本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及通過肽庫技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用以獲得SH3結(jié)構(gòu)域的非典型配體及配體的保守基序。
背景技術(shù)：
：SH3結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布，通常由50～100個(gè)氨基酸組成，SH3結(jié)構(gòu)域是一種參與調(diào)節(jié)多生物過程的重要蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。最初是在v-Src癌基因酪氨酸激酶產(chǎn)物的同源序列中發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域，現(xiàn)已知SH3結(jié)構(gòu)域在許多信號(hào)分子和細(xì)胞骨架分子中存在。典型的SH3結(jié)構(gòu)域是由五條β折疊，RTloop，N-Srcloop，thedistalloop和一個(gè)310helix組成。SH3結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞增殖分化的信號(hào)通路中發(fā)揮作用，被作為不同類型的癌癥研究藥物靶點(diǎn)。SH3結(jié)構(gòu)域的典型配體，包含-P-x-x-P-序列，加上兩端的輔助結(jié)合位點(diǎn)形成RXXPXXP，PXXPXR的結(jié)合基序。目前SH3結(jié)構(gòu)域在藥物發(fā)現(xiàn)中的研究主要集中在結(jié)構(gòu)相對單一的典型配體。近年來隨著對SH3結(jié)構(gòu)域的深入研究，一些SH3結(jié)構(gòu)域的非典型配體相繼被報(bào)道發(fā)現(xiàn)，例如：RKxxYxxY區(qū)域與Fyb，F(xiàn)yn和Lck蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。WxxxFxxLE區(qū)域與Pex13p蛋白的SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合。這些SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的發(fā)現(xiàn)一方面表明SH3結(jié)構(gòu)域的功能存在多樣性，另一方面也為以SH3結(jié)構(gòu)域活性為對象的癌癥藥物靶點(diǎn)研究提供基礎(chǔ)和依據(jù)。然而，由于SH3結(jié)構(gòu)域典型配體的豐度高、分布廣、親和力強(qiáng)，因此在常規(guī)的高通量、大規(guī)模篩選過程中，獲得的SH3結(jié)構(gòu)域配體絕大多數(shù)均為典型配體，很難發(fā)現(xiàn)SH3結(jié)構(gòu)域的非典型配體，更難以發(fā)現(xiàn)SH3結(jié)構(gòu)域配體的保守基序，因此目前關(guān)于SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的報(bào)道較少，制約了SH3結(jié)構(gòu)域及其配體的用途。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供一種SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體及其制備方法。具體而言：本發(fā)明提供一種SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的制備方法，其特征包括以下步驟：步驟一：構(gòu)建密碼子簡并的隨機(jī)肽庫；步驟二：構(gòu)建SH3結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞；步驟三：肽庫選擇，獲得能夠結(jié)合SH3結(jié)構(gòu)域的肽；步驟四：序列比對，獲得SH3結(jié)構(gòu)域配體的肽基序；步驟五：基序驗(yàn)證，挑選含有所述肽基序的典型陽性肽驗(yàn)證其與SH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力。本發(fā)明所述SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的制備方法中，步驟一進(jìn)一步包括：(1)簡并密碼子和簡并反密碼子設(shè)計(jì)：使密碼子符合以下通式5’-3’：N1-N2-N3，其中，N1選自A、T、G，N2選自A、T、C、G，N3選自C、G；或N1選自A、T、C、G，N2選自A、T、G，N3選自C、G；使反密碼子符合以下通式5’-3’：N3’-N2’-N1’，其中，N3’選自C、G，N2’選自A、T、C，N1’選自A、T、C、G；(2)肽庫編碼區(qū)的人工合成，人工合成以下兩條序列序列1：TATGGCCATGGAGGCCAGTGAATTCGGA-(N1-N2-N3)8-TAGTAGTAGTAGTAGTAGTAGTAG；序列2：GATCCTACTACTACTACTACTACTACTA-(N3’-N2’-N1’)8-TCCGAATTCACTGGCCTCCATGGCCA(3)將序列1、2退火后插入pGADT7載體的NdeI和BamHI之間，獲得上述隨機(jī)8肽的融合表達(dá)載體；(4)將步驟(3)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，獲得8肽庫；(5)對8肽庫的容量和重組率進(jìn)行鑒定，測得庫容達(dá)到107級(jí)以上，重組率達(dá)到90％以上，確定為合格。本發(fā)明所述SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的制備方法中，步驟二進(jìn)一步包括：(1)將SH3結(jié)構(gòu)域序列插入pBridge質(zhì)粒的EcoRI和BamHI之間，所述SH3結(jié)構(gòu)域選自由hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAb1SH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3組成的組；(2)將表達(dá)SH3結(jié)構(gòu)域的重組pBridge質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于酵母感受態(tài)細(xì)胞中，篩選獲得重組酵母菌。本發(fā)明所述SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的制備方法中，步驟三進(jìn)一步包括：(1)從步驟一獲得的隨機(jī)肽庫擴(kuò)增后，提取并純化質(zhì)粒；(2)用步驟二獲得的重組酵母制備感受態(tài)細(xì)胞，用步驟(1)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，抗性篩選陽性克??；(3)對步驟(2)獲得的陽性克隆進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測；(4)β-半乳糖苷酶活陽性的克隆，提質(zhì)粒、測序；(5)對測序結(jié)果進(jìn)行分析，獲得結(jié)合SH3結(jié)構(gòu)域的8肽序列。本發(fā)明所述SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的制備方法中，步驟四進(jìn)一步包括：使用序列分析軟件，對步驟三獲得的多個(gè)8肽序列進(jìn)行分析比對，獲得SH3結(jié)構(gòu)域配體的肽基序。所述的序列分析軟件包括DNASTAR、DNAMAN等。本發(fā)明所述SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的制備方法中，步驟五進(jìn)一步包括：(1)從步驟三獲得的陽性8肽序列中選擇具有SH3結(jié)構(gòu)域配體肽基序的8肽序列，或人工設(shè)計(jì)具有步驟四所述配體基序的短肽序列；(2)將所述8肽序列或人工設(shè)計(jì)的短肽序列插入載體中，使其與SH3結(jié)構(gòu)域在同一個(gè)宿主中共表達(dá)，驗(yàn)證兩者的相互作用。其中，所述人工設(shè)計(jì)的短肽序列長度為6-20個(gè)氨基酸，優(yōu)選8個(gè)氨基酸。本發(fā)明還提供一種利用所述方法制備獲得的SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體。本發(fā)明所述SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體具有LxLLFF所示的多肽基序，其中x為天然氨基酸。優(yōu)選，所述SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體具有CILWLLFF的氨基酸序列。另外，本發(fā)明還提供所述的SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體在促進(jìn)或抑制SH3結(jié)構(gòu)域功能中的用途。本發(fā)明取得的技術(shù)效果在于：提供了一種簡并化肽庫的構(gòu)建和使用方法，成功獲得了一系列結(jié)構(gòu)相似的SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體，分析出了SH3結(jié)構(gòu)域非典型配體的基序LxLLFF。從而為SH3結(jié)構(gòu)域的作用機(jī)理、功能研究、及以構(gòu)效關(guān)系為基礎(chǔ)的藥物設(shè)計(jì)等提供依據(jù)。附圖說明圖1：庫容測量試驗(yàn)中當(dāng)稀釋度為104時(shí)的平板計(jì)數(shù)情況；圖2：肽庫選擇陽性配體(有兩條相同，只顯示了9條)的序列比對情況及SH3結(jié)構(gòu)域配體基序分析；圖3：WB檢測鑒定結(jié)果。泳道1為陰性對照組(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空載體)；泳道2為實(shí)驗(yàn)組(pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-CILWLLFF)。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。所述實(shí)施例的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，并不意味著對本發(fā)明的保護(hù)范圍作出限定。實(shí)施例一：肽庫的構(gòu)建1.人工合成序列1、2所示的核酸，退火成雙鏈。1)在0.5ml離心管中配制下列反應(yīng)液Oligo各取500pmol，在1×AnnealingBuffer中，95度水浴10分鐘，自然降溫使之復(fù)性形成雙鏈，形成粘性末端(NdeI和BamHI)。表1退火反應(yīng)體系1×AnnealingBuffer20μlOligo500pmolddH20至總體積20μl2)酶切產(chǎn)物用等體積的酚/氯仿抽提一次，10,000rpm離心2min，吸上清于另一管中；3)估計(jì)上清的體積，加入1/10體積的NaAc(3M)溶液，然后加入2倍體積冰預(yù)冷的無水乙醇，-20℃沉淀10min；4)4℃，12,000rpm離心10min，棄上清，沉淀用70％乙醇洗滌兩遍；5)室溫干燥沉淀，然后溶于適量ddH20中。用紫外分光光度計(jì)測量所得DNA的濃度與純度。2.將pGADT7(購自ClontechLaboratoriesInc)在0.5用離心管中限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI進(jìn)行雙酶切。表2酶切反應(yīng)體系質(zhì)粒DNA10-12μl10x酶切buffer2μl內(nèi)切酶1μlddH20至總體積為20μl于37℃水浴中反應(yīng)2hr。3.連接表3連接反應(yīng)體系載體DNA4μl(200ng)InsertDNA2μl(10ng)10x連接buffer2μlT4DNAligase1μl(2U)ddH20至總體積為20μl反應(yīng)液于16℃水浴，反應(yīng)過夜。4.大腸桿菌的轉(zhuǎn)化1)以大腸桿菌DH10B株常規(guī)方法制備大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)胞；2)取新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞40μl，加入2-3μl脫鹽后連接混合物；3)將40μl細(xì)胞轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，且使細(xì)胞覆蓋住電轉(zhuǎn)杯的底部；4)打開電轉(zhuǎn)儀，將電壓設(shè)在1.8kv；5)將電轉(zhuǎn)杯放入；6)按charge鍵，直到聽見電擊聲；7)迅速將細(xì)胞重懸在1ml的培養(yǎng)基中；8)將細(xì)胞在37℃，200rpm搖培60min。取1μl轉(zhuǎn)化菌液用于庫容測定，其余則加入甘油至終濃度為20％，于-70℃儲(chǔ)存。5.庫容測定1)取1μl文庫菌液加入100ul新鮮LB液體培養(yǎng)基中，再從中取10ul加入190ul新鮮LB液體培養(yǎng)基，如此進(jìn)行10倍比梯度稀釋，每梯度設(shè)三個(gè)重復(fù)；2)各梯度菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基中(Ampr)，37℃倒置過夜；3)計(jì)數(shù)，對克隆數(shù)為10-300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)n；4)按下列公式計(jì)算文庫的容量；5)文庫的容量(cfu)＝(n/100μl)×10N(稀釋倍數(shù))×1000。在104稀釋度平板上，長出了185個(gè)克隆(如圖1)；105稀釋度平板上，長出了21個(gè)克隆。經(jīng)計(jì)算庫容量約為2×107cfu/mL。6.重組率測定1)在文庫容量測定中得到的菌落中隨機(jī)挑取50個(gè)克隆，分別搖菌過夜；2)按小量法提取質(zhì)粒DNA；3)克隆測序鑒定，計(jì)算重組率；4)重組率＝重組子數(shù)目/測序菌總數(shù)×％。在隨機(jī)挑取的50個(gè)克隆中，經(jīng)過測序鑒定有兩個(gè)空載體，計(jì)算重組率為96％。實(shí)施例二：構(gòu)建SH3結(jié)構(gòu)域表達(dá)載體以分別含有hNCK-NSH3、hNCK-MSH3、hFynTSH3、cSpectrinSH3、hFgrSH3、hAblSH3、mGadsCSH3、hGrb2CSH3、cSrcSH3編碼序列的原始質(zhì)粒為模板擴(kuò)增獲得九種SH3結(jié)構(gòu)域序列；將其編碼序列構(gòu)建到pBridge載體酶切位點(diǎn)EcoRI、BamHI之間。1.示例性的引物設(shè)計(jì)如下：2.PCR擴(kuò)增體系及參數(shù)表4.PCR反應(yīng)體系Componentvol.μlTemplate1Senseprimer1Antisenseprimer110×buffer5dNTPMixture4DNAPolymeraseHiFi1ddH2O37Total50示例性PCR反應(yīng)參數(shù)：以95℃變性10分鐘、94℃30秒、59℃30秒、72℃1分鐘的條件進(jìn)行35次循環(huán)，最后以72℃延伸10分鐘和12℃保存。反應(yīng)結(jié)束取20μlPCR產(chǎn)物跑1％瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切膠然后高效快速純化離心柱，13000r/min離心2分鐘回收PCR產(chǎn)物。3.酶切、連接、轉(zhuǎn)化的步驟和參數(shù)如上所述。4.鑒定挑取長出的大腸桿菌菌落加入2mlLB陽性培養(yǎng)液混勻，放入恒溫?fù)u床250rpm過夜，做6個(gè)平行樣。各取菌液1μl作為模板，PCR擴(kuò)增，1％瓊脂糖凝膠電泳，將紫外觀測儀下條帶大小與引物擴(kuò)增的預(yù)期產(chǎn)物一致。經(jīng)測序證實(shí)9種SH3編碼區(qū)已成功插入pBridge載體酶切位點(diǎn)EcoRI、BamHI之間。實(shí)施例三：肽庫選擇1.將酵母菌株CG1945，接種固體YPD培養(yǎng)基、及各種營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(-Trp、-Leu、-His)中，確定酵母無野生LacZ活性。2.將實(shí)施例二中構(gòu)建的9種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌。挑取少許酵母菌落加入3mlYPD液體，過夜培養(yǎng)，12000rpm離心棄上清，加入900μlddH20和100μlLiAc溶液混勻，置于30℃水浴5分鐘。2000rpm離心棄上清，加入ddH2047μl，1.0MLiAc溶液36μl，50％PEG4000240μl，鮭魚精DNA5μl，誘餌質(zhì)粒8μl，使用渦旋振蕩儀震搖1分鐘，42℃水浴20分鐘。之后離心去上清，沉淀加入ddH2050-100μl混勻，涂抹于SD/-Trp固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3天。挑取-Trp培養(yǎng)基上的菌落，加入3ml-Trp液體培養(yǎng)基，放30℃搖床過夜培養(yǎng)。收集菌液，離心棄上清，把沉淀點(diǎn)到濾紙上，放入液氮中反復(fù)凍融3分鐘，取出后加入5ml新配制Zbuffer/x-Gal溶液濕潤濾紙，放入30℃溫箱定期觀察。挑選8h內(nèi)不變藍(lán)的重組酵母菌用于肽庫選擇。3.用實(shí)施例1中構(gòu)建的肽庫轉(zhuǎn)化步驟2中的酵母菌。1)挑取步驟2中不變藍(lán)的酵母菌落于0.5mlSD/-Trp液混勻，將混合液轉(zhuǎn)入50mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃搖床培養(yǎng)16-18小時(shí)后，加入300mlYPD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)3小時(shí)。2)1000rpm離心5分鐘后將沉淀合并。加入2mlTE/LiAc液混勻。3)加入8mlPEG/LiAc液、文庫質(zhì)粒75μl、鮭魚精DNA200μl，利用渦旋振蕩儀振搖5分鐘，30℃搖床培養(yǎng)30分鐘，加入1.2mlDMSO。42℃水浴15分鐘，冰浴2分鐘。4)離心棄上清后加入7ml滅菌水混勻后，將所有液體均勻涂布到20個(gè)直徑15cm的SD/-Trp-Leu-His固體培養(yǎng)基(含有抑制酵母生長的最小濃度的3AT)上，30℃培養(yǎng)一周。4.挑取SD/-3培養(yǎng)基上的酵母菌落加入3mlSD/-3培養(yǎng)液，試管中混勻30℃搖床過夜培養(yǎng)。每管取1.5ml液體離心棄上清后將沉淀點(diǎn)到濾紙上，放入液氮凍融3分鐘，加5ml新配制Zbuffer/x-Gal溶液濕潤濾紙，放入30℃溫箱，分別于4、8、10、12小時(shí)挑取變藍(lán)的克隆。5.將步驟4中培養(yǎng)10小時(shí)內(nèi)變藍(lán)的酵母克隆(陽性克隆)和培養(yǎng)12小時(shí)仍未變藍(lán)的酵母克隆(陰性克隆)各挑取10個(gè)，提質(zhì)粒，測序，根據(jù)酶切位點(diǎn)的設(shè)定，利用DNAclub軟件將測序結(jié)果中核苷酸序列轉(zhuǎn)化為相應(yīng)氨基酸序列，即得到AD質(zhì)粒所編碼的SH3結(jié)構(gòu)域配體蛋白的氨基酸序列。配體肽mGadsCSH3的陽性配體序列：02-1VSLVKLFF03-1CIHLPPWF27-3RLWELYFW28-2GWFCLVFF35-1LHLFLLFC36-2LFVNFLCN42-1YGLCLLLF58-2YGLCLLLF50-2LMLCRLLF52-2CILWLLFF其中42-1與58-2兩個(gè)克隆測序結(jié)果翻譯出的蛋白相同。mGadsCSH3陰性配體(非配體肽)序列：34-1KFIFFLVR29-1FFLWKLMI64-1DFFVLWYW27-1SYLNKHNW02-3KYRHMVNN11-3FYLYLFCM01-1FLIMVVLH41-2YFFCMCKN01-3VLCVLYVV03-3FZFMLLYV實(shí)施例四：序列分析和比對將實(shí)施例三中獲得的陽性配體序列和陰性配體序列分別用DNAstar軟件進(jìn)行分析，運(yùn)行MegAlign程序，用CLUSTALw算法進(jìn)行多重序列比對分析，確定保守區(qū)序列。序列分析比對結(jié)果如附圖所示，其表明SH3結(jié)構(gòu)域配體具有共同的LxLLF基序；陰性配體序列比對后未發(fā)現(xiàn)共同的保守基序。實(shí)施例五：SH3結(jié)構(gòu)域配體基序LxLLF的驗(yàn)證。以具有LxLLF基序的配體肽52-2為例，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)試驗(yàn)。1.將mGadsCSH3構(gòu)建到pEGFP-C3的EcoRI、BamHI之間，引物擴(kuò)增、酶切、連接的方法參見上文。2.以52-2克隆中攜帶有CILWLLFF外源肽的質(zhì)粒為材料，將編碼配體CILWLLFF的寡核苷酸構(gòu)建到p3XFLAG-CMV-14中，擴(kuò)增后提取純化獲得無內(nèi)毒素質(zhì)粒，酶切、連接、轉(zhuǎn)化方法參見上文。3.將步驟1、2獲得的兩種質(zhì)粒先后或同時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，獲得同時(shí)表達(dá)上述兩種質(zhì)粒的重組HEK293T(以pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空載體作為陰性對照組)。取HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)值細(xì)胞密度50％左右，更換新鮮的完全培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2培養(yǎng)1h。取5-8μgDNA(起始用量5μg)，加入稀釋液中至總體積為100μl，輕輕混勻，室溫放置。取VigoFect1-4μl(起始用量2μl)，加入稀釋液中至總體積為100μl，輕輕混勻，室溫放置5分鐘。然后將稀釋的VigoFect逐滴加入稀釋的DNA溶液中，輕輕混勻，所得的轉(zhuǎn)染工作液在室溫放置15分鐘。將轉(zhuǎn)染工作液輕輕混勻，逐滴加入2ml培養(yǎng)液中，輕輕混勻培養(yǎng)液，置37℃，5％CO2培養(yǎng)。4.將轉(zhuǎn)染后的HEK293T細(xì)胞用RIPA細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，取600μl加入anti-flag抗體(Abmart)3μg，4℃，顛倒混勻4小時(shí)；加入預(yù)冷的ProteinGagarose30μl，4℃顛倒混勻過夜。用1xIPbuffer洗5次，12000g離心30s，然后0.1xIPbuffer洗一次。12000g離心30s后，徹底去除buffer，加入60μl用60μl上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻。將上樣樣品95℃煮5分鐘，游離抗原，抗體，珠子，離心取上清。5.將上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳，SDS-PAGE參數(shù)為濃縮膠12％、分離膠8％。電泳結(jié)束后進(jìn)行Western-Blot，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)到NC膜上，轉(zhuǎn)膜條件：300mA電流恒流轉(zhuǎn)移2-4小時(shí)。6.將NC膜用5％脫脂乳封閉后加入anti-GFP孵育過夜，洗膜后加入酶標(biāo)羊抗GFP二抗孵育2h，洗膜后，加顯色劑顯色。WB結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-CILWLLFF的重組酵母裂解液中以anti-flag抗體能夠沉淀出蛋白，并且其沉淀獲得的多肽用WB檢測GFP呈陽性。而轉(zhuǎn)染了pEGFP-C3-mGadsCSH3+p3XFLAG-CMV-14空載體的重組酵母裂解液中，以anti-flag抗體沉淀出的蛋白用WB檢測不含GFP(結(jié)果如附圖3所示)。上述結(jié)果證實(shí)，當(dāng)CILWLLFF、mGadsCSH3在真核動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，二者能相互結(jié)合形成復(fù)合物。另外，采用35-1重復(fù)實(shí)施例五也取得了相似的結(jié)果。上述實(shí)施例中的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，并不以任何方式對本發(fā)明的保護(hù)范圍作出限定。在實(shí)際應(yīng)用中，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和精神，以本發(fā)明為基礎(chǔ)做出的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3