本發(fā)明涉及一種酵母菌的分離篩選、鑒定及其應(yīng)用，具體地說是涉及一種能產(chǎn)生類阿片樣生物活性小肽的膠紅酵母XR-1CGMCCNo.10969的分離培養(yǎng)和鑒定，及其作為畜禽飼料添加劑用途。
背景技術(shù)：
：酵母是一些單細胞真菌，并非系統(tǒng)演化分類的單元。酵母菌是人類文明史中被應(yīng)用得最早的微生物，可在缺氧環(huán)境中生存。目前已知有1000多種酵母，根據(jù)酵母菌產(chǎn)生孢子(子囊孢子和擔孢子)的能力，可將酵母分成三類：形成孢子的株系屬于子囊菌和擔子菌。不形成孢子但主要通過出芽生殖來繁殖的稱為不完全真菌，或者叫“假酵母”(類酵母)。紅酵母屬，屬于隱球酵母科，細胞為圓形、卵形或長形，為多邊芽殖，多數(shù)種類沒有假菌絲，其特點是，有明顯的紅色或黃色色素，很多種因形成莢膜而使菌落呈粘質(zhì)狀，如粘紅酵母。紅酵母菌沒有酒精發(fā)酵的能力，少數(shù)種類為致病菌，在空氣中時常發(fā)現(xiàn)。廣泛分布于海洋、淡水等環(huán)境中，其富蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、消化酶及生長因子等多種營養(yǎng)物質(zhì)。更為重要的是紅酵母能合成生產(chǎn)以蝦青素為主的類胡蘿卜素，是相當優(yōu)質(zhì)的微生物飼料。目前紅酵母的應(yīng)用還不是很普及，但它在許多方面有開發(fā)利用的空間。1979年，Zioudrou發(fā)現(xiàn)酪蛋白和麥谷蛋白的胃蛋白酶酶解產(chǎn)物具有阿片樣活性，由于這些阿片肽均來自外源性食物，其阿片活性同嗎啡一樣能被納洛酮(一種阿片拮抗劑)所逆轉(zhuǎn)，所以稱為外源性阿片肽，簡稱外啡肽(exorphine)。目前發(fā)現(xiàn)外啡肽具有很廣泛的生理功能，主要可以延緩各種動物的胃排空，抑制腸內(nèi)容物的轉(zhuǎn)移；對內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)作用，可引起血液中胰島素的含量顯著升高和SS含量顯著增加，亦可導(dǎo)致血液中催乳素水平顯著升高，另外還可以影響痛覺抑制系統(tǒng)、情感和記憶過程和調(diào)節(jié)機體的免疫系統(tǒng)功能和促進淋巴細胞增殖。阿片肽作為極有潛力的藥物具有高活性，特異性高，毒性低，副作用小等若干優(yōu)點。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能產(chǎn)生類阿片樣生物活性小肽的膠紅酵母，保藏編號為CGMCCNo.10969，保藏日期是2015年6月9日，易于培養(yǎng)，生產(chǎn)安全性高，遺傳穩(wěn)定性好。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種能產(chǎn)生類阿片樣生物活性小肽的膠紅酵母的篩選方法。本發(fā)明的再一個目的在于提供一種能產(chǎn)生類阿片樣生物活性小肽的膠紅酵母作為畜禽飼料添加劑的用途，添加量低、功能明確，能提高動物對營養(yǎng)素(如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等)吸收利用率、提高奶、肉、蛋的產(chǎn)量和生產(chǎn)能力，改善肉、蛋、奶的品質(zhì)和風味，刺激動物免疫器官發(fā)育、提高抗病力、減少發(fā)病率，并能明顯改善水產(chǎn)動物養(yǎng)殖水質(zhì)，提高水產(chǎn)動物生長速度和存活率，廣泛用于禽、牛、羊、豬、水產(chǎn)和經(jīng)濟動物，可作為抗生素的替代品。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：產(chǎn)類阿片樣活性小肽的膠紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)，保藏編號為CGMCCNo.10969,保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。產(chǎn)類阿片樣活性小肽的膠紅酵母的篩選方法，步驟如下：(1)杏仁放于霉菌生長的環(huán)境中7～14天，待產(chǎn)生少量霉菌時，于生杏仁的外表面、中間或者內(nèi)部取樣，研磨成粉，取1g加入100mL無菌水，置于搖床上150r/min、30min，靜止，取其上清液10倍、100倍、1000倍的梯度稀釋，得到稀釋液，備用；(2)菌種的分離與純化：分別取上述三份稀釋液0.2mL于YEPD培養(yǎng)基，在28℃劃線或涂布培養(yǎng)，2d后從平板上挑取酵母菌，再劃線接種于新配置的相同YEPD培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)得單菌落；(3)酵母菌種的PCR鑒定：將純化的酵母菌制成菌懸液，采用特異性上游引物1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’和下游引物：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，常規(guī)PCR體系條件反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物進行測序，根據(jù)測序結(jié)果，在NCBIBLAST系統(tǒng)中進行比對，完成菌種鑒定。(4)膠紅酵母的大規(guī)模液體培養(yǎng)方法，步驟如下：母菌種→斜面活化菌種→種子的擴大培養(yǎng)、培養(yǎng)基的配制與滅菌→無菌空氣的制備→液體發(fā)酵→離心→烘干→添加載體預(yù)混成品。有益效果：一、類阿片樣生物活性小肽的檢測1-1、膠紅酵母XR-1CGMCCNo.10969產(chǎn)生了具有類阿片樣生物活性小肽實驗方法(1)將膠紅酵母CGMCCNo.10969通過機械破碎法(研磨)，再結(jié)合鹽酸-熱處理結(jié)合破碎法獲得細胞內(nèi)容物。然后4000r/min低溫離心20min，取上清液于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)選用中華大蟾蜍心臟離體建立體外循環(huán)系統(tǒng)，方法是，分別從蛙心主動脈和腔靜脈插管構(gòu)成體外循環(huán)。心尖端接上一量程為0.1kgf/cm2的張力換能器，連接二道生理記錄儀，記錄儀的各項參數(shù)分別為濾波：100HZ；時間常數(shù)：0.2s；靈敏度：0.5～1.0mv/cm；紙速：2.5mm/s。在體外循環(huán)液中，取上述步驟中取得酵母菌培養(yǎng)物1ml，室溫，10000rpm離心5min，收集菌體，加入酵母裂解液(2％triton100，1％SDS，0.1MNaCl，10mMtris-HClph8，1mMEDTA)和酸洗玻璃珠，劇烈振蕩5min，室溫，12000rmp，離心5min，取上清液,即為膠紅酵母裂解上清液。加入膠紅酵母裂解上清液80ul，檢測對心肌活動的影響；在此基礎(chǔ)上加入阿片肽拮抗劑-納洛酮80ul，以檢測類阿片樣生物活性，結(jié)果見表1。表1膠紅酵母細胞裂解液中類阿片樣生物活性小肽的檢測說明：*：P＜0.05，n＝6，平均數(shù)±標準差。從表1中可以看出：加入膠紅酵母細胞裂解液對心肌收縮力產(chǎn)生顯著性加強作用，加入納洛酮后均能顯著性減弱心肌收縮力。1-2、心臟體外循環(huán)系統(tǒng)檢測膠紅酵母細胞裂解液類阿片樣生物活性小肽效應(yīng)從圖7可見：加入裂解液后心肌收縮力增強，待心臟收縮活動相對穩(wěn)定，再加入阻斷劑-納洛酮，可見心肌收縮力明顯減弱，心率基本沒有變化。二、作為畜禽飼料添加劑的用途(1)使用方法：(1)與飼料混合或拌料、直接口服或加入水中飲用；(2)畜禽種類：仔豬、肉仔雞、母豬、育肥豬、產(chǎn)蛋雞、肉鴨；(3)用量：106～108(含活性菌有效成分CFU/噸飼料)。(2)豬飼養(yǎng)中的應(yīng)用選取健康的30日齡斷奶仔豬(公母各半)144頭，分為4個處理組，每個處理組36頭，每個處理組設(shè)置6個重復(fù)組，每個重復(fù)組6頭豬，均為3公3母，試驗期8周，實驗設(shè)計見表2，試驗結(jié)果列于表3。表2.仔豬試驗設(shè)計組別處理組(含活性菌有效成分CFU/噸飼料)試驗1組106試驗2組107試驗3組108對照組空白對照表3.在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的使用效果組別30～90日齡平均日增重30～90日齡料重比試驗1組0.396±0.011.86±0.07試驗2組0.468±0.03*1.68±0.05*試驗3組0.385±0.021.79±0.08對照組0.270±0.032.34±0.08注：*，p<0.05從表3中可以看出，添加了膠紅酵母菌的3個不同劑量組的平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率均優(yōu)于空白對照組，可明顯提高豬的生產(chǎn)性能，即日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率。(3)對肉仔雞生產(chǎn)性能(增重速度和耗料)影響實驗為檢測本發(fā)明的活菌制劑對肉雞生產(chǎn)性能的影響，將肉仔雞分為4組，每個組分成3個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞，試驗期7周。試驗設(shè)計見表4，基礎(chǔ)日糧配比及營養(yǎng)水平見表5。在7日齡試驗開始時、28和42日齡分別以重復(fù)為單位稱重，并統(tǒng)計耗料量，計算7～28日齡和28～42日齡的死亡只數(shù)、增重、采食量以及料肉比，實驗結(jié)果見表6。表4肉雞試驗設(shè)計組別處理組(含活性菌有效成分CFU/噸飼料)試驗1組106試驗2組107試驗3組108對照組空白對照表5試驗基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平注：*每千克日糧添加量，銅8mg，鐵80mg，錳100mg，碘0.35mg，硒0.25mg，鈷0.4mg，維生素A8800U，維生素D33000U，維生素E30mg，維生素K31.6mg，硫胺素6.6mg，核黃素6.6mg，吡哆醇4.4mg，維生素B120.02mg，泛酸11mg，煙酸66mg，葉酸1mg，生物素0.2mg；**計算值。表6：在肉仔雞生產(chǎn)性能中的使用效果組別增重料肉比試驗1組1.635±0.0092.25±0.011試驗2組1.847±0.021**2.03±0.029*試驗3組1.720±0.023*2.19±0.024對照組1.511±0.0132.31±0.031由表6可知，添加本發(fā)明的膠紅酵母活菌可以提高肉仔雞的體增重，降低飼料轉(zhuǎn)化率，節(jié)約飼料開支，提高經(jīng)濟效益。(4)在蛋雞飼養(yǎng)中的應(yīng)用為檢驗?zāi)z紅酵母活菌在蛋雞上的使用效果，選用褐殼蛋雞2400羽，分4組，每組600只，分3個重復(fù)，每個重復(fù)200只雞，喂以4種不同的日糧，對照組為基礎(chǔ)蛋雞日糧，試驗1～3組分別在蛋雞基礎(chǔ)日齡中添加膠紅酵母菌106、107和108CFU/噸飼料。試驗期為2個月，結(jié)果列于表7。檢測指標為破蛋率(％)、產(chǎn)蛋率(％)、蛋重(克/個蛋)、死淘率(％)、飼料轉(zhuǎn)化效率(耗料g/Kg蛋)。表7：在蛋雞中使用效果組別產(chǎn)蛋率(％)料蛋比(F/E)破蛋率(％)死淘率(％)蛋重(克)試驗1組82.4±2.12.45±0.52.5±0.10.7±0.266.1±0.5試驗2組85.7±2.4*2.41±0.2*2.1±0.30.2±0.168.9±0.7試驗3組84.9±3.62.43±0.4*2.2±0.10.4±0.567.8±0.2對照組81.5±2.32.59±0.33.1±0.51.4±0.165.1±0.5從表7中可以看出，在蛋雞飼料中添加該膠紅酵母活菌能顯著提高蛋禽產(chǎn)蛋率，增加蛋重，降低料蛋比、破蛋率，降低死淘率，提高飼料利用率、生產(chǎn)性能和降低生產(chǎn)成本。(5)對雞IBV抗體效價的影響為檢測本發(fā)明的膠紅酵母菌對肉雞對IBV特異性抗體效價的影響，將肉仔雞分為4組，每個組分成3個重復(fù)，每個重復(fù)10只雞，試驗期7周。試驗設(shè)計見表8，分別于7日齡和14日齡給肉雞滴鼻、滴眼IBVH120疫苗0.5ml。表8：肉雞免疫試驗設(shè)計組別處理組(含活性菌有效成分CFU/噸飼料)試驗1組106試驗2組107試驗3組108對照組空白對照分別于7、28、35和42日齡每組取8只雞翅靜脈采血，然后4000rpm離心10min分離血清，于-20℃冰箱冷凍保存，用HA和HI試驗檢測IBV抗體效價，結(jié)果以Log2的對數(shù)值表示，見表9。表9：肉雞血清中IBVHI抗體滴度(log2)從表9中可看出，添加膠紅酵母菌組的肉仔雞的IBV抗體效價明顯高于空白對照組，說明膠紅酵母菌可顯著提高肉仔雞的抗體效價，抗體效價是衡量機體抵抗病原能力的重要指標，抗體效價高即表明機體的抗病力強。綜上所述：(1)本發(fā)明提供的膠紅酵母菌能產(chǎn)生類阿片類生物活性小肽成分。(2)該膠紅酵母菌作為飼料添加劑的功能明確，具有如下的功能：①可提高動物對營養(yǎng)素，如蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素等重要營養(yǎng)素的吸收利用率，提高飼料利用率。②可提高肉、蛋產(chǎn)量和生產(chǎn)能力，改善肉、蛋的品質(zhì)和風味；③具有刺激動物免疫器官發(fā)育和提高抗病力和減少發(fā)病率等功能，明顯提高畜禽成活率，降低死淘率，可作為抗生素的替代品，降低藥物殘留。(3)增強免疫作用，通過刺激腸道內(nèi)免疫系細胞，增加局部抗體的形成，從而增加巨噬細胞活性。同時還能抑制有害菌的繁殖，使腸內(nèi)菌群保持平衡，使有益菌數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢。(4)本發(fā)明產(chǎn)品成本低，易于在薄利的養(yǎng)殖行業(yè)推廣。附圖說明圖1：XR1411的菌落狀態(tài)實物圖；圖2：XR1411的光學(xué)顯微鏡圖片(×10倍)；圖3：膠紅酵母掃描電鏡圖片(標尺＝20μm)；圖4：膠紅酵母透射電鏡圖片(標尺＝200nm)；圖5：膠紅酵母XR1411ITS區(qū)PCR電泳圖；M：DL2000，1：XR1411；圖6：根據(jù)膠紅酵母ITS區(qū)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；圖7：膠紅酵母細胞裂解液對心肌活動的影響圖。具體實施方式以下將結(jié)合實施例具體說明本申請的技術(shù)方案：膠紅酵母的大規(guī)模液體培養(yǎng)方法，步驟如下：母菌種→斜面活化菌種→種子的擴大培養(yǎng)、培養(yǎng)基的配制與滅菌→無菌空氣的制備→液體發(fā)酵→離心→烘干→添加載體預(yù)混成品。實施例1膠紅酵母XR-1CGMCCNo.10969的篩選、分離培養(yǎng)和鑒定(1)樣品的采集將生杏仁的外表面、中間或者內(nèi)部取樣，研磨成粉，取1g加入100mL無菌水，置于搖床上150r/min、30min，靜止，取其上清液進行10倍、100倍、1000倍梯度稀釋，備用。(2)菌種的分離與純化：分別取上述3種稀釋液0.2mL于YEPD培養(yǎng)基進行28℃劃線或涂布培養(yǎng)，2d后從平板上挑取酵母菌，再劃線接種于相同培養(yǎng)基、相同條件培養(yǎng)得單菌落(見圖1)。(3)菌落顯微鏡觀察①光學(xué)顯微鏡觀察：將菌株在YEPD平板上劃線，28℃倒置培養(yǎng)2天，觀察平板上菌落的形態(tài)；將菌株接種到50mLYEPD液體培養(yǎng)基中，28℃，180r/min振蕩培養(yǎng)，取樣，用數(shù)碼顯微鏡觀察然后拍照，(見圖2)。②掃描和透射電子顯微鏡觀察：將培養(yǎng)好的菌液在2000rpm條件下離心5min，棄去上清，用生理鹽水洗滌5～6次，加入2.5％戊二醛，于4℃條件下固定2h。送南京農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡觀察室檢測(見圖3、圖4)。(4)酵母菌種的PCR鑒定將純化的酵母菌制成菌懸液，采用特異性上游引物1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’和下游引物：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’，常規(guī)PCR體系條件反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物送至Invitrogen公司測序部，根據(jù)測序結(jié)果，在NCBIBLAST系統(tǒng)中進行比對，完成菌種鑒定。SEQUENCELISTING<110>南京曉莊學(xué)院<120>產(chǎn)類阿片樣活性小肽的膠紅酵母菌、其篩選方法及其應(yīng)用<130><160>1<170>PatentInversion3.3<210>1<211>618<212>DNA<213>人工序列<400>1ttgcatatcaataagcggaggaaaagaaactaacaaggattcccctagtagcggcgagcg60aagcgggaagagctcaaatttataatctggcaccttcggtgtccgagttgtaatctctag120aaatgttttccgcgttggaccgcacacaagtctgttggaatacagcggcatagtggtgag180acccccgtatatggtgcggacgcccagcgctttgtgatacattttcgaagagtcgagttg240tttgggaatgcagctcaaattgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagag300accgatagcgaacaagtaccgtgagggaaagatgaaaagcactttggaaagagagttaac360agtacgtgaaattgttggaagggaaacgcttgaagtcagacttgcttgccgagcaatcgg420tttgcaggccagcatcagttttccgggatggataatggtagagagaaggtagcagtttcg480gctgtgttatagctctctgctggatacatcttgggggactgaggaacgcagtgtgccttt540ggcgggggtttcgacctcttcacacttaggatgctggtggaatggctttaaacgacccgt600cttgaaacacggaccaaa618當前第1頁1 2 3