本發(fā)明涉及腫瘤相關(guān)抗原肽及其應(yīng)用，特別涉及腫瘤相關(guān)抗原XAGE-1b短肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

眾所周知，T細(xì)胞過繼治療腫瘤是目前最令人矚目的技術(shù)，尤其是受體工程化T細(xì)胞的應(yīng)用正成為振奮人心的癌癥治療方法，同樣對病毒感染及自身免疫性疾病具有廣泛的應(yīng)用前景。

人體免疫監(jiān)視系統(tǒng)在抵抗腫瘤生長過程中的重要作用，免疫監(jiān)視系統(tǒng)通過協(xié)調(diào)各類免疫細(xì)胞得以實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤生長的目的，其中細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTLs)扮演極其重要的角色，是最關(guān)鍵的殺傷效應(yīng)細(xì)胞。腫瘤抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞可以特異性識別并直接殺傷腫瘤細(xì)胞而不對正常細(xì)胞造成傷害。T細(xì)胞治療因此成為最理想的腫瘤治療策略。美國NIH曾預(yù)言，細(xì)胞治療可能會(huì)成為“能夠徹底治愈腫瘤的唯一手段”。因此，獲得能夠特異性識別、殺傷腫瘤細(xì)胞的CTL是治療腫瘤的核心。利用腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-associated antigen，TAA)多肽誘導(dǎo)建立腫瘤抗原肽特異性CTL，即可獲得具有特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的CTL克隆，并為下一步開發(fā)具有臨床實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的T細(xì)胞過繼治療腫瘤奠定了重要基礎(chǔ)，同時(shí)發(fā)明人還可以獲得如下成果：

1)這些經(jīng)過鑒定篩選出的腫瘤相關(guān)抗原肽氨基酸序列，將可被用于構(gòu)建有效的抗腫瘤肽疫苗、DC疫苗；

2)通過分子克隆技術(shù)可以使發(fā)明人獲得明確的具有特異性識別腫瘤抗原的TCR編碼基因，用于TCR基因修飾T細(xì)胞的建立。

3)通過合成與短肽特異性結(jié)合的熒光探針，可開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的分子探針試劑盒，用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷與治療。

目前，T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)基因修飾T細(xì)胞(TCR-T)，如同嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)修飾T細(xì)胞(CAR-T)技術(shù)一樣倍受關(guān)注。CAR-T應(yīng)用于血液腫瘤治療已取得令人矚目的療效。CAR由單鏈Fv融合CD3信號單元，其功能活性依賴于信號單元的敏感性，信號單元由共刺激分子和(或)細(xì)胞因子組成。然而，有研究顯示，表達(dá)CAR的T細(xì)胞對多肽的敏感性不如表達(dá)αβTCR異源二聚體的T細(xì)胞。TCR-T即通過TCR基因修飾T細(xì)胞技術(shù)，將已獲得的具有特異性識別腫瘤抗原多肽的TCR編碼基因轉(zhuǎn)導(dǎo)循環(huán)CD8⁺T細(xì)胞，通過這一方法可在極短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的穩(wěn)定高表達(dá)特異性TCR的、具有與親代CTL同樣的腫瘤特異性識別與殺傷效應(yīng)的基因修飾T細(xì)胞，從而滿足實(shí)際臨床應(yīng)用所需。

發(fā)明人從2005年就開始從事腫瘤相關(guān)抗原肽特異性CTL的誘導(dǎo)建立，TCR相關(guān)研究(Int J Hematol.2011，93:176–185)及TCR基因修飾T細(xì)胞的研究，分別成功將腫瘤相關(guān)抗原WT1及Aurora kinase A特異性TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)循環(huán)CD8⁺T細(xì)胞(Blood，2011，118:1495-1503；Blood，2012，119:368-376)，獲得TCR-T克隆，經(jīng)體外、體內(nèi)鑒定，證實(shí)了其抗肺癌或白血病細(xì)胞的有效性。

TCR基因修飾T細(xì)胞技術(shù)越來越顯現(xiàn)出它在腫瘤免疫治療中的重要價(jià)值及美好前景，而生成TCR-T的關(guān)鍵前提是獲得具有特異識別腫瘤抗原的TCR，通過體外誘導(dǎo)建立腫瘤相關(guān)抗原肽特異性CTL是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的一個(gè)重要途徑。

XAGE-1(X antigen family member 1)是癌-睪丸抗原(Cancer-Testis antigen，CTA)家族成員之一，CTA又稱腫瘤-生發(fā)系(Tumor-Germline，TG)抗原。該類抗原，只表達(dá)于睪丸精原細(xì)胞，而不表達(dá)于正常組織細(xì)胞，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)CTA表達(dá)于多種不同組織類型的腫瘤，因而又稱為腫瘤特異共享抗原(tumor-specific shared antigens，TSSA)。由于睪丸精原細(xì)胞不表達(dá)主要組織相容性抗原復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)I類分子，因此CTA誘導(dǎo)的CTL的免疫應(yīng)答對睪丸細(xì)胞無傷害，只殺傷腫瘤細(xì)胞。正是因?yàn)檫@種特性使得CTA成為腫瘤免疫治療的理想抗原。人類XAGE-1屬于GAGE/PAGE家族，XAGE-1基因定位于Xp11.21-Xp11.22，包括XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c、XAGE-1d四種剪接體，XAGE-1b(X antigen family，member 1b)基因全長622bp，編碼由81個(gè)氨基酸組成的蛋白前體。

XAGE-1b在多種腫瘤包括乳腺癌、前列腺癌、各種類型的肺癌(腺癌、鱗癌和小細(xì)胞肺癌等)、卵巢癌、黑色素瘤、惡性膠質(zhì)瘤、淋巴瘤以及白血病等中均有表達(dá)。該基因有XAGE-1a、XAGE-1b、XAGE-1c和XAGE-1d4種轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體，其中XAGE-1b是能夠被免疫細(xì)胞識別的優(yōu)勢抗原，免疫原性很強(qiáng)，在NSCLC中特別是肺腺癌中高表達(dá)，已成為肺癌免疫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。然而，目前尚未有已建立XAGE-1b抗原肽特異性CTL的報(bào)道。盡管一些CTA多肽特異性CTL已經(jīng)建立并通過鑒定，如：NY-ESO-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1)抗原特異性CTL，MAGE抗原(melanoma-associated antigens)，MAGE-1特異性CTL等。但由于腫瘤的異質(zhì)性以及腫瘤患者間的個(gè)體差異，獲得足夠多的腫瘤抗原肽特異性CTL克隆是非常必要的。

一般認(rèn)為多肽的長度越短，其能誘導(dǎo)的特異性免疫能力越弱，甚至完全無法誘導(dǎo)出具有治療價(jià)值的CTL克?。环粗?，多肽長度越長，越能誘導(dǎo)出特異性CTL克隆。然而多肽的長度越長，合成難度越大，越難以獲得純的多肽，雜質(zhì)肽的存在對克隆的形成存在不可預(yù)知的影響，而多肽的純化成本極高但是依然難以避免雜質(zhì)肽的存在，這種方案的成本極其高昂。因此，人們希望在盡可能保留多肽抗原性的情況下縮短多肽的長度。CN102428102A公開的技術(shù)方案中嘗試截取XAGE-1b抗原中的一部分來誘導(dǎo)對腫瘤的體液免疫或細(xì)胞免疫，但是其結(jié)果并不能令人滿意，其多肽的長度依然不短于16AA。

短肽還可能存在特異性差的問題，如何獲得特異性好的且具有良好免疫原性的短肽是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供腫瘤相關(guān)抗原XAGE-1b短肽及其應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

XAGE-1b短肽，其序列為SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13中一條。

如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13所示的XAGE-1b短肽可誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生。

腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，使用SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13的XAGE-1b短肽中的至少一條經(jīng)樹突狀細(xì)胞提呈與CD8⁺T細(xì)胞共培養(yǎng)，誘導(dǎo)篩選得到腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。

一種腫瘤多肽疫苗，由活性抗原成分和輔劑組成，活性抗原成分為如SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13XAGE-1b短肽中的至少一條。

一種用于腫瘤治療的DC疫苗，主要由SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13的XAGE-1b短肽中的至少一條和樹突狀細(xì)胞加載得到。

由于本發(fā)明所選短肽在非小細(xì)胞肺癌中的高度特異性表達(dá)，通過合成與SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：13所示XAGE-1b短肽特異性結(jié)合的熒光探針，可開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)分子探針的試劑盒，用于非小細(xì)胞肺癌的早期診斷與治療，并建立相關(guān)的研究平臺(tái)。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的XAGE-1b抗原肽誘導(dǎo)建立的CTL對睪丸細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，只殺傷腫瘤細(xì)胞。誘導(dǎo)得到的CTL克隆具有良好的腫瘤細(xì)胞特異性殺傷效應(yīng)。同時(shí)在建立CTL過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)篩選出的XAGE-1b抗原肽具有與DC細(xì)胞上HLA適當(dāng)?shù)挠H和力并能有效地刺激、誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTLs，說明其具備良好的多肽疫苗及DC疫苗的潛力。通過克隆XAGE-1b抗原肽特異性TCR基因，構(gòu)建病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)外周循環(huán)CD8+T細(xì)胞，獲得TCR基因修飾的T細(xì)胞(TCR-T)克隆，同樣具有與親代CTL相似的腫瘤細(xì)胞特異性殺傷效應(yīng)，提示其具有良好的臨床轉(zhuǎn)化及實(shí)際應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是XAGE-1b在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；

圖2是XAGE-1b(51-59)特異性CTL IFN-γ釋放試驗(yàn)；

圖3是XAGE-1b(62-70)特異性CTL IFN-γ釋放試驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

腫瘤抗原選用XAGE-1b抗原，XAGE-1b基因位于X染色體(Xp11.21-Xp11.22)，全長622bp，編碼由81個(gè)氨基酸組成的蛋白前體。氨基酸序列如下(源自GenBank:NM_001097594.2)：

MESPKKKNQQLKVGILHLGSRQKKIRIQLRSQCATWKVICKSCISQTPGINLDLGSGVKVKIIPKEEHCKMPEAGEEQPQV(SEQ ID NO：1)

下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

XAGE-1b在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)

XAGE-1是CTA家族中重要成員，除在非小細(xì)胞肺癌中有較廣泛的表達(dá)外，在多種惡性腫瘤中有表達(dá)，建立XAGE-1b抗原肽特異性CTL克隆具有極其重要的意義。前期研究中發(fā)明人隨機(jī)選取外科手術(shù)切除肺癌標(biāo)本(均經(jīng)病理檢查確診并征得患者同意)，常規(guī)行RT-PCR檢測XAGE-1b mRNA在NSCLC中的表達(dá)水平(PCR引物：F：5'-TTTCTCCGCTACTGAGACAC-3'(SEQ ID NO：14)，R：5'-CAGGTGCTGGGAAGGGAAAT-3'(SEQ ID NO：15))。結(jié)果如圖1，顯示XAGE-1b在肺腺癌細(xì)胞中有較廣泛的表達(dá)。

發(fā)明人通過自有方法，對XAGE-1b抗原的CTL表位進(jìn)行綜合評分，以不同的兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(美國國立衛(wèi)生研究所BIMAS，http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/和德國海德堡生物醫(yī)學(xué)信息中心SYFPEITHI，http://www.syfpeithi.de/)評分之乘積為該預(yù)測表位的總評分，根據(jù)總評分預(yù)測其CTL的表位。所得候選肽由專業(yè)公司合成。具體多肽序列根據(jù)與不同HLA亞型結(jié)合分類，具體如下：

HLA-A*1101組：

基于預(yù)測結(jié)果，發(fā)明人隨機(jī)選擇其中的2條進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，具體實(shí)驗(yàn)如下。

XAGE-1b短肽特異性CTL克隆建立的操作如下：

同一健康捐獻(xiàn)者的10⁵個(gè)CD8+T細(xì)胞通過負(fù)載XAGE-1b(57-65)肽的10⁴個(gè)Mo-DCs間隔1周刺激2次后，再通過自體10⁵個(gè)絲裂霉素C處理過的負(fù)載XAGE-1b短肽的PBMC刺激1次后，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞毒試驗(yàn)篩選獲得。

T2細(xì)胞加載5uM XAGE-1b短肽作為靶細(xì)胞，CTL的XAGE-1b短肽特異性細(xì)胞毒性通過LDH釋放試驗(yàn)得以證實(shí)。

采用以上體外誘導(dǎo)建立XAGE-1b短肽特異性CTL克隆的方法，發(fā)明人還建立了HLA-A*1101限制性XAGE-1b(51-59)(SEQ ID NO：5)及XAGE-1b(62-70)(SEQ ID NO：7)特異性CTL克隆，通過IFN-γ釋放試驗(yàn)證實(shí)其多肽特異性免疫應(yīng)答效應(yīng)(如圖2，3)。

上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，發(fā)明人建立的CTL表位是極其有效的，預(yù)測結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合性非常好。

可見，通過將上述XAGE-1b短肽中的至少一條(SEQ ID NO：2～13)經(jīng)樹突狀細(xì)胞提呈與細(xì)胞毒性淋巴T細(xì)胞共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)篩選得到腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。這種腫瘤抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞可用于腫瘤的治療。

將上述XAGE-1b短肽中的至少一條(SEQ ID NO：2～13)與樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)加載回輸，可以作為DC疫苗用于腫瘤免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生多肽特異性抗腫瘤T細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)腫瘤的治療。

上述XAGE-1b短肽中的至少一條(SEQ ID NO：2～13)可以用于測定受試體樣本中針對多肽的抗體水平，進(jìn)而用于非小細(xì)胞肺癌的診斷。

本發(fā)明的XAGE-1b短肽長度僅為9個(gè)氨基酸，化學(xué)合成難度小，可以直接合成得到高純的產(chǎn)物，應(yīng)用成本大大降低，同時(shí)效果明確，具有很好的應(yīng)用潛力。

<110> 安, 軍

張, 蓓

<120> 一種腫瘤相關(guān)抗原XAGE-1b短肽及應(yīng)用

<130> XAGE-1b*1101

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 81

<212> PRT

<213> 人類

<400> 1

Met Glu Ser Pro Lys Lys Lys Asn Gln Gln Leu Lys Val Gly Ile Leu

1 5 10 15

His Leu Gly Ser Arg Gln Lys Lys Ile Arg Ile Gln Leu Arg Ser Gln

20 25 30

Cys Ala Thr Trp Lys Val Ile Cys Lys Ser Cys Ile Ser Gln Thr Pro

35 40 45

Gly Ile Asn Leu Asp Leu Gly Ser Gly Val Lys Val Lys Ile Ile Pro

50 55 60

Lys Glu Glu His Cys Lys Met Pro Glu Ala Gly Glu Glu Gln Pro Gln

65 70 75 80

Val

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 2

Gly Val Lys Val Lys Ile Ile Pro Lys

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 3

Asp Leu Gly Ser Gly Val Lys Val Lys

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 4

Gly Ser Arg Gln Lys Lys Ile Arg Ile

1 5

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 5

Asn Leu Asp Leu Gly Ser Gly Val Lys

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 6

Ile Leu His Leu Gly Ser Arg Gln Lys

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 7

Ile Ile Pro Lys Glu Glu His Cys Lys

1 5

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<212> PRT

<213> 人類

<400> 8

Cys Ala Thr Trp Lys Val Ile Cys Lys

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 9

Ile Ser Gln Thr Pro Gly Ile Asn Leu

1 5

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<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 10

Gln Thr Pro Gly Ile Asn Leu Asp Leu

1 5

<210> 11

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 11

Gly Ser Gly Val Lys Val Lys Ile Ile

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 12

Lys Val Gly Ile Leu His Leu Gly Ser

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類

<400> 13

Ala Thr Trp Lys Val Ile Cys Lys Ser

1 5

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 14

tttctccgct actgagacac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 15

caggtgctgg gaagggaaat 20