本發(fā)明涉及生物技術領域，具體而言，涉及一種基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫的構建方法及融合基因檢測的方法。

背景技術：

基因融合屬于基因結構變異的一種，是指兩個或多個基因的編碼區(qū)首尾相連，于同一套調(diào)控序列控制之下，構成的嵌合基因。融合基因的表達產(chǎn)物為融合蛋白。

隨著大規(guī)模平行測序(二代測序)成本的不斷降低以及目標區(qū)域捕獲技術的不斷成熟，基于二代測序技術的基因檢測得到越來越多的應用。二代測序與傳統(tǒng)檢測方法相比，具有靈敏度高，準確性高，價格低廉，可以同時檢測多種靶點的優(yōu)勢。市面上主流的測序平臺主要有兩個，分別是Illumina公司的熒光可逆性終止法測序以及Thermo Fisher公司的半導體離子流測序(Ion Torrent)。

目標區(qū)域捕獲利用序列捕獲技術將目標區(qū)域的DNA捕捉并富集，結合高通量測序平臺進行測序的研究策略。與全基因組測序相比其優(yōu)勢在于研究區(qū)域集中，大大降低測序費用，周期和工作量；適用于高深度測序，發(fā)現(xiàn)低頻突變。捕獲的方式主要有兩種，一種是以Thermo Fisher公司為代表的基于多重PCR的擴增子捕獲技術，通過在目標區(qū)域的上下游設計引物將感興趣的區(qū)域捕獲；還有就是以Agilent公司為代表的液相雜交捕獲技術，該技術通過針對目標區(qū)域設計cRNA或者cDNA探針進行捕獲。該方法的優(yōu)勢是借助探針可以捕獲到目標區(qū)域的側翼，從而可以檢測與目標區(qū)域發(fā)生基因融合的區(qū)域，因此可以在DNA水平檢測未知的基因融合。

Ion Ampliseq^TM是Thermo Fisher公司開發(fā)的基于多重PCR對目標區(qū)域進行捕獲的技術。該技術在檢測融合基因方面采用的是在轉錄組層面(RNA水平)的擴增子建庫方式，并且只能根據(jù)特定的融合位點形式設計多重PCR的引物。因此，針對每一個樣本，都需要既提取DNA又提取RNA。而臨床樣本復雜性高，特別是福爾馬林固定石蠟包埋的組織(FFPE)樣本，由于保存時間較長且保存方式不規(guī)范，導致核酸的提取比較困難。并且RNA比DNA更容易發(fā)生降解，這就造成了許多樣本由于RNA提取失敗造成無法檢測融合基因的情況發(fā)生。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫的構建方法及融合基因檢測的方法，以解決現(xiàn)有技術中Ion Torrent測序平臺因RNA樣本不合格導致無法檢測基因融合及無法檢測未知融合斷點的融合類型問題。

為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫的構建方法。該構建方法包括以下步驟：S1，對樣品DNA進行片段化，得到DNA片段；S2，對DNA片段進行末端修復及3’端添加堿基A；S3，將3’端連接有A堿基的DNA片段末端連接序列已知的接頭；S4，根據(jù)序列已知的接頭，進行PCR擴增，得到樣本核酸文庫；S5，將樣本核酸文庫基于目標區(qū)域捕獲平臺的探針雜交捕獲融合基因及伴侶基因的DNA片段，采用洗脫液去除捕獲過程中引入的非特異性產(chǎn)物；以及S6，將S5的產(chǎn)物通過PCR引入Ion Torrent Proton測序接頭序列，得到基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫。

進一步地，S1中，樣本DNA不足100ng時，加入500ng的載體RNA進行輔助打斷。

進一步地，S1具體包括：采用超聲波打斷儀將樣品DNA打斷成主帶在150bp～300bp的DNA片段。

進一步地，序列已知的接頭為Illumina測序平臺的測序接頭。

進一步地，S6中，PCR引物的5’端含有Ion Torrent proton測序的接頭序列，3’端與序列已知的接頭有13bp的重疊序列。

進一步地，樣品DNA來自福爾馬林固定石蠟包埋的組織。

根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供一種基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測的方法。該方法包括以下步驟：采用上述任一種構建方法構建基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫；以及在Ion Torrent的Proton測序平臺上進行測序，分析測序結果得到融合基因檢測的結果。

進一步地，在Ion Torrent的Proton測序平臺上進行測序之前，使用安捷倫2100Bioanalyzer檢測插入片段大小，以及使用qPCR定量檢測文庫產(chǎn)量。

進一步地，分析測序結果包括：過濾掉含“N”的測序序列與低質(zhì)量測序序列后，采用BWA軟件進行序列比對產(chǎn)生bam文件，再采用IGV軟件進行軟截斷序列查看。

應用本發(fā)明的技術方案，Ion Torrent測序平臺結合液相雜交捕獲技術，基于目標區(qū)域捕獲平臺的探針雜交捕獲融合基因及伴侶基因的DNA片段，然后用Ion Torrent測序平臺測序，解決了現(xiàn)有技術中Ion Torrent測序平臺因RNA樣本不合格導致無法檢測基因融合及無法檢測未知融合斷點的融合類型問題。

附圖說明

構成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫的構建方法的流程示意圖；

圖2-1和圖2-2示出了實施例1的XHC樣本CCDC6-RET的融合斷點IGV查看結果示意圖；

圖3-1和3-2示出了實施例1的DYT樣本TPM3-ROS1融合斷點的IGV查看結果示意圖；以及

圖4-1和4-2示出了實施例1的FSH樣本EML4-ALK融合斷點的IGV查看結果圖示意圖。

具體實施方式

需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互組合。下面將參考附圖并結合實施例來詳細說明本發(fā)明。

根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫的構建方法。如圖1所示，該構建方法包括以下步驟：S1，對樣品DNA進行片段化，得到DNA片段；S2，對DNA片段進行末端修復及3’端添加堿基A；S3，將3’端連接有A堿基的DNA片段末端連接序列已知的接頭；S4，根據(jù)序列已知的接頭，進行PCR擴增，得到樣本核酸文庫；S5，將樣本核酸文庫基于目標區(qū)域捕獲平臺的探針雜交捕獲融合基因及伴侶基因(partner gene)的DNA片段，采用洗脫液去除捕獲過程中引入的非特異性產(chǎn)物；以及S6，將S5的產(chǎn)物通過PCR引入Ion Torrent Proton測序接頭序列，得到基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫。

Ion Torrent測序平臺結合液相雜交捕獲技術，基于目標區(qū)域捕獲平臺的探針雜交捕獲融合基因及伴侶基因的DNA片段，然后用Ion Torrent測序平臺測序，解決了現(xiàn)有技術中Ion Torrent測序平臺因RNA樣本不合格導致無法檢測基因融合及無法檢測未知融合斷點的融合類型問題。采用本發(fā)明的技術方案構建的目標區(qū)域捕獲文庫可以在Ion Torrent Proton測序儀上進行測序，能夠穩(wěn)定地產(chǎn)出數(shù)據(jù)，并且可以從微量融合陽性樣本中準確檢測到目標基因融合及給出正確的融合形式。

優(yōu)選的，S1中，樣本DNA不足100ng時，加入500ng的載體RNA(Carrier RNA)進行輔助打斷。這是因為如果樣本DNA不足100ng，由于DNA含量低，在超聲波破碎時可能會對樣本造成嚴重破壞，因此添加載體RNA(Carrier RNA)起到保護樣本DNA的作用。

優(yōu)選的，S1具體包括：采用超聲波打斷儀將樣品DNA打斷成主帶在150bp～300bp的DNA片段。150bp～300bp的DNA片段適用于后續(xù)測序儀的測序讀長，本發(fā)明中使用的測序儀為Ion Torrent proton，其測序讀長為單端200bp，因此本步中將DNA打斷成150bp-300bp長度較為合適。

根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，序列已知的接頭為Illumina測序平臺的測序接頭。接已知序列接頭的目的是為了根據(jù)已知序列設計后續(xù)PCR引物引入Ion Torrent proton測序接頭。

在雜交前文庫構建時添加Illumina的Y字型接頭，而不是直接添加proton測序接頭，存在以下優(yōu)勢：1)避免由于proton測序接頭為平末端連接，對于微量樣本而言，會由于連接效率不足導致樣本DNA模板的損失，導致遺傳信息的丟失；2)避免雜交使用的封閉試劑需要針對proton的接頭重新設計，不能保證封閉效果和捕獲效率；3)避免由于proton的測序接頭中barcode序列與插入片段距離很近，無法通過PCR的手段引入barcode序列。

優(yōu)選的，S6中，PCR引物的5’端含有Ion Torrent proton測序的接頭序列，3’端與所述序列已知的接頭有13bp的重疊序列。也就是說，在設計引物時候，引物的5’端含有Ion Torrent proton測序的接頭序列，3’端含有與上一步添加的Iillumina測序接頭序列互補的序列(13bp)，在PCR的時候，上述的13bp長度會與Illumina測序接頭序列退火復性，從而將Ion Torrent proton測序接頭序列引入到PCR產(chǎn)物的兩端。

在雜交前文庫的構建過程中，添加了Illumina測序平臺的測序接頭，這樣會導致在雜交后的PCR(引入proton測序接頭)的過程中，由于引物結合的需要，需要保留一部分的Illumina接頭序列，這部分序列太短的話會導致PCR失敗，太長的話會導致數(shù)據(jù)浪費，經(jīng)過摸索之后確定了使用13bp的overlap序列來輔助進行proton接頭的引入。

根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，樣品DNA來自福爾馬林固定石蠟包埋的組織。

根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，提供一種基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測的方法。該方法包括以下步驟：采用上述任一種的構建方法構建基于Ion Torrent測序平臺融合基因檢測文庫；以及在Ion Torrent的Proton測序平臺上進行測序，分析測序結果得到融合基因檢測的結果。

應用本發(fā)明的技術方案，Ion Torrent測序平臺結合液相雜交捕獲技術，基于目標區(qū)域捕獲平臺的探針雜交捕獲融合基因及伴侶基因的DNA片段，然后用Ion Torrent測序平臺測序，解決了現(xiàn)有技術中Ion Torrent測序平臺因RNA樣本不合格導致無法檢測基因融合及無法檢測未知融合斷點的融合類型問題。

優(yōu)選的，在Ion Torrent的Proton測序平臺上進行測序之前，使用安捷倫2100Bioanalyzer檢測插入片段大小，以及使用qPCR定量檢測文庫產(chǎn)量。

根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，分析測序結果包括：過濾掉含“N”的測序序列(reads)與低質(zhì)量reads后，采用BWA軟件進行序列比對產(chǎn)生bam文件，再采用IGV軟件進行軟截斷reads查看。

由于Ion Torrent測序平臺測序原理所限，對于串聯(lián)重復堿基的測序錯誤率較高，在測序完成之后，儀器會自動過濾掉測序質(zhì)量差的測序序列(reads)，而基因融合經(jīng)常會發(fā)生在串聯(lián)重復堿基中，這樣會導致在原始數(shù)據(jù)中會損失掉一些關鍵性reads。針對此問題，本發(fā)明采用查找測序最原始的電信號來找回支持融合突變的reads來保證檢測的準確度。

根據(jù)本發(fā)明一種典型的實施方式，該方法包括以下步驟：

1.待檢測樣本DNA的片段化

使用超聲波打斷儀(Covaris LE220R)將樣品按照表1打斷參數(shù)打斷成主帶在150bp～300bp的DNA片段；特別地，如果樣本DNA不足100ng，需加入500ng的Carrier RNA進行輔助打斷。

表1

2.DNA片段末端修復及3’端添加A堿基；

3.接頭的連接

將末端連接A堿基的DNA隨機片段末端連接序列已知的接頭(序列已知，并且在后續(xù)雜交捕獲時具有針對接頭序列的封閉試劑可以使用)。

4.PCR擴增

根據(jù)已知的接頭序列引物，進行PCR擴增，得到樣本核酸文庫；

5.基于安捷倫SureSelect目標區(qū)域捕獲平臺的探針雜交捕獲，采用洗脫液去除捕獲過程中引入的非特異性產(chǎn)物；

6.通過PCR引入Ion Torrent Proton測序接頭序列

7.文庫檢測

使用安捷倫2100Bioanalyzer檢測插入片段大??；

使用qPCR定量檢測文庫產(chǎn)量。

下面將結合實施例進一步說明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明中沒有詳細描述的技術手段可以采用本領域的常規(guī)技術手段實現(xiàn)。

實施例1

非小細胞肺癌患者FFPE融合陽性樣本3例，樣品名稱、融合基因及類型、提取量及使用量見表2。

表2

1.DNA的片段化

使用超聲波破碎儀(Covaris LE220R)將目標DNA及摻入的Carrier RNA(500ng)按照特定的打斷參數(shù)進行DNA的片段化，Covaris LE220R的打斷參數(shù)設置如表1。

打斷后的DNA經(jīng)過1.8X的AMPure XP磁珠純化后進行下一步操作。

2.末端修復及3’端加A堿基

參照表3配比準備反應混合液，用槍輕柔地上下吹吸混勻。

表3

放入PCR儀，按表4設置程序進行反應(蓋溫設為70℃，前30min不蓋熱蓋，溫度到達65℃，立即蓋上熱蓋)。

表4

3.接頭連接

按照表5的配比準備反應混合液，用槍輕柔地上下吹吸混勻。

表5

分為2管，每管55ul，放于PCR儀上，20℃反應15min，關閉熱蓋。反應結束后，使用0.8X的AMPure XP磁珠純化DNA樣本。

4.PCR擴增

按照表6的配比準備反應混合液，用槍輕柔地上下吹吸混勻。

表6

放入PCR儀，按表7設置程序反應.。

表7

用1.8X的AMPure XP磁珠對擴增產(chǎn)物進行純化，最后將文庫溶于30ul NF-water中。將純化產(chǎn)物進行Qubit定量

5.文庫雜交

5.1將文庫按照上一步的濃度值，取600-700ng置于濃縮儀中蒸干至10ul，溫度設置為45℃，一般需要15-20min左右。

5.2向濃縮完畢的樣品中加入加入5ul的QXT快速封閉混合液以及各1ul的P5/P7接頭封閉試劑(150uM)，用移液器吹打混勻后短暫離心，進行下一步。

5.3后續(xù)雜交和捕獲方法參照安捷倫公司SureSeclect^QXT試劑盒雜交捕獲方法。按照表8的反應程序雜交2h，在第三步時暫停，用以加入探針。使用DynabeadsMyone Streptavidin T1(鏈霉親和素T1)磁珠進行捕獲，采用洗脫液1(SureSelect Wash1)洗脫一遍，洗脫液2(SureSelect Wash2)洗脫三遍。

表8

6.捕獲后文庫PCR擴增引入Ion Torrent Proton測序接頭序列

按照表9配置反應液，用槍輕柔地上下吹吸混勻。

表9

注：A端含有barcode的引物*中的*為代表不同barcode序列，Universal Primer P與Barcode Primer A*的序列信息見表3.

放入PCR儀，按表10設置程序進行反應。

表10

用1.8X的AMPure XP磁珠對擴增產(chǎn)物進行純化，最后將文庫溶于20ul NF-water中。將純化產(chǎn)物進行Qubit精確定量。

表9中的引物具體信息見表10。

表10

注：X為barcode序列，對應的barcode 1-12號的序列見表11。

表11

7.文庫檢測

將步驟6中的純化產(chǎn)物稀釋到2ng/ul，取出1ul進行安捷倫2100Bioanalyzer(美國安捷倫公司)檢測，構建的文庫總長度在300bp左右；另外，再取出1ul用于qPCR檢測，根據(jù)檢測結果決定上機濃度。

根據(jù)上步所得的濃度，將文庫稀釋到上機要求后，在Ion Torrent的Proton測序平臺上進行測序，產(chǎn)生400M數(shù)據(jù)。

8.下機數(shù)據(jù)分析結果

數(shù)據(jù)下機后，過濾掉含“N”的reads與低質(zhì)量reads(本領域常規(guī)參數(shù)設置即可)后，采用BWA軟件進行序列比對產(chǎn)生bam文件，再采用IGV軟件進行軟截斷reads查看。最終確定樣本是否發(fā)生了融合及融合發(fā)生的位置。表12反映了本實施例中三個樣本的融合檢測結果，可見本方法可以準確的檢測出陽性樣本中的融合基因及融合類型。圖2-1到4-2為每個樣本的IGV查看結果。

表12

圖2-1到4-2是采用IGV軟件對以上融合基因檢測的圖形化結果，例如圖2-1和2-2展示的是XHC樣本的檢測結果，從圖可以看出，RET基因和CCDC6兩個基因都有若干序列有一部分比對不上，產(chǎn)生softclip序列，這些softclip序列都能比對上對方基因的參考序列。所以判斷為CCDC6-RET的基因融合(圖2-1到4-2用于顯示序列的比對情況，而非具體的序列)。

從以上的描述中，可以看出，本發(fā)明上述的實施例實現(xiàn)了如下技術效果：

采用本發(fā)明提供的文庫構建方法，可以準確的在DNA水平檢測基因融合，這與現(xiàn)有的Ion Torrent建庫方法相比，有以下優(yōu)點：

1)應用本發(fā)明的技術方案，Ion Torrent測序平臺結合液相雜交捕獲技術，基于目標區(qū)域捕獲平臺的探針雜交捕獲融合基因及伴侶基因的DNA片段，然后用Ion Torrent測序平臺測序，解決了現(xiàn)有技術中Ion Torrent測序平臺因RNA樣本不合格導致無法檢測基因融合及無法檢測未知融合斷點的融合類型問題。并且可以將單核苷酸突變(SNV)、插入缺失(indel)及拷貝數(shù)變異(CNV)共同設計進入雜交捕獲的panel中，因此可以在不提取RNA的條件下同時檢測四種常見的變異類型。而常規(guī)的Ion Ampliseq^TM技術必須通過兩個文庫(DNA文庫和RNA文庫)才能完全檢測以上四種變異類型，并且在RNA提取不成功時無法檢測基因融合；

2)可以檢測未知類型融合了。本方法由于采用了液相探針雜交捕獲的方法進行融合基因的檢測，由于探針捕獲的特點，可以檢測融合基因的未知融合類型。而常規(guī)的Ion Ampliseq^TM技術只能根據(jù)已知的融合類型設計擴增引物，不能檢測未知融合斷點的基因融合；

3)本方法將液相雜交捕獲技術應用在Ion Torrent測序平臺，結合了Ion Torrent測序平臺的測序快的特點(大約3個小時即可完成測序)，大大縮短了檢測的時間。

本發(fā)明針對于Ion Torrent測序平臺的文庫構建方法，可以在基因組層面(DNA水平)上檢測驅動基因的融合以及融合基因發(fā)生的位置和形式，從而指導靶向用藥治療。檢測的融合基因包括但不限于ALK，RET，ROS1等基因。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。