本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌rh9、篩選方法及用途。

背景技術(shù)：

抗菌肽對(duì)食品中的多種革蘭氏陽性及陰性細(xì)菌均有較強(qiáng)的殺滅作用，能快速抑制微生物的生長(zhǎng)，食用后易被體內(nèi)蛋白酶水解消化且無毒副作用，在酸性條件下活性很強(qiáng)，具有良好的溶解性和穩(wěn)定性，是極具發(fā)展前景的新型食品防腐劑。

伊枯草菌素a(iturina)及其同系物也屬于抗菌肽，主要來源于芽孢桿菌屬菌株的次生代謝產(chǎn)物，具有廣譜抗病性和不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)植物和動(dòng)物病原菌具有較高的抑制活性，尤其具有強(qiáng)烈的抗真菌活性。

解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)是一種可以分泌iturina等抗菌肽物質(zhì)的芽孢桿菌。由于iturina對(duì)絲狀霉菌有良好的抑制作用，不僅可以在農(nóng)業(yè)上用于進(jìn)行生物防治，而且在工業(yè)和環(huán)境保護(hù)上也有著廣泛的應(yīng)用潛力。但實(shí)際中，其并未在工業(yè)以及環(huán)境保護(hù)中廣泛應(yīng)用，究其原因，是因?yàn)樗a(chǎn)成本巨大，缺乏一種高產(chǎn)iturina的解淀粉芽孢桿菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供所述解淀粉芽孢桿菌rh9在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心的保藏編號(hào)為cgmcc12489，保藏日期為2016年5月23日，該解淀粉芽孢桿菌rh9可以高產(chǎn)iturina，且生產(chǎn)iturina的成本較低。

本發(fā)明還提供了一種解淀粉芽孢桿菌rh9的篩選方法，包括以下步驟：

步驟1，原始菌株解淀粉芽孢桿菌rh3的活化；

步驟2，初級(jí)誘變

步驟2.1，將活化后的解淀粉芽孢桿菌rh3進(jìn)行青霉素誘變，獲得iturina產(chǎn)量高的第一正突變株和第二正突變株；

步驟2.2，將活化后的解淀粉芽孢桿菌rh3進(jìn)行亞硝基胍誘變，獲得iturina產(chǎn)量高的第三正突變株和第四正突變株；

步驟3，基因組改組

步驟3.1，原生質(zhì)體制備與再生

利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質(zhì)體溶液；

步驟3.2，原生質(zhì)體融合

步驟3.2.1，將第一正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第一紫外滅活溶液，將第二正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第二紫外滅活溶液，將第三正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第三紫外滅活溶液，將第四正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第四紫外滅活溶液；

步驟3.2.2，將第一正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第一熱滅活溶液，將第二正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第二熱滅活溶液，將第三正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第三熱滅活溶液，將第四正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第四熱滅活溶液；

步驟3.2.3，將第一紫外滅活溶液、第二紫外滅活溶液、第三紫外滅活溶液、第四紫外滅活溶液、第一熱滅活溶液、第二熱滅活溶液、第三熱滅活溶液和第四熱滅活溶液等體積混合均勻，4℃離心并收集沉淀，得到原生質(zhì)體混合物沉淀；

步驟3.2.4，將原生質(zhì)體混合物沉淀重懸于smm緩沖液中，再加入相當(dāng)于smm緩沖液9倍體積的40％peg6000，室溫放置5min，得到重懸液，然后再加入與重懸液體積相同的smm緩沖液，混勻并4℃離心，并用smm緩沖液洗滌沉淀，得到洗滌后的沉淀物；

步驟3.2.5，將洗滌后的沉淀物重懸于smm緩沖液中，涂布rm培養(yǎng)基平板，37℃避光培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落；

步驟3.2.6，挑取步驟3.2.5的單菌落，根據(jù)瓊脂柱法進(jìn)行初篩，得到10株以上iturina產(chǎn)量高的初篩菌株；

步驟3.2.7，將10株以上iturina產(chǎn)量高的初篩菌株分別進(jìn)行iturina發(fā)酵，復(fù)篩出2-4株iturina產(chǎn)量高的第一輪基因組改組菌株；

步驟3.2.8，利用第一輪基因組改組菌株制備第一輪基因組改組菌株的原生質(zhì)體溶液；

然后以第一輪基因組改組菌株的原生質(zhì)體溶液出發(fā)，采用步驟3.2.1-步驟3.2.7所述的方法，復(fù)篩出2-4株iturina產(chǎn)量高的第二輪基因組改組菌株；

步驟3.2.9，對(duì)2-4株iturina產(chǎn)量高的第二輪基因組改組菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)分析和iturina發(fā)酵，選取其中iturina產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定性高的一株第二輪基因組改組菌株，命名為解淀粉芽孢桿菌rh9。

優(yōu)選的，步驟3.1的利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質(zhì)體溶液，具體按照以下步驟實(shí)施：制備第一正突變株的菌懸液，然后向第一正突變株的菌懸液中添加溶菌酶，并使溶液中溶菌酶的最終濃度為0.2mg/ml，之后37℃水浴15min，得到第一正突變株的原生質(zhì)體溶液；

并且所述利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟，與利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質(zhì)體溶液的步驟均相同。

優(yōu)選的，步驟3.2.1的紫外滅活處理的條件為20w紫外燈，滅活60min。

優(yōu)選的，步驟3.2.2的100℃滅活處理的時(shí)間為30min。

優(yōu)選的，步驟3.2.3和步驟3.2.4中所述4℃離心的轉(zhuǎn)速為2500rpm，時(shí)間為10min。

優(yōu)選的，步驟3.2.4的smm緩沖液的配方為：

每升smm緩沖液中含有以下組分：蔗糖171.14g，mgcl2.6h2o4.07g，順丁烯二酸2.32g，溶劑為雙蒸水；smm緩沖液的ph為6.5。

優(yōu)選的，步驟3.2.7的iturina發(fā)酵采用的容器是體積20l的發(fā)酵罐，采用的培養(yǎng)基為landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，且每升所述landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中含有以下組分：葡萄糖42.0g，l-谷氨酸鈉14.0g，mgso40.5g，kcl0.5g，kh2po41.0g，feso40.15mg，mnso45.0mg，cuso40.16mg；landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為7.0。

本發(fā)明還提供了一種解淀粉芽孢桿菌rh9在生產(chǎn)iturina中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種解淀粉芽孢桿菌rh9在生產(chǎn)含有iturina的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌rh9，其產(chǎn)生的iturina在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)境保護(hù)上都具有很好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌rh9的篩選方法，是以原生質(zhì)體融合的方式對(duì)包含高產(chǎn)iturina性狀的菌株進(jìn)行多輪基因組隨機(jī)重組，使各出發(fā)菌株的性狀不斷發(fā)生交換，再通過篩選得到高產(chǎn)iturina性狀富集的突變菌株，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、能夠在未弄清代謝途徑或關(guān)鍵酶的情況下，通過較小的工作量在較短時(shí)間內(nèi)獲得高產(chǎn)iturina的解淀粉芽孢桿菌rh9，2輪基因組重排與20輪傳統(tǒng)誘變篩選的結(jié)果相當(dāng)；

2、與其他分子育種技術(shù)相比，該方法簡(jiǎn)單，易于操作；

3、該方法基于原生質(zhì)體融合，經(jīng)基因組重排產(chǎn)生的高產(chǎn)iturina的解淀粉芽孢桿菌rh9不被認(rèn)為是“轉(zhuǎn)基因”，從而避免了公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因生物使用的疑慮。

生物材料保藏信息說明

1、解淀粉芽孢桿菌rh3，已于2016年5月23日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為cgmcc12488，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，分類命名為解淀粉芽孢桿菌bacillusamyloliquefaciens。

2、解淀粉芽孢桿菌rh9，已于2016年5月23日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為cgmcc12489，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，分類命名為解淀粉芽孢桿菌bacillusamyloliquefaciens。

附圖說明

圖1為解淀粉芽孢桿菌rh3和解淀粉芽孢桿菌rh9抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)照?qǐng)D；

圖2為解淀粉芽孢桿菌rh3和解淀粉芽孢桿菌rh9在20l的發(fā)酵罐中細(xì)胞的生長(zhǎng)，葡萄糖消耗和iturina產(chǎn)量對(duì)照；

圖3為ituc基因mrna表達(dá)量分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

本發(fā)明以下實(shí)施例中，若沒有特殊說明，所用試劑皆可在市場(chǎng)上購買得到，若沒有特殊說明，所涉及的方法皆為常規(guī)方法。

本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌rh9，所述解淀粉芽孢桿菌rh9在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心的保藏編號(hào)為cgmcc12489。

基于同一種發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還提供了上述解淀粉芽孢桿菌rh9的篩選方法，包括以下步驟：

步驟1，原始菌株的活化

原始菌株為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)rh3(以下簡(jiǎn)稱rh3菌株)，按照常規(guī)方法對(duì)rh3菌株進(jìn)行活化。

步驟2，初級(jí)誘變

步驟2.1，青霉素誘變

步驟2.1.1，將活化后的rh3菌株接種于100ml的bpy液體培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)12-14h，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到對(duì)數(shù)期種子液。

步驟2.1.2，將對(duì)數(shù)期種子液稀釋10^-4倍，然后將稀釋度為10^-4倍對(duì)數(shù)期種子液、青霉素和bpy瓊脂培養(yǎng)基按1∶1∶18的體積比例混合均勻，加入培養(yǎng)皿中，其中青霉素的效價(jià)為0.5u/ml，bpy瓊脂培養(yǎng)基的溫度為40-50℃，待bpy瓊脂培養(yǎng)基凝固后，然后將平板倒置于37℃培養(yǎng)至有若干單菌落長(zhǎng)出。

步驟2.1.3，挑取若干步驟2.1.2中的單菌落，制備菌株初篩平板，用瓊脂柱法進(jìn)行初篩，其中，初篩平板中青霉素和bpy瓊脂培養(yǎng)基按1∶18的體積比例混合均勻，且青霉素的效價(jià)為0.5u/ml，觀察抑菌圈大小。

步驟2.1.4，挑取步驟2.1.3中抑菌圈大的若干菌株，利用landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行iturina發(fā)酵，利用甲醇提取iturina，hplc測(cè)定iturina含量，復(fù)篩出iturina產(chǎn)量較高的第一正突變株和第二正突變株。

需要說明的是，對(duì)數(shù)期種子液的稀釋梯度以最終bpy平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)在30-300個(gè)為準(zhǔn)，通過顯微鏡計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于rh3菌株的對(duì)數(shù)期種子液以稀釋10^-4倍為最佳。

步驟2.2，亞硝基胍(ntg)誘變

步驟2.2.1，將活化的rh3菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心，洗滌，收集菌體，重懸于無菌水中，制備菌體濃度為10⁸cfu/ml的菌液。

步驟2.2.2，分別制備含有ntg濃度為100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的pda液體培養(yǎng)基。

步驟2.2.3，取10ml步驟2.2.1的菌液，等分為5份，分別對(duì)應(yīng)的接種至含有ntg濃度為100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml的pda液體培養(yǎng)基中，置于37℃下培養(yǎng)過夜(12-16h)，離心，洗滌，混勻后稀釋適當(dāng)倍數(shù)，涂布于pda平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈大小；

或者將ntg固體顆粒直接均勻鋪滿涂布了步驟2.2.1的菌液的pda平板上，37℃培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈大小

步驟2.2.4，挑取步驟2.2.3中抑菌圈大的若干菌株，利用landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行iturina發(fā)酵，利用甲醇提取iturina，hplc測(cè)定iturina含量，復(fù)篩出iturina產(chǎn)量較高的第三正突變株和第四正突變株。

步驟3，基因組改組(genomeshuffling)

步驟3.1，原生質(zhì)體制備與再生

利用第一正突變株制備第一正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質(zhì)體溶液；利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質(zhì)體溶液：

步驟3.1.1，將第一正突變株于bpy液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌體濃度均達(dá)10⁶個(gè)/ml，得到第一正突變株菌懸液，并將第一正突變株菌懸液與bpy液體培養(yǎng)基按5∶95的體積比例混合，于37℃，180rpm振蕩培養(yǎng)4h；4℃，4000rpm離心10min收集第一正突變株菌體；用無菌水重懸第一正突變株菌體至濃度為10⁷-10⁸cfu/ml，得到第一正突變株菌體菌懸液，適當(dāng)稀釋后涂布于pda培養(yǎng)基平板上，記錄酶解前菌落數(shù)。

步驟3.1.2，向第一正突變株菌體菌懸液添加溶菌酶，并使溶菌酶的終濃度為0.2mg/ml；37℃水浴15min，得到第一正突變株菌體原生質(zhì)體溶液，適當(dāng)稀釋后涂布于pda培養(yǎng)基平板上，記錄未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)。

步驟3.1.3，將原生質(zhì)體溶液用smm緩沖液適當(dāng)稀釋后，涂布于再生pda培養(yǎng)基平板上，記錄酶解后再生菌落數(shù)。

所述再生pda培養(yǎng)基為，向每升pda培養(yǎng)基內(nèi)添加35.1gnacl。

需要說明的是，步驟3.1.1、步驟3.1.2和步驟3.1.3中所述的適當(dāng)稀釋是指以每個(gè)平板上最終長(zhǎng)出的菌落數(shù)為30-300個(gè)為參考因素。

步驟3.1.4，計(jì)算第一正突變株的原生質(zhì)體形成率和原生質(zhì)體再生率。

原生質(zhì)體形成率(％)＝(m-n)/m×100％

原生質(zhì)體再生率(％)＝(r-n)/(m-n)×100％

其中：m：酶解前菌落數(shù)；n：未形成原生質(zhì)體的菌落數(shù)；r：酶解后再生菌落數(shù)。

步驟3.1.2，采用步驟3.1.1-步驟3.1.2中所述的方法，利用第二正突變株制備第二正突變株的原生質(zhì)體溶液。

步驟3.1.3，采用步驟3.1.1-步驟3.1.2中所述的方法，利用第三正突變株制備第三正突變株的原生質(zhì)體溶液。

步驟3.1.4，采用步驟3.1.1-步驟3.1.2中所述的方法，利用第四正突變株制備第四正突變株的原生質(zhì)體溶液。

步驟3.2，原生質(zhì)體融合

步驟3.2.1，將第一正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第一紫外滅活溶液，將第二正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第二紫外滅活溶液，將第三正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第三紫外滅活溶液，將第四正突變株的原生質(zhì)體溶液經(jīng)紫外滅活處理得到第四紫外滅活溶液，其中紫外滅活處理的條件為20w紫外燈，且紫外燈與原生質(zhì)體溶液之間的距離為15cm，滅活時(shí)間為60min。

步驟3.2.2，將第一正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第一熱滅活溶液，將第二正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第二熱滅活溶液，將第三正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第三熱滅活溶液，將第四正突變株的原生質(zhì)體溶液100℃滅活處理得到第四熱滅活溶液，其中100℃滅活處理的時(shí)間為30min。

步驟3.2.3，將第一紫外滅活溶液、第二紫外滅活溶液、第三紫外滅活溶液、第四紫外滅活溶液、第一熱滅活溶液、第二熱滅活溶液、第三熱滅活溶液和第四熱滅活溶液各取0.5ml(各溶液的體積相同)，混合均勻，4℃，2500rpm離心10min，收集沉淀，得到原生質(zhì)體混合物沉淀。

步驟3.2.4，將原生質(zhì)體混合物沉淀重懸于0.5mlsmm緩沖液中，再加入相當(dāng)于smm緩沖液9倍體積(4.5ml)的40％peg6000，室溫放置5min，得到重懸液，然后再加入與重懸液體積相同(加入5ml)的smm緩沖液，混勻，4℃，2500rpm離心10min，并用smm緩沖液洗滌沉淀，得到洗滌后的沉淀物。

其中，40％peg6000是指peg6000的體積濃度為40％。

步驟3.2.5，將洗滌后的沉淀物重懸于100μlsmm緩沖液中，適當(dāng)稀釋后涂布rm培養(yǎng)基平板，37℃避光培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落(培養(yǎng)時(shí)間為24h左右)。

步驟3.2.6，挑取若干步驟3.2.5的單菌落，分別于pda液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后根據(jù)瓊脂柱法將培養(yǎng)液添加于pda培養(yǎng)基平板上，根據(jù)抑菌圈的大小進(jìn)行初篩，其中以大腸桿菌為指示菌，得到10株以上iturina產(chǎn)量高的初篩菌株。

步驟3.2.7，將步驟3.2.6的10株以上的初篩菌株采用landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行iturina發(fā)酵，利用甲醇提取iturina，hplc測(cè)定iturina含量，復(fù)篩出2-4株iturina產(chǎn)量高的第一輪基因組改組菌株。

其中iturina發(fā)酵使用的培養(yǎng)基為landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基。

步驟3.2.8，采用步驟3.1.1-步驟3.1.2中所述的方法，利用第一輪基因組改組菌株制備第一輪基因組改組菌株原生質(zhì)體溶液；

然后第一輪基因組改組菌株的原生質(zhì)體溶液出發(fā)，采用步驟3.2.1-步驟3.2.7所述的方法，復(fù)篩出2-4株iturina產(chǎn)量高的第二輪基因組改組菌株。

步驟3.2.9，對(duì)2-4株iturina產(chǎn)量高的第二輪基因組改組菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)分析，并利用hplc檢測(cè)iturina產(chǎn)量，選取其中iturina產(chǎn)量高且遺傳穩(wěn)定性高的一株第二輪基因組改組菌株，命名為解淀粉芽孢桿菌rh9，以下簡(jiǎn)稱rh9菌株。

圖1為rh3菌株和rh9菌株抑菌實(shí)驗(yàn)對(duì)照?qǐng)D，其中圖1a為rh3菌株的抑菌圈，圖1b為rh9菌株的抑菌圈，由圖1可知，rh9菌株的抑菌圈明顯大于rh3菌株的抑菌圈，說明rh9的iturina產(chǎn)量有顯著提高。

rh9菌株產(chǎn)iturina的hplc分析，包括：

制備rh9菌株種子液，rh9菌株種子液按體積分?jǐn)?shù)5％的接種量接種于landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，在32℃，150rpm下培養(yǎng)36h，得到iturina發(fā)酵液；將iturina發(fā)酵液以4℃，5000rpm離心20min，除去菌體，收集上清液；用6mol/l的hcl將上清液調(diào)節(jié)到ph＝2，然后靜置過夜，靜置過夜時(shí)間為12-16h；4℃，5000rpm離心20min，收集沉淀，加入5ml甲醇，后用naoh中和至ph＝7，獲得iturina粗提物。經(jīng)過高效液相色譜(hplc，agilent1100series)分析，結(jié)果如表1所示，與rh3菌株相比，rh9菌株的iturina產(chǎn)量從39.31mg/l提高到119.1mg/l，提高了3.03倍。

表1hplc測(cè)定rh3菌株和rh9菌株的iturina產(chǎn)量

rh3菌株和rh9菌株在發(fā)酵罐中發(fā)酵性能比較：

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)rh9菌株高產(chǎn)iturina，rh3菌株和rh9菌株分別在20l發(fā)酵罐中，以初始葡萄糖濃度為42g/l進(jìn)行iturina發(fā)酵，圖2為rh3菌株和rh9菌株在20l的發(fā)酵罐中細(xì)胞的生長(zhǎng)，葡萄糖消耗和iturina產(chǎn)量對(duì)照；

rh9菌株iturina的產(chǎn)量最高濃度為359.1mg/l，是rh3菌株的6.65倍。rh9菌株在同等條件下也表現(xiàn)出比rh3菌株較好的菌體增長(zhǎng)和更快速的葡萄糖消耗。

圖3為ituc基因mrna表達(dá)量分析圖，利用熒光定量pcr研究iturina合成酶基因ituc在高產(chǎn)突變菌株與出發(fā)菌株轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)量的差異，2^-δδct相對(duì)定量法分析顯示，rh3菌株中酶基因ituc的相對(duì)表達(dá)量是rh9菌株中酶基因ituc的相對(duì)表達(dá)量的8.97倍。

需要說明的是，本發(fā)明所述的smm緩沖液起到滲透壓穩(wěn)定劑的作用，其配方為：

每升所述smm緩沖液中含有以下組分：蔗糖171.14g，mgcl2.6h2o4.07g，順丁烯二酸2.32g，溶劑為雙蒸水；smm緩沖液的ph為6.5，115℃，20min。

需要說明的是rh9的培養(yǎng)條件如下：

斜面培養(yǎng)基：pda培養(yǎng)基(1l)配方：馬鈴薯洗凈去皮，切成1cm×1cm×1cm小丁，稱取200-300g，煮沸半小時(shí)，八層紗布過濾取汁，加入20.0g葡萄糖，蒸餾水定容至1000ml，再加入15-20g瓊脂，121℃，20min，自然ph。

斜面培養(yǎng)方法：37℃培養(yǎng)24h。

種子培養(yǎng)基：bpy培養(yǎng)基(1l)配方：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖10.0g，nacl5.0g，溶劑為水，ph7.0，121℃，20min。

種子液培養(yǎng)方法：每100ml種子培養(yǎng)基中接種2環(huán)接斜面菌種，32℃，150rpm培養(yǎng)36h。

發(fā)酵培養(yǎng)基：landy優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(1l)配方：葡萄糖42.0g，l-谷氨酸鈉14.0g，mgso40.5g，kcl0.5g，kh2po41.0g，feso40.15mg，mnso45.0mg，cuso40.16mg，溶劑為水，ph7.0，115℃，20min。

發(fā)酵培養(yǎng)方法：種子液按體積分?jǐn)?shù)5％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃，150rpm培養(yǎng)36h。

需要說明的是，對(duì)rh9菌株進(jìn)行測(cè)序，序列如下：

cagctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaaggtggacagatgatg

將測(cè)得的序列于ncbi中http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi進(jìn)行同源性搜索比對(duì)，并使用blastn2.2.31系統(tǒng)在genbank中進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)序列相似度最高的為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciensbab128)，序列相似度為100％，表明該菌株屬于解淀粉芽孢桿菌屬。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。