本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種小麥基因，特別是涉及一種小麥葉片葉綠素降解過(guò)程的關(guān)鍵酶基因。本發(fā)明還涉及所述基因的克隆及其編碼蛋白。

背景技術(shù)：

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物。小麥籽粒產(chǎn)量的2/3來(lái)源于花后合成的同化產(chǎn)物，小麥旗葉的衰老與籽粒形成和灌漿成熟同步進(jìn)行，旗葉過(guò)早衰老將嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量，推遲旗葉衰老的發(fā)生、延緩其衰老進(jìn)程，則可以顯著提高小麥產(chǎn)量并改善籽粒品質(zhì)。據(jù)理論推算，在作物成熟期，延長(zhǎng)功能葉片壽命一天，產(chǎn)量可增加2%左右。因此，延緩灌漿期小麥葉片衰老(持綠)是提高小麥產(chǎn)量、改善籽粒品質(zhì)的重要途徑之一。葉綠素降解是葉片衰老的主要標(biāo)志，是在一系列酶的催化下完成的。通過(guò)基因工程手段調(diào)控葉綠素降解過(guò)程關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，對(duì)于揭示小麥衰老機(jī)制和延緩衰老進(jìn)程都具有十分重要的意義。

植物葉綠素a (Chlorophyll a，Chl a)的降解存在兩條途徑：一是Chl a在葉綠素酶(Chlase，CLH)的催化下先脫植基，生成脫植基葉綠素a (Chlorophyllide，Chlide a)，再在脫鎂螯合物(Metal cheating substance，MCS)作用下去除鎂離子，生成脫鎂葉綠酸a (Pheophorbide a，Pheide a)；二是Chl a先在MCS作用下脫除鎂離子生成脫鎂葉綠素a (Pheophytin a，Phein a)，再在脫鎂葉綠酸水解酶(PPH)作用下脫植基，生成Pheide a。

目前對(duì)于植物葉綠素的降解究竟是先脫植基還是先脫鎂離子仍然存在爭(zhēng)議。具體表現(xiàn)為：1、CLH依舊參與乙烯誘導(dǎo)的果實(shí)成熟時(shí)葉綠素降解(Shemer T. A, et al. 2008)。2、自然成熟的柑桔中CLH1的表達(dá)與品種有關(guān)。Jacob-Wilk等發(fā)現(xiàn)，柑桔(Citrus sinensiscv.Valencia)在自然成熟時(shí)CLH1為低水平組成型表達(dá)，而Distefano等發(fā)現(xiàn)，卡萊門汀柑桔“Comune”的CLH1表達(dá)在桔皮變黃時(shí)瞬時(shí)增加，隨后降低，但“Tardivo”CLH1則始終為低水平表達(dá)，因此有必要驗(yàn)證這2種柑桔成熟過(guò)程中PPH的作用。3、在有些植物品種中依舊不能排除CLH的功能，如在西葫蘆和煙草葉片中異源過(guò)表達(dá)CLH，可以促進(jìn)這些葉片中葉綠素的降解(Harpaz-Saad S., et al. 2007)。4、即使是同一植物品種，不同研究者的結(jié)論也不一致。如Büchert等在評(píng)價(jià)青花菜衰老組織中CLH和PPH的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，CLH的表達(dá)與典型的衰老相關(guān)基因表達(dá)沒(méi)有關(guān)聯(lián)，兩個(gè)葉綠素酶同功酶BoCLH1和BoCLH2中的一個(gè)在衰老時(shí)表達(dá)水平下降，激素處理對(duì)BoCLH基因表達(dá)的影響與觀察到的葉綠素含量不相匹配；而PPH的表達(dá)與之相反，在誘導(dǎo)衰老的前3天增加，此后保持低水平；采后保綠處理大多抑制了PPH的表達(dá)，延遲了葉綠素的降解。這些結(jié)果支持了葉綠素降解過(guò)程中的脫植基反應(yīng)由PPH負(fù)責(zé)。與Büchert的結(jié)論相反，Chen等在含有反義葉綠素酶基因BoCLH1的轉(zhuǎn)基因青花菜中發(fā)現(xiàn)采后葉綠素的降解被延遲，說(shuō)明BoCLH在采后葉綠素降解中起關(guān)鍵作用。5、葉綠素降解的2條途徑(即由脫鎂葉綠素到脫鎂葉綠酸和由脫植基葉綠素到脫鎂葉綠酸)都存在，如Cabbage(Heaton J.W., et al, 1996)、柑橘和荷蘭芹(Amir-Shapira D., et al, 1987)。盡管存在上述爭(zhēng)議，現(xiàn)有證據(jù)表明至少在水稻和擬南芥葉片衰老時(shí)，CLH可能是不活躍的。歐洲油菜的葉綠素降解也被認(rèn)為是從脫鎂開始的(Langmeier M., et al, 1993)。

小麥葉片葉綠素降解會(huì)導(dǎo)致其光合能力下降，進(jìn)而影響小麥植株的生長(zhǎng)和發(fā)育，最終導(dǎo)致產(chǎn)量下降。因此，研究小麥葉片衰老過(guò)程中葉綠素降解機(jī)制，對(duì)于利用基因工程手段選育持綠性小麥品種具有重要意義。鑒于此，從小麥葉片中克隆脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因(Pheophytin Pheophorbide Hydrolase，TaPPH)，并進(jìn)行功能研究，將有助于揭示小麥葉片衰老過(guò)程中葉綠素的降解機(jī)制，為利用生物工程手段選育持綠性小麥品種提供基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因TaPPH，以及由所述基因編碼的蛋白TaPPH。

本發(fā)明所述的小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因TaPPH，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，基因cDNA全長(zhǎng)2490bp，包括1032bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，698bp的5’非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)和760bp的3’UTR。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因TaPPH編碼的蛋白TaPPH，其氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，所述蛋白由343個(gè)氨基酸組成，分子量約為38.65kDa。TaPPH具有PPH蛋白擁有的保守結(jié)構(gòu)域：酯酶-脂肪酶超家族結(jié)構(gòu)域和α/β水解酶催化結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明中，編碼所述蛋白TaPPH的基因，其核苷酸序列包括但不限于SEQ ID No.2所示的序列，還可以是經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的編碼蛋白TaPPH的其他核苷酸序列。

本發(fā)明提供的小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因TaPPH是通過(guò)電子克隆結(jié)合常規(guī)PCR方法獲得的。根據(jù)NCBI上公布的擬南芥AtPPH基因序列(GenBank注冊(cè)號(hào)：NM_121383)作為查詢序列，檢索小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)，將所有匹配片段進(jìn)行組裝，挑選含有較長(zhǎng)ORFs的contig作為候選目的片段。以此候選片段為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)數(shù)對(duì)引物，分別對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的小麥葉片cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段。根據(jù)上述分離得到的TaPPH基因中間片段設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行RACE PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一些條帶，分別切膠回收。將回收得到的DNA純化后連接pEasy-T5 Zero克隆載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，分別測(cè)序。將測(cè)序得到的序列與中間片段進(jìn)行序列比對(duì)，初步確定目的基因的5’端及3’端片段。將所獲得的中間片段、5’端片段和3’端片段通過(guò)軟件ContigExpress拼接，最終獲得了核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的小麥TaPPH基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

本發(fā)明所述小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因TaPPH能夠應(yīng)用在小麥品種的改良中。

進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因TaPPH能夠應(yīng)用于培育持綠性小麥中，用于延緩小麥的衰老。

更近一步地，本發(fā)明所述的基因TaPPH能夠在研究水稻、擬南芥等植物的持綠性中應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因(TaPPH)及其編碼的蛋白TaPPH。該基因在小麥葉片中表達(dá)量最高，并在黑暗誘導(dǎo)離體葉片和小麥葉片自然衰老過(guò)程中表現(xiàn)為升高-下降-升高的表達(dá)趨勢(shì)，表明基因TaPPH受黑暗誘導(dǎo)表達(dá)。外源施加脫落酸(Abscisic acid，ABA)和乙烯利(Ethephon，Eth)處理小麥后，基因TaPPH的表達(dá)量增加；但外源施加6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine, 6-BA)處理后，TaPPH基因的表達(dá)水平在4～24小時(shí)降低，表明TaPPH受ABA和乙烯的誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，受細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)表達(dá)下調(diào)；也說(shuō)明TaPPH基因確實(shí)與小麥葉片衰老有關(guān)。

將本發(fā)明提供的小麥脫鎂葉綠素脫鎂葉綠酸水解酶基因(TaPPH)以反義形式轉(zhuǎn)入小麥、水稻、擬南芥等植物中，可以延緩其衰老。為進(jìn)一步揭示植物葉片衰老過(guò)程中的葉綠素降解機(jī)制，以利用生物工程手段選育持綠性品種提供了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1是由保守序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增得到的TaPPH中間片段。

圖2是由RACE-PCR反應(yīng)獲得的TaPPH的5’端片段及3’端片段。

圖3是根據(jù)TaPPH拼接序列設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增的產(chǎn)物。

圖4是黑暗處理后小麥幼苗葉片中TaPPH的表達(dá)特性。

圖5是ABA和乙烯利處理后小麥幼苗葉片中TaPPH的表達(dá)特性。

圖6是6-BA處理后小麥幼苗葉片中TaPPH的表達(dá)特性。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，并不用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行任何限制。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1：TaPPH的分子克隆。

選取籽粒飽滿的長(zhǎng)4738小麥種子，置于培養(yǎng)皿中，加去離子水，萌發(fā)后種植在花盆中，置于人工氣候箱培養(yǎng)，光周期為12h光照，12h黑暗，濕度80%，溫度25℃。三葉期時(shí)取小麥葉片，經(jīng)液氮速凍后，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Omega公司提供的Plant RNA Kit，提取得到小麥幼苗葉片的總RNA。

以質(zhì)量良好的小麥葉片總RNA做模板，利用Trans Script^? All-in-One SuperMix for PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將已知的擬南芥AtPPH基因序列(GenBank注冊(cè)號(hào)：NM_121383)作為查詢序列，使用blastn程序檢索NCBI的Expressed sequence tags(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為Triticum aestivum (taxid：4565)。將所有匹配結(jié)果下載，導(dǎo)入軟件ContigExpress進(jìn)行片段組裝，挑選含有較長(zhǎng)ORFs的contig作為候選目的片段。以此片段設(shè)計(jì)如下TaPPH基因編碼區(qū)引物：

正向引物(Forward, F1)：5’-AAGAATGTGGAGTCTGAGGGTT-3’；

反向引物(Reverse, R1)：5’-CACGACGGATGTTTGACG-3’。

使用上述引物，對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的小麥葉片cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體的擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10×TransTaq? HiFi PCR buffer II 3.0μl，2.5mM dNTPs 1.5μl，5mM Primers(F1/R1) 0.6/0.6μl，cDNA 1μl，ddH₂O 8μl，TransTaq? HiFi DNA Polymerase 0.3μl，共15μl。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃復(fù)性30s，72℃延伸1:30min，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；72℃延伸15min，4℃保存。

1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，獲得了圖1所示的單一清晰條帶，片段大小為389 bp。切膠，用Gel Extraction Kit回收目的片段。

將回收產(chǎn)物與pEasy-T5 Zero克隆載體連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，在LB/Amp+固體培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)(16～24h)。之后挑取白色單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克?。禾羧￡?yáng)性克隆接種于4mL LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37℃、240rpm條件下?lián)u菌8～12h，之后提取質(zhì)粒，雙酶切(SpeI/NotI)鑒定，能夠得到與PCR產(chǎn)物大小相匹配的目的條帶的為陽(yáng)性質(zhì)粒。將陽(yáng)性質(zhì)粒送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序(測(cè)序引物為通用引物M13 F/R)，得到中間片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

與其他植物的同源序列(PPH)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該片段與其他已知的PPH基因序列具有很高的相似性，初步判斷得到的這個(gè)片段為小麥TaPPH基因的中間片段。

根據(jù)上述分離得到的SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的TaPPH基因中間片段設(shè)計(jì)如下特異性引物：

GSP1：5’-CCTTATGTTGGAGGCATGCCGCTTC-3’，

NGSP1：5’-GAGGCATGCCGCTTCAAGAATGAG-3’，

GSP2：5’-TGAGGGTTCAGTTGACCTCCCATTTC-3’。

以小麥葉片cDNA為模板，分別配制體系進(jìn)行5’和3’-RACE PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出一些條帶(如圖2所示)，分別切膠回收。將回收產(chǎn)物分別與pEasy-T5 Zero克隆載體連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，挑菌并接種于4mL LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37℃、240rpm下?lián)u菌8～12h，之后提取質(zhì)粒，分別測(cè)序(送華大基因科技服務(wù)有限公司，測(cè)序引物為通用引物M13 F/R)。將測(cè)序得到的序列與中間片段進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)圖2中5’端一條約1.5kb的序列及3’端一條約900bp的序列與中間片段有重疊區(qū)域，初步確定為目的基因的5’端及3’端片段。

將所獲得的中間片段、5’端片段和3’端片段通過(guò)軟件ContigExpress拼接，獲得序列長(zhǎng)度2490bp的小麥TaPPH基因的全長(zhǎng)cDNA序列。ORF Finder檢測(cè)其包含一個(gè)698bp的5’非翻譯區(qū)、1032bp的翻譯區(qū)和一個(gè)760bp的3’非翻譯區(qū)。該全長(zhǎng)cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

根據(jù)拼接獲得的TaPPH全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增包含該基因全長(zhǎng)ORF的特異性引物：

正向引物（Forward, F2）：5’- GGCACCAAGAATAGCAAGGC-3’,

反向引物（Reverse, R2）：5’- AACGAACTACGGACGAATCATC-3’。

以此引物（F2/R2）對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的小麥葉片cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：5×TransTaq? FastPfu Buffer 3.0μl，2.5mM dNTPs 1.5μl，Primers(F2/R2) 0.6/0.6μl，cDNA 1μl，ddH₂O 8 μl，TransTaq? FastPfu DNA Ploymerase 0.3μl，共l5μl。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，56℃復(fù)性30s，72℃延伸1:30min，35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；72℃延伸15min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段，獲得了圖3所示的單一清晰條帶，切膠，用Gel Extraction Kit回收目的片段，送華大基因科技服務(wù)有限公司測(cè)序（測(cè)序引物為擴(kuò)增引物F2/R2），測(cè)序結(jié)果顯示，該片段大小為1127bp，其中包含有長(zhǎng)度為1032bp的OFR。

實(shí)施例2：TaPPH基因的序列信息和特性分析。

TaPPH基因cDNA全長(zhǎng)2490bp，包括1032bp的開放閱讀框(open reading frame，ORF)，698bp的5’非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)和760bp的3’UTR。該基因編碼由343個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)TaPPH，預(yù)測(cè)其分子量大約為38.65kDa。TaPPH具有PPH蛋白擁有的保守結(jié)構(gòu)域：酯酶-脂肪酶超家族結(jié)構(gòu)域和α/β水解酶催化結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TaPPH與其它植物的PPH蛋白具有較高的相似性，其中與水稻的OsPPH相似性最高，達(dá)到91%。

實(shí)施例3：TaPPH基因的表達(dá)研究。

利用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)方法分析小麥不同組織、黑暗誘導(dǎo)和施加外源激素處理后小麥葉片TaPPH基因的表達(dá)情況。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，小麥不同器官中，TaPPH基因在葉片中的表達(dá)量最高。黑暗誘導(dǎo)小麥離體葉片后，如圖4所示，TaPPH基因的表達(dá)表現(xiàn)為升高-下降-升高的趨勢(shì)，表明TaPPH基因受黑暗誘導(dǎo)表達(dá)。外源施加脫落酸(abscisic acid，ABA)和乙烯利(Ethephon，Eth)處理小麥，TaPPH基因表達(dá)量增加(圖5)；但外源施加6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)處理后，TaPPH基因的表達(dá)水平在4～24h降低(圖6)；表明TaPPH受ABA和乙烯的誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)，受細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)表達(dá)下調(diào)，也說(shuō)明TaPPH基因確實(shí)與小麥葉片的衰老有關(guān)。