jiān)測(cè)療效具有重要意義。應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)，并且結(jié)核VCA-IgA還可以提高診斷鼻咽癌的靈敏度。

鼻咽癌患者機(jī)體可以產(chǎn)生針對(duì)EB病毒的特異性CTL細(xì)胞應(yīng)答，CTL在清楚病毒、控制潛伏感染狀態(tài)的細(xì)胞、防止腫瘤發(fā)生中具有重要作用。EB病毒潛伏感染時(shí)免疫優(yōu)勢(shì)表位位于EBNA3家族，鼻咽癌中EBV處于II潛伏感染，主要表達(dá)弱免疫原性的EBNA1、LMP1、LMP2蛋白，而不表達(dá)EBNA3家族蛋白。EBNA1由于大量甘氨酸-丙氨酸重復(fù)序列，阻止HLA-I類(lèi)分子對(duì)其加工、處理和遞呈。LMP1是癌基因，具有獨(dú)立轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，而且在鼻咽癌病人中易發(fā)生突變，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力增強(qiáng)，并逃避體內(nèi)CTL的識(shí)別。故EBNA1和LMP1不合適作為鼻咽癌免疫治療的靶抗原。LMP2A本身不是轉(zhuǎn)化基因，無(wú)致癌性，在鼻咽癌腫瘤細(xì)胞能穩(wěn)定表達(dá)，LMP2A的大量HLA限制的T細(xì)胞表位已被鑒定出，且能誘導(dǎo)CTL發(fā)揮作用。因此，目前認(rèn)為L(zhǎng)MP2A是鼻咽癌免疫治療最理想的靶抗原。

鼻咽癌的傳統(tǒng)治療方式是手術(shù)結(jié)合放療及化療，這兩種治療手段特別是放療對(duì)鼻咽癌早期患者敏感，但中晚期鼻咽癌患者對(duì)放療及化療均不敏感，治療后復(fù)發(fā)率高。因此以EBV為靶點(diǎn)的細(xì)胞免疫治療為鼻咽癌的綜合治療提供了有力的手段。鼻咽癌(NPC)具備免疫治療的基本要素。第一，鼻咽癌細(xì)胞幾乎100％地感染EB病毒。其次，NPC細(xì)胞表面有正常表達(dá)HLAI類(lèi)分子以及CD54、CD70等表面標(biāo)識(shí)分子，并且可以通過(guò)HLAI累途徑將內(nèi)源性的抗原呈遞給CTL識(shí)別。第三，盡管EBV誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子表達(dá)，鼻咽癌微環(huán)境對(duì)CTL活性無(wú)明顯抑制作用。這些特點(diǎn)提示鼻咽癌是一種適合于免疫治療的腫瘤。2002年，香港林成龍用已知CTL識(shí)別的LMP2多肽(SSC、TYG、IED)負(fù)載自體的DC回輸治療晚期鼻咽癌患者，結(jié)果顯示，16例患者中有9例患者產(chǎn)生持續(xù)3個(gè)月的抗原表位特異性CTL反應(yīng)，其中2例有腫瘤的減小。2004年P(guān).Comoli報(bào)道用部分HLA匹配的健康攜帶者的EBV特異性CTL的過(guò)繼性免疫治療鼻咽癌。2005年straathof和P.Comoli分別報(bào)道了應(yīng)用自體EBV特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)一些晚期鼻咽癌患者進(jìn)行過(guò)繼性免疫治療。

腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞(CTL)即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，是從抗原呈遞細(xì)胞接受了抗原信息，并經(jīng)過(guò)克隆擴(kuò)增的可特異性識(shí)別和殺傷抗原特異性靶細(xì)胞的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，CTL是機(jī)體清除癌變細(xì)胞的主要機(jī)制，在抗腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮著主要作用。CTL不僅能通過(guò)顆粒酶和穿孔素等物質(zhì)直接殺死腫瘤細(xì)胞，還可以通過(guò)分泌一些細(xì)胞因子和IFN-γ和TNFα等間接地殺傷腫瘤細(xì)胞。隨著生物醫(yī)學(xué)，基因工程技術(shù)的發(fā)展，腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞治療近年來(lái)日益受到重視，顯示出良好的應(yīng)用前景，多種特異性CTL誘導(dǎo)培養(yǎng)方案應(yīng)運(yùn)而生。早在2000年日本用過(guò)繼性T淋巴細(xì)胞移植治療肝癌獲得了很好的療效，復(fù)發(fā)率降低，生存率提高，研究發(fā)表在醫(yī)學(xué)權(quán)威雜志《柳葉刀》上；2004年，Rosenburg教授研究的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL，特異性CTL的一類(lèi))在治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤上獲得了良好的結(jié)果。腫瘤特異性CTL治療腫瘤疾病具有安全，靶向，高效的特點(diǎn)。這主要是由T淋巴細(xì)胞表面特異性識(shí)別腫瘤抗原的T細(xì)胞受體(T Cell Receptor,TCR)決定的。然而機(jī)體內(nèi)針對(duì)各種抗原的TCR千差萬(wàn)別，2014年《科學(xué)》雜志發(fā)表Rosenberg教授的文章，利用TCR免疫組庫(kù)深度測(cè)序技術(shù)從轉(zhuǎn)移性膽管上皮細(xì)胞癌患者的腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞群中，篩選并得到了腫瘤抗原特異性的TCR序列，根據(jù)序列合成了TCR的DNA，并通過(guò)基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)導(dǎo)在患者自體T細(xì)胞表面，獲得了良好的治療效果。

T細(xì)胞受體(TCR)是細(xì)胞表面受體，參與T細(xì)胞的活化以響應(yīng)抗原的呈現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，TCR由α和β兩條鏈(其裝配以形成異源二聚體)注冊(cè)，并且與CD3轉(zhuǎn)導(dǎo)亞基相連以在細(xì)胞表面上呈現(xiàn)形成T-細(xì)胞受體復(fù)合物。TCR的每條α和β鏈由免疫球蛋白樣N-端可變(V)和恒定(C)區(qū)、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和短的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域組成。關(guān)于免疫球蛋白分子，α和β鏈的可變區(qū)由V(D)J重組產(chǎn)生，在T細(xì)胞群中產(chǎn)生抗原特異性的大量多樣性。然而，同識(shí)別完整抗原的免疫球蛋白相比，T細(xì)胞被與MHC分子相關(guān)的經(jīng)處理肽片段活化，通過(guò)T細(xì)胞將另外的特征引入至抗原識(shí)別，被稱為MHC限制性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：為了解決上述背景技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供一種改進(jìn)的EB病毒特異性TCR及其重組慢病毒載體，利用慢病毒載體將其轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中，獲得表達(dá)針對(duì)EB病毒特異TCR的T細(xì)胞。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是：一種EB病毒特異性TCR，包括α鏈和β鏈，所述的α鏈的序列如下：

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一種EB病毒特異性TCR重組慢病毒載體的應(yīng)用，分別釆取HLA-A2陽(yáng)性和陰性的健康人的PBMC,以lxl0⁶/ml的密度接種到24孔板,加入600lU/mlIL-2、50ng/mlanti-CD3(OKT-3)的含10％人AB血清AIM-V培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3d。Jurkat細(xì)胞按Ixl0⁶細(xì)胞/ml混于上述慢病毒上清液放于24孔板中,在32℃以l000g速度離心90min,4h后,用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37℃孵育過(guò)夜。兩種細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)均為0,15～0.5,重復(fù)感染2次，孵育48～72h后用上流式機(jī)檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的一種EB病毒特異性TCR及其重組慢病毒載體與應(yīng)用篩選出EB病毒抗原特異的TCR，利用慢病毒載體將其轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中，獲得表達(dá)針對(duì)EB病毒特異TCR的T細(xì)胞。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

圖1是本發(fā)明中pLenti-C-mGFP空載體的示意圖。

圖2是本發(fā)明中TCRα和β鏈重組載體示意圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)在結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。這些附圖均為簡(jiǎn)化的示意圖，僅以示意方式說(shuō)明本發(fā)明的基本結(jié)構(gòu)，因此其僅顯示與本發(fā)明有關(guān)的構(gòu)成。

圖1和圖2所示的一種EB病毒特異性TCR，包括α鏈和β鏈，所述的α鏈的序列如下：

atgtaggacgcccctccggtcacggcatttctgatagtgcatcgacgtgactcacccgccgacacaggaagagggtggagaaccgtctcgggttccaatggctttttcctagtgttttgagggaaagaaacaatctatatatatactcttctaggcgggcgcccccttcccctcaaactcttttttttcctcctctgccaagctttgtttgttgagaaaaaacaaaaaattcgctcctggtaactctctttccgcctccaggggagtccccaacccggaaaaaacccccccccccccccccccaagtttttttaatctaggtaggcccgcggttggaaaactccccccccccccccccctgaagcctcacacagcccagtaactttgctagtacctcttgagtgcaaggtggagaattaagatctggatttgagacggagcacggaacatttcactcaggggaagagctatgaacatgctgactgccagcctgttgagggcagtcatagcctccatctgtgttgtatccagcatggctcagaaggtaactcaagcgcagactgaaatttctgtggtggagaaggaggatgtgaccttggactgtgtgtatgaaacccgtgatactacttattacttattctggtacaagcaaccaccaagtggagaattggttttccttattcgtcggaactcttttgatgagcaaaatgaaataagtggtcggtattcttggaacttccagaaggatcgctgaagacagaaagtccagtaccttgatcctgcaccgtgctaccttgagagatgctgctgtgtactactgttcagccggtggtgctacaaacaagctcatctttggaactggcactctgcttgctgtccagccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc，所述的β鏈的序列如下：

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一種EB病毒特異性TCR重組慢病毒載體的應(yīng)用，分別釆取HLA-A2陽(yáng)性和陰性的健康人的PBMC,以lxl0⁶/ml的密度接種到24孔板,加入600lU/mlIL-2、50ng/mlanti-CD3(OKT-3)的含10％人AB血清AIM-V培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3d。Jurkat細(xì)胞按Ixl0⁶細(xì)胞/ml混于上述慢病毒上清液放于24孔板中,在32℃以l000g速度離心90min,4h后,用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，37℃孵育過(guò)夜。兩種細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)均為0,15～0.5,重復(fù)感染2次，孵育48～72h后用上流式機(jī)檢測(cè)。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明的一種EB病毒特異性TCR及其重組慢病毒載體與應(yīng)用篩選出EB病毒抗原特異的TCR，利用慢病毒載體將其轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中，獲得表達(dá)針對(duì)EB病毒特異TCR的T細(xì)胞。

在正常的T細(xì)胞中，T細(xì)胞受體從由不成熟的胸腺細(xì)胞表達(dá)的前-T細(xì)胞受體(pTCR)放出，并且對(duì)于從雙陰性(CD4-CD8-)至雙陽(yáng)性(CD4+CD8+)階段的T細(xì)胞發(fā)展是至關(guān)重要的。在TCRβ基因座成功地有效重排的前T細(xì)胞表達(dá)功能性TCRβ鏈，該TCRβ鏈與不變的前Tα鏈和CD3信號(hào)組件配對(duì)以形成前TCR復(fù)合物。

T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor，TCR)是所有T細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，在T細(xì)胞抗原識(shí)別中起關(guān)鍵作用。TCR是由α、β兩條肽鏈構(gòu)成的異二聚體，每條肽鏈又可分為可變區(qū)(V區(qū))，恒定區(qū)(C區(qū))，跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)等幾部分；其胞質(zhì)區(qū)很短，信號(hào)傳遞主要通過(guò)與其以非共價(jià)鍵結(jié)合的aD3分子進(jìn)行。TaR分子屬于免疫球蛋白超家族，其抗原特異性存在于V區(qū)；V區(qū)(Vα、Vβ)又各有三個(gè)高變區(qū)aDRl、aDR2、aDR3，其中以aDR3變異最大，直接決定了TCR的抗原結(jié)合特異性。在TCR識(shí)別MHC-抗原肽復(fù)合體時(shí)，CDRl、CDR2識(shí)別和結(jié)合MHC分子抗原結(jié)合槽的側(cè)壁，而CDR3直接與抗原肽相結(jié)合。

根據(jù)TCR Vα、Vβ基因的同源性，可將80多個(gè)TCR Vα基因分為32個(gè)家族、60多個(gè)TCR Vβ基因分為24個(gè)家族。利用每個(gè)T細(xì)胞克隆均有其獨(dú)特CDR3序列的特點(diǎn)，采用CDR3譜型分析技術(shù)，可測(cè)定各TCR家族各CDR3出現(xiàn)的頻率，由此反映T細(xì)胞的克隆性。未接受抗原刺激的T細(xì)胞中，針對(duì)各種抗原的T細(xì)胞克隆分布均勻，表現(xiàn)為多家族和多克隆性，具體地，表現(xiàn)為各家族均出現(xiàn)呈高斯分布的約8個(gè)CDR3峰；抗原刺激則引起識(shí)別該抗原的某一個(gè)或幾個(gè)特異TCR家族T細(xì)胞反應(yīng)性增生，表現(xiàn)為該家族CDR3成員出現(xiàn)少于4個(gè)峰的寡克隆或單克隆分布，其中具有單克隆CDR3分布(表現(xiàn)為單峰)的TCR家族即是抗原特異單克隆增生的TCR家族。對(duì)該家族PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，可獲得抗原特異TCR CDR3序列。

1.5 EBV表位特異性CD8+T細(xì)胞的獲得

1.5.1 Ficoll-Paque梯度離心法分離鼻咽癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)

1.5.1.1將淋巴細(xì)胞分離液按1:1比例加入到離心管中,離心1500rpm,10min,去上層血清。

1.5.1.2按照血細(xì)胞:PBS＝1:3的比例,將用PBS稀釋后的血細(xì)胞溶液緩慢加入到裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,離心2500rpm,25min。

1.5.1.3離心后管內(nèi)分為4層,最上層為血衆(zhòng),最下層為紅細(xì)胞,其上有一薄層粒細(xì)胞,中間為淋巴細(xì)胞分離液,血裝與分離液之間有一層白膜層即為單個(gè)核細(xì)胞,單個(gè)核細(xì)胞包括單核細(xì)胞和T/B淋巴細(xì)胞。用玻璃吸管吸出白膜層液體至10ml離心管中,加PBS至10ml,離心2000rpm,10min。

1.5.1.4棄上清,加PBS至10ml,吹打混勾,用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),離心1500rpm,10min。

1.5.1.5棄上清后,加含10％FBS的RPMI-1640重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至lxl0⁷/ml備用。

1.5.2特異性CD8+T細(xì)胞的誘導(dǎo)擴(kuò)增

用LMP2A_356-364(多肽序列：FLYALALLL)抗原多肽誘導(dǎo)患者的PBMC,以使特異性的CD8+T細(xì)胞增殖達(dá)到一定的量,足夠用于下一步的實(shí)驗(yàn)所需要的細(xì)胞數(shù)量。將新鮮分離的PBMC按5X10⁹/L懸于AIM-V培養(yǎng)基中,加入抗原肽孵育6h,然后于各孔中加入含80ml/L人類(lèi)AB血清的RPMI 1640培養(yǎng)液,并添加細(xì)胞因子IL-2 40U/mK IL-7 20U/ml以及抗CD28抗體2mg/L。每隔7d半量換液。隔周取少量細(xì)胞進(jìn)行Pentamer染色后用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)特異性CD8+T細(xì)胞頻率,其余細(xì)胞半量換液,繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5,3 MACS磁珠和流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)分選特異性CD8+T細(xì)胞。

應(yīng)用MACS磁珠分選試劑盒富集出CD8+T細(xì)胞,用突光標(biāo)記的抗CD3抗體、抗CD8抗體和Pentamer染色,用FCM分選出CD3+CD8+pentamer+T細(xì)胞,染色步驟如下：

1.5.3.1在預(yù)冷的離心機(jī)離心,轉(zhuǎn)速14000g,時(shí)間為5-10min。(保持試劑在冰上避光)。

1.5.3.2每次染色以1X10⁶～2X10⁶細(xì)胞為準(zhǔn)。

1.5.3.3用2ml Wash buffer(0.1％sodium azide,0.1％BSA的PBS)清洗細(xì)胞后,以500g的轉(zhuǎn)速離心5min,棄上清,用殘余液重懸(<50μl)。始終保持預(yù)冷狀態(tài)。

1.5.3.4每次加入10ul pentamer來(lái)標(biāo)記細(xì)胞,用吸管混勾。

1.5.3.5室溫避光孵育10min。

1.5.3.6同步驟1.5.3.3.

1.5.3.7加入適量抗CD8抗體,抗CD3抗體,用吸管混勻。

1.5.3.8冰上避光孵育20min。

1.5.3.9清洗細(xì)胞兩次,步驟同步驟1.5.3.3,混勻每個(gè)管。

1.5.3.10加入200μl固定液。上機(jī)檢測(cè)。(固定液可使細(xì)胞不聚團(tuán),上機(jī)前將樣品可放于冰箱避光。固定后細(xì)胞形態(tài)變化,故在進(jìn)行上機(jī)分析前離開(kāi)樣品3h是合理的。樣品最多可以保存2天)。

而后繼續(xù)用抗原多肽誘導(dǎo)其余的PBMC以使特異性CD8+T細(xì)胞增殖。將CD3+CD8+Pentamers+T細(xì)胞分選到96孔U型培養(yǎng)板中培養(yǎng),分選前用抗CD3抗體(1mg/L)包被96孔U型培養(yǎng)板過(guò)夜。細(xì)胞分選的細(xì)胞數(shù)分別為每孔1、5、20、100、500、1000個(gè)CD3+CD8+Pentamers+T細(xì)胞,分選后于每孔中加入150ul含100ml/L胎牛血清(FBS)的GIBECO RPMI 1640培養(yǎng)液,添加細(xì)胞因子IL-2 1000U/ml,抗CD28抗體200μg/L,培養(yǎng)10-14d。

1.7CDNA5'末端快速擴(kuò)增(5'RACE)TCR基因雙鏈及分析

1.7.15'RACE cDNA的制備

1.7.1.1準(zhǔn)備好如下緩沖液混合物,2μl 5X First-Strand buffer,1.0μl DTT,1.0μl dNTPMix,共4μl,混合好后簡(jiǎn)要離心一下,室溫放置。

1.7.1.2把步驟1.6獲得的RNA2.75μl及1.0μl 5'-CDS引物A加入到200μl離心管中,充分混勻并瞬時(shí)離心。

1.7.1.3 72℃孵育離心管3min,然后42℃冷卻2min,4℃放置。冷卻后,14000g離心10s,收集混合物到管底。

1.7.1.4準(zhǔn)備好如下主要混合液,室溫下按順序混合以下試劑:4.0μl步驟1的混合物緩沖液,0.25μl RNA酶抑制劑(40U/μl)、1.0μlSMARTScibe逆轉(zhuǎn)錄酶共5.25μl。

1.7.1.5把上述5.25μl主混合物與第五步的變性RNA及SMARTer IIA引物lμl混在一起構(gòu)成10μl體系；

1.7.1.6輕吹混勾體系,瞬時(shí)離心使試劑富集管底；

1.7.1.7 42℃孵育90min；70℃加熱10分鐘；用Tricine-EDTA稀釋產(chǎn)物,總RNA<200ng,則加20μl,否則,加100μl；保存產(chǎn)物于-20℃。獲得的cDNA 5'端均含有片段UMP(CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAG-TGGTATCAACGCAGAGT),可作為下一步實(shí)驗(yàn)的引物。

1.7.2用5'RACE獲得TCR分子α鏈和β鏈的可變區(qū)基因

應(yīng)用UMP(CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT)作為上游外引物,及其上游內(nèi)引物NUP(AAGCAGTGGTATCAACGC-AGAGT,取自UMP上),而α、β鏈上則采取αdown3、αdown4和βdown4、βdown4作為下游內(nèi)外引物。應(yīng)用5μl 1.6獲得的cDNA為模板,應(yīng)用SMARTer II A試劑盒的反應(yīng)液(含有TAP酶、dNTP等,具體不詳),構(gòu)成5μl反應(yīng)體系。第一輪PCR反應(yīng)引物為上述的外引物,條件為:94℃5min；94℃30s,72℃3min 5個(gè)循環(huán)；94℃30s,70℃30s,72℃3min5個(gè)循環(huán)；94℃30s,66℃30s,72℃3min 27循環(huán)；72℃5min,68℃5min,4℃保存。

1.8將獲得的α鏈和β鏈全長(zhǎng)基因連入pLenti-C-mGFP載體，應(yīng)用Xho Ⅰ內(nèi)切酶把1.10獲得TCR Vβ鏈從T-easy載體上切下,用Sal Ⅰ酶將pLenti-C-mGFP載體(如圖2)上的Sal Ⅰ限制位點(diǎn)切開(kāi),酶切產(chǎn)物電泳后按1.9.1的方法膠回收目的條帶,然后進(jìn)行去磷酸化反應(yīng),將反應(yīng)液放入37℃溫箱30min,然后置65℃水浴30min,加熱滅活。

實(shí)施例：重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)TCR在細(xì)胞表面的表達(dá)

分別釆取HLA-A2陽(yáng)性和陰性的健康人的PBMC,以lxl0⁶/ml的密度接種到24孔板,加入600lU/ml IL-2、50ng/ml anti-CD3(OKT-3)的含10％人AB血清AIM-V培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3d。Jurkat細(xì)胞按Ixl0⁶細(xì)胞/ml混于上述慢病毒上清液放于24孔板中,在32℃以l000g速度離心90min,4h后,用新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,37℃孵育過(guò)夜。兩種細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)均為0,15～0.5,重復(fù)感染2次。孵育48～72h后用上流式機(jī)檢測(cè)。應(yīng)用CD3-percp,CD8-FITC/CD8-APC,HLA-A201-LMP2A_356-364pentamer-PE,anti-vpl3TCR-PE,染色,上機(jī)檢測(cè)驗(yàn)證重組TCR分子的表達(dá)情況。pentamer染色步驟同1.5.3所示方法,對(duì)于不染pentamer的抗體染色步驟具體如下:

1.13.3.1準(zhǔn)備1xPBS(無(wú)需孵育),流式管,所染抗體。

1.13.3.2將所需染色的足量細(xì)胞加入流式管中,再加入ImlPBS,短暫震蕩后,以1500rpm,離心5min。

1.13.3.3離心后迅速棄去上清,加入適量抗體(anti-vβl3.1TCR-PE 10μl/test,CD3-Percp 5μl/test,CD8-FITC/CD8-APC 5μl/test),短暫震蕩后,室溫避光20min。

1.13.3.4加入1ml 1xPBS,短暫震蕩,1500rpm,5min離心。重復(fù)一次。

1.13.3.5加入200μl固定液1％的多聚甲酸,震蕩,上機(jī)檢測(cè)。

以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過(guò)上述的說(shuō)明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù)性范圍并不局限于說(shuō)明書(shū)上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來(lái)確定其技術(shù)性范圍。

α鏈的序列如下：

atgtaggacgcccctccggtcacggcatttctgatagtgcatcgacgtgactcacccgccgacacaggaagagggtggagaaccgtctcgggttccaatggctttttcctagtgttttgagggaaagaaacaatctatatatatactcttctaggcgggcgcccccttcccctcaaactcttttttttcctcctctgccaagctttgtttgttgagaaaaaacaaaaaattcgctcctggtaactctctttccgcctccaggggagtccccaacccggaaaaaacccccccccccccccccccaagtttttttaatctaggtaggcccgcggttggaaaactccccccccccccccccctgaagcctcacacagcccagtaactttgctagtacctcttgagtgcaaggtggagaattaagatctggatttgagacggagcacggaacatttcactcaggggaagagctatgaacatgctgactgccagcctgttgagggcagtcatagcctccatctgtgttgtatccagcatggctcagaaggtaactcaagcgcagactgaaatttctgtggtggagaaggaggatgtgaccttggactgtgtgtatgaaacccgtgatactacttattacttattctggtacaagcaaccaccaagtggagaattggttttccttattcgtcggaactcttttgatgagcaaaatgaaataagtggtcggtattcttggaacttccagaaggatcgctgaagacagaaagtccagtaccttgatcctgcaccgtgctaccttgagagatgctgctgtgtactactgttcagccggtggtgctacaaacaagctcatctttggaactggcactctgcttgctgtccagccaaatatccagaaccctgaccctgccgtgtaccagctgagagactctaaatccagtgacaagtctgtctgcctattcaccgattttgattctcaaacaaatgtgtcacaaagtaaggattctgatgtgtatatcacagacaaaactgtgctagacatgaggtctatggacttcaagagcaacagtgctgtggcctggagcaacaaatctgactttgcatgtgcaaacgccttcaacaacagcattattccagaagacaccttcttccccagcccagaaagttcctgtgatgtcaagctggtcgagaaaagctttgaaacagatacgaacctaaactttcaaaacctgtcagtgattgggttccgaatcctcctcctgaaagtggccgggtttaatctgctcatgacgctgcggctgtggtccagc

β鏈的序列如下：

ccatcctgccctgaccctgccatgggcaccaggctcctcttctgggtggccttctgtctcctgggggcagatcacacaggagctggagtctcccagtcccccagtaacaaggtcacagagaagggaaaggatgtagagctcaggtgtgatccaatttcaggtcatactgccctttactggtaccgacagagcctggggcagggcctggagtttttaatttacttccaaggcaacagtgcaccagacaaatcagggctgcccagtgatcgcttctctgcagagaggactgggggatccgtctccactctgaccctacacgccctgcagcCAGAAGACTCAGCCCTGTATCTCTGCGCCAGCAGCCAAGACTGGACACCTAATGAGCAGTTCTTCGGGCCAGGGACACGGCTCACCGTGCTAGAGGACCtgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtatgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgcatggccatggtcaagagaaaggattccagaggctagctccaaaaccatcccaggtcattcttcatcctcacccaggattctcctgtacctgctcccaatctgtgttcctaaaagtgattctcactctgcttcatctcctacttacatgaatacttctctcttttttctgtttccctgaagattgagctcccaacccccaagtacgaaataggctaaaccaataaaaaaatggtgtgtt