本申請涉及基因突變檢測領域，具體講，涉及一種檢測人JAK2基因突變的PCR試劑盒。
背景技術：
：JAK家族是一類非受體型酪氨酸蛋白激酶，包括JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4個成員。JAK2與信號轉導蛋白和轉錄激活物(signaltransducersandactivatorsoftranscription，STAT)家族的多個成員共同構成了多條信號轉導途徑，能把細胞外信號與基因表達調(diào)控直接聯(lián)系起來，啟動相應基因的轉錄和表達，完成細胞因子受體如促紅細胞生成素受體和促血小板生成素受體介導的信號轉導過程，產(chǎn)生細胞增殖效應。此外，JAK2還介導粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素3以及生長因子等在內(nèi)的多種細胞因子的信號轉導，促進或調(diào)節(jié)細胞的增殖。骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferativeneoplasms，MPN)屬獲得性造血細胞克隆性疾病，是一種有不同血液學表現(xiàn)的綜合征，可以主要表現(xiàn)為一種、二種或多種骨髓細胞的過度增殖，在疾病的進展過程中各型之間可能發(fā)生轉換。2005年Baxter等首先報道了MPN患者中，JAK2基因第14號外顯子1849位核苷酸G→T突變，導致JAK2氨基酸密碼子617位纈氨酸被苯丙氨酸替代，即JAK2V617F。在JAK2的結構中，JAK同源結構域1(JAKhomologydomain1，JH1)為激酶域；而V617F位于與JH1相鄰的JH2，后者為假激酶域，與JH1結合并抑制其激活。V617F突變使JH2失去了對JH1激酶活性的抑制作用，導致了JAK2的持續(xù)活化。此突變體作為一種組成性激活的酪氨酸激酶，在缺乏細胞因子的條件下可以自發(fā)激活自身和細胞因子受體，進而激活信號轉導和轉錄活化因子5等下游信號轉導通路。研究表明，JAK2(V617F)突變體在真性紅細胞增多癥(PV)、原發(fā)性血小板增多癥(ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(IMF)中的發(fā)生率分別高達81％～99％、41％～72％、39％～57％。在難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細胞伴顯著血小板增多者中的檢出率為40％～50％，在核心結合因子相關性急性髓系白血病中的檢出率為3.5％等，但至今尚無淋巴細胞疾病、實體腫瘤或繼發(fā)性骨髓增殖性病變中出現(xiàn)JAK2(V617F)突變的報道。因此，認為該突變可用于對骨髓增殖性腫瘤(MPN)患者的鑒別診斷。MPN傳統(tǒng)的治療手段包括減輕癥狀、預防血栓形成等并發(fā)癥、物理方法去除增多的血細胞、抑制血細胞增殖以及造血干細胞移植等。近年來以JAK2V617F突變?yōu)榘悬c的藥物研究為MPN的治療帶來了新的希望。Pardanani等發(fā)現(xiàn)應用JAK2激酶選擇性抑制劑TG101209可抑制與JAK2V617F相關MPNs細胞的酪氨酸激酶活性，引起JAK2V617F、STAT3、STAT5的磷酸化受抑制，并且在裸鼠模型中顯示出一定療效。Tyler等、Geron等的研究顯示，JAK2激酶選擇性抑制劑TG101209和TG101348可分別在納摩爾水平抑制攜帶JAK2V617F細胞的生長，納摩爾濃度的抑制劑對含有突變基因的內(nèi)源性紅系集落具有生長抑制作用。研究也提示JAK2(V617F)的突變負荷有助于提示疾病的嚴重程度，因此隨著JAK2V617F突變?yōu)榘悬c的藥物研究為MPN的治療嘗試的不斷深入，對JAK2(V617F)突變進行定量檢測，不僅有助于臨床診斷，同時對突變負荷數(shù)的分析還能有助于判斷疾病的程度及監(jiān)測微小殘留病變。鑒于此，特提出本申請。技術實現(xiàn)要素：本申請的發(fā)明目的在于提出一種檢測人JAK2基因突變的PCR試劑盒。為了完成本申請的目的，采用的技術方案為：本申請涉及一種檢測人JAK2基因突變的PCR試劑盒，所述試劑盒包括核酸擴增試劑、對照品和參考品，其中，所述核酸擴增試劑包括以下組分，具體如表1所示：表1：編號組份組份中的主要成分1JAK2-MPCRMIX1用于檢測突變型JAK2基因的引物和探針2JAK2-WPCRMIX1用于檢測野生型JAK2基因的引物和探針其中，用于檢測突變型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針；用于檢測野生型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有BHQ1。優(yōu)選的，所述核酸擴增試劑包括以下組分，具體如表2所示：表2：編號組份組份中的主要成分3內(nèi)控MIX內(nèi)控引物和探針，以及內(nèi)控質(zhì)粒DNA其中，所述內(nèi)控引物和探針中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探針；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端標記有ROX、3’端標記有BHQ2；所述內(nèi)控質(zhì)粒DNA中含有如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。優(yōu)選的，所述JAK2-MPCRMIX1中各成分的含量為：濃度為50μmol/L的引物0.15μl，濃度為50μmol/L的探針0.1μl；所述JAK2-WPCRMIX1中各成分的含量為：濃度為50μmol/L的引物0.15μl，濃度為50μmol/L的探針0.1μl。優(yōu)選的，所述核酸擴增試劑中還包括以下組分，具體如表3所示：表3：優(yōu)選的，所述PCRMIX3中含有：10×Buffer液2.5μl，100mmol/LdATP、100mmol/LdCTP、100mmol/LdGTP、100mmol/LdUTP各0.025μl、5U/μl的TaqDNA聚合酶0.2μl、1U/μl的UNG酶0.1μl。優(yōu)選的，所述對照品包括以下組分，具體如表4所示：表4：編號組分組分中的主要成分5陰性對照工藝用水6陽性對照質(zhì)?；旌弦簝?yōu)選的，所述質(zhì)粒混合液中含有：由SEQIDNO：8所示的突變質(zhì)粒DNA、由SEQIDNO：9所示的野生型質(zhì)粒DNA。優(yōu)選的，所述參考品包括以下組分，具體如表5所示：表5：編號組分組分中的主要成分7JAK2-M參考品1：1×106copies突變型質(zhì)粒DNA8JAK2-M參考品2：1×105copies突變型質(zhì)粒DNA9JAK2-M參考品3：1×104copies突變型質(zhì)粒DNA10JAK2-M參考品4：1×103copies突變型質(zhì)粒DNA11JAK2-W參考品1：1×106copies野生型質(zhì)粒DNA12JAK2-W參考品2：1×105copies野生型質(zhì)粒DNA13JAK2-W參考品3：1×104copies野生型質(zhì)粒DNA14JAK2-W參考品4：1×103copies野生型質(zhì)粒DNA本申請還涉及一種檢測人JAK2基因突變的引物和探針，所述引物和探針包括用于檢測突變型JAK2基因的引物和探針、用于檢測野生型JAK2基因的引物和探針和內(nèi)控引物和探針；所述用于檢測突變型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針：所述用于檢測野生型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針；所述內(nèi)控引物和探針中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探針；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有BHQ1；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端標記有ROX、3’端標記有BHQ2。本申請的技術方案至少具有以下有益的效果：本申請的試劑盒采用等位基因特異性擴增定量PCR技術技術，對骨髓增殖性腫瘤相關基因JAK2(V617F)突變進行定量檢測，從而輔助骨髓增殖性腫瘤臨床診斷并指導相關患者的治療和監(jiān)測，具有高特異性、準確性和高靈敏度。1、靈敏度高：FQ-PCR的敏感度通常達102copies，且線性范圍很寬。可在102～1010copies的范圍內(nèi)進行定量。2、特異性強：熒光探針和模板雜交的應用，并通過光電傳導系統(tǒng)直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果，故與傳統(tǒng)的PCR技術相比，特異性大為提高。3、穩(wěn)定性好：FQ-PCR結果相當穩(wěn)定。因為域值設置在指數(shù)擴增期，各反應組分濃度相對穩(wěn)定，CT值與熒光信號的對數(shù)呈線性關系。與終點法相比，能更精確地反映起始模板的拷貝數(shù)。4、污染?。阂话鉖CR產(chǎn)物需通過瓊脂糖凝膠電泳、溴化乙錠染色和紫外光進行觀察，或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染進行檢測，不僅需要多種儀器，而且費時費力，且染色劑溴化乙錠對人體又有害，這些繁雜的實驗過程給污染和假陽性提供了機會。而本公司設計的試劑盒，采用熒光定量PCR，操作簡便、省時、減少污染，避免了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端。下面結合具體實施例，進一步闡述本申請。應理解，這些實施例僅用于說明本申請而不用于限制本申請的范圍。具體實施方式等位基因特異型擴增法(AlleleSpecificAmplification，ASA)建立于1989年，是PCR技術應用的發(fā)展，也稱擴增阻礙突變系統(tǒng)(AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS)、等位基因特性PCR(AlleleSpecificPCR，ASPCR)等。ASA主要用于對已知突變基因進行檢測。首先設計兩個5’端引物，一個與野生型DNA互補，對于純合性突變，分別加入這兩種引物及3’端引物進行兩個平行PCR，只有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產(chǎn)物，如果錯配位于引物的3’端則導致PCR不能延伸。隨著熒光定量PCR技術的發(fā)展，將ASA和熒光定量PCR結合起來，形成了等位基因特異性擴增定量PCR技術，利用ARMS引物對突變靶序列進行特異性PCR擴增，利用Taqman探針對擴增產(chǎn)物進行檢測，在實時PCR基礎上鑒定特定突變。通過比較野生型引物和突變型引物擴增的CT值，即可得知擴增樣本中的突變情況。如果目標位點是野生型，則野生型引物的擴增效率高于突變型引物，野生型引物擴增的CT值值較??；如為突變型，則野生型引物擴增的CT值較大；若為雜合型，野生型引物和突變型引物擴增的CT值十分接近。本申請的試劑盒由JAK2(V617F)基因特異性引物、熒光探針以及Taq酶等成份組成，采用PCR體外擴增的方法，利用實時熒光Taqman探針法，對人外周血或骨髓基因組DNA中JAK2(V617F)基因進行定量檢測。通過比較野生型和突變型的百分比變化，判斷樣本中JAK2(V617F)基因突變的含量。采用兩套參考品標準曲線進行分別定量以達到精準比值。本申請試劑盒對骨髓增殖性腫瘤相關基因JAK2(V617F)突變進行定量檢測，從而輔助骨髓增殖性腫瘤臨床診斷并指導相關患者的治療和監(jiān)測。本申請的試劑盒能檢出在25ng人基因組DNA的背景下含0.1％的JAK2基因V617F突變。本申請的檢測人JAK2基因突變的PCR試劑盒，包括核酸擴增試劑、對照品和參考品，其中，核酸擴增試劑具體如表6所示：表6：其中，用于檢測突變型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針；用于檢測野生型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有BHQ1。內(nèi)控引物和探針中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探針；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端標記有ROX、3’端標記有BHQ2；內(nèi)控質(zhì)粒DNA中含有如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。具體的，引物和探針的核苷酸序列具體如表7所示：表7：本申請的試劑盒中還含有對照品和質(zhì)控品，具體如表8所示：表8：編號組分組分中的主要成分5陰性對照工藝用水6陽性對照質(zhì)粒混合液7JAK2-M參考品1：1×106copies突變型質(zhì)粒DNA8JAK2-M參考品2：1×105copies突變型質(zhì)粒DNA9JAK2-M參考品3：1×104copies突變型質(zhì)粒DNA10JAK2-M參考品4：1×103copies突變型質(zhì)粒DNA11JAK2-W參考品1：1×106copies野生型質(zhì)粒DNA12JAK2-W參考品2：1×105copies野生型質(zhì)粒DNA13JAK2-W參考品3：1×104copies野生型質(zhì)粒DNA14JAK2-W參考品4：1×103copies野生型質(zhì)粒DNA其中，質(zhì)?；旌弦褐泻校河蒘EQIDNO：8所示的突變型質(zhì)粒DNA、由SEQIDNO：9所示的野生型質(zhì)粒DNA；JAK2-M參考品1～4中含有由SEQIDNO：8所示的突變型質(zhì)粒DNA，JAK2-W參考品1～4中含有由SEQIDNO：9所示的野生型質(zhì)粒DNA。本申請還涉及檢測人JAK2基因突變的引物和探針，引物和探針的序列為：用于檢測突變型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：2所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針；用于檢測野生型JAK2基因的引物和探針中含有由SEQIDNO：1所示的上游引物，由SEQIDNO：3所示的下游引物，由SEQIDNO：4所示的探針；內(nèi)控引物和探針中含有由SEQIDNO：5所示的上游引物，由SEQIDNO：6所示的下游引物，由SEQIDNO：7所示的探針；SEQIDNO：4所示核苷酸序列的5’端標記有FAM、3’端標記有BHQ1；SEQIDNO：7所示核苷酸序列的5’端標記有ROX、3’端標記有BHQ2。本申請試劑盒的使用方法為：1、樣本處理：進行核酸提取(推薦使用商業(yè)化的試劑盒來提取DNA)，陰性對照與標本同時處理。提取完的核酸建議立即進行檢測，否則請于-20℃以下保存。2、擴增試劑準備：從試劑盒中取出JAK2-MPCRMIX1、JAK2-WPCRMIX1、內(nèi)控MIX以及PCRMIX3，室溫融化并混勻后，2000rpm離心10s。模板PCR反應液體系1人份均按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3+1μl內(nèi)控MIX(PCR管數(shù)應為樣本數(shù)、1個陰性對照及1個陽性對照之和)，將上述配制好的模板PCR預混液，分別按每管21μl的量，分裝于各PCR管內(nèi)。參考品PCR反應液體系1人份按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3(PCR管數(shù)應為4個參考品)，將上述配制好的參考品PCR預混液，分別按每管20μl的量，分裝于各PCR管內(nèi)。3、加樣：取出試劑盒中對照品、兩組參考品以及樣本處理液，室溫融化并混勻后，2000rpm離心10s。分別加至裝有上述PCR預混液的PCR管中。每個反應體系的總體積為25μl。蓋緊PCR管蓋，2000rpm離心10s后，將其移至檢測擴增區(qū)，具體如表9所示：表9：4、PCR擴增：ABI7300、7500、VIIA7、Bio-RadCFX96、羅氏480熒光PCR檢測儀擴增條件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，15sec；60℃，60sec)10個循環(huán)；(94℃，15sec；60℃，60sec)30個循環(huán)，且在此PCR循環(huán)中的第二步60℃時收集熒光信號，檢測雙通道為：FAM-TAMRA。ROX-none，參比熒光設定為none。反應體系為25μl。StratageneMx3000P、StratageneMx3005P、熒光PCR檢測儀擴增條件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，45sec；60℃，80sec)10個循環(huán)；(94℃，45sec；60℃，80sec)30個循環(huán)，且在此PCR循環(huán)中的第二步60℃時收集熒光信號，檢測雙通道為：FAM，ROX；參比熒光設定為none。反應體系為25μl。5、檢測：(1)基線的確定：選擇熒光曲線波動較小，較穩(wěn)定的那段作為基線，用戶可根據(jù)實際情況自行酌情調(diào)整。起點設在信號已經(jīng)降到背景高度且能維持平穩(wěn)的地方，終點要避免覆蓋信號已經(jīng)開始有明顯增長的地方。(2)閾值的確定：在陰性對照無擴增的情況下，閾值設定在無擴增曲線樣本的最高點，即高于無擴增增長曲線(即在結果分析“Component”欄中無柺點出現(xiàn))的最高點，且陰性對照未檢出為原則，確定起始閾值。(3)計算機自動處理和分析數(shù)據(jù)。6、檢測結果分析：(1)JAK2V617F突變百分比的計算方式：JAK2-M參考品1～4和JAK2-W參考品1～4分別設定為：1×106、1×105、1×104、1×103copies，在擴增結束后，由獲得的相應兩條標準曲線，分別得到每個樣本JAK2基因V617F突變型的檢測濃度(A)和JAK2基因野生型的檢測濃度(B)。計算公式：JAK2V617F突變百分比＝[A/(A+B)]×100％(2)有效性判定：兩套參考品中的各個參考品均應CT值＜28，且每組參考品應分別滿足標準曲線擬合度的絕對值≥0.980。陰性對照JAK2-MPCRMIX1和JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道CT值≥28或顯示“Undet”，且ROX通道CT值＜28；JAK2-M陽性對照JAK2V617F突變百分比＞0.1％；待測樣品中任何一個反應液的FAM或ROX通道必須至少有一個信號升起，否則提示加入的DNA質(zhì)量不佳或者含有PCR抑制劑，需要重新提取DNA后或重新取樣后再做。(3)結果判定：A.當JAK2-MPCRMIX1和JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道CT值＜28時：(a)若樣本的JAK2V617F％≤0.1％，則判定JAK2基因無V617F突變或低于最低檢測極限。(b)若樣本的JAK2V617F％≥1％，則判定JAK2基因有V617F突變。(c)若樣本的JAK2V617F％在0.1％～1％之間，則判定JAK2基因有微量V617F突變。注：JAK2-MPCRMIX1和JAK2-WPCRMIX1檢測濃度A、B均在5×106copies～5×102copies的線性范圍內(nèi)，定量結果由標準曲線得到相應濃度后按JAK2V617F突變百分比的計算公式獲得相應JAK2V617F突變百分比例。B.若待測樣品中JAK2-MPCRMIX1中的FAM通道CT值＜28，且JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道的CT值≥28或顯示“Undet”，則判定JAK2基因有V617F突變。C.若待測樣品中JAK2-MPCRMIX1中的FAM通道CT值≥28或顯示“Undet”，且JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道CT值≤18，則判定JAK2基因無V617F突變或低于最低檢測極限；若待測樣品中JAK2-MPCRMIX1中的FAM通道的CT值≥28或顯示“Undet”，且JAK2-WPCRMIX1中的FAM通道的CT值＞18，則提示加入的DNA質(zhì)量不佳或者含有PCR抑制劑，需要重新提取DNA后或重新取樣后再做。實施例1一種檢測人基因突變的PCR試劑盒，其組成如表10所示：表10：本實施例PCR試劑盒各組分的包裝及含量如表11所示：表11：實施例2：樣本線性和參考品線性檢測(一)樣本線性1、準備線性質(zhì)控品選取已確定濃度的JAK2V617突變型的JAK2-M質(zhì)粒DNA和野生型的JAK2-W質(zhì)粒DNA各100μl，制成高濃度樣本(L0)，上述兩個樣本按進入反應體系DNA模板數(shù)計分別為5×106copies，并以此作為本申請實施例1試劑盒的樣本線性質(zhì)控品L0，然后用工藝用水以1：10梯度將L0樣本進行系列稀釋，分別得到兩組線性質(zhì)控品L0、L1、L2、L3和L4。具體如表12和表13所示：表12：表13：2、擴增試劑準備：從試劑盒中取出JAK2-MPCRMIX1、JAK2-WPCRMIX1、內(nèi)控MIX以及PCRMIX3，室溫融化并混勻后，2000rpm離心10s。模板PCR反應液體系1人份均按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3+1μl內(nèi)控MIX(PCR管數(shù)應為樣本數(shù)、1個陰性對照及1個陽性對照之和)，將上述配制好的模板PCR預混液，分別按每管21μl的量，分裝于各PCR管內(nèi)。參考品PCR反應液體系1人份按如下配制：7μlPCRMIX1+13μlPCRMIX3(PCR管數(shù)應為4個參考品)，將上述配制好的參考品PCR預混液，分別按每管20μl的量，分裝于各PCR管內(nèi)。3、加樣：取出試劑盒中對照品、兩組參考品以及樣本處理液，室溫融化并混勻后，2000rpm離心10s。分別加至裝有上述PCR預混液的PCR管中。每個反應體系的總體積為25μl。蓋緊PCR管蓋，2000rpm離心10s后，將其移至檢測擴增區(qū)。4、PCR擴增：ABI7300、7500、VIIA7、Bio-RadCFX96、羅氏480熒光PCR檢測儀擴增條件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，15sec；60℃，60sec)10個循環(huán)；(94℃，15sec；60℃，60sec)30個循環(huán)，且在此PCR循環(huán)中的第二步60℃時收集熒光信號，檢測雙通道為：FAM-TAMRA。ROX-none，參比熒光設定為none。反應體系為25μl。StratageneMx3000p、StratageneMx3005p、熒光PCR檢測儀擴增條件：42℃，5min；94℃，3min；(94℃，45sec；60℃，80sec)10個循環(huán)；(94℃，45sec；60℃，80sec)30個循環(huán)，且在此PCR循環(huán)中的第二步60℃時收集熒光信號，檢測雙通道為：FAM，ROX；參比熒光設定為none。反應體系為25μl。5、檢測并分析數(shù)據(jù)：檢測得到的實驗結果如表14所示。表14：檢測各相關樣本線性質(zhì)控品進入反應體系的模板數(shù)，以理論濃度的對數(shù)值為Y，實際檢測CT值為X進行線性擬合，計算其線性相關系數(shù)r，結果符合“線性相關系數(shù)|r|≥0.980”的要求。(二)試劑盒系列參考品線性按照上述方法測定本申請實施例1試劑盒中參考品的樣本線性，檢測得到的實驗結果如表15所示。表15：以參考品理論濃度的對數(shù)值為Y，實際檢測的CT值為X進行線性擬合，計算其線性相關系數(shù)r，結果符合“線性相關系數(shù)|r|≥0.980”的要求。實施例3：準確性檢測1、制備準確性質(zhì)控品選取檢定合格的JAK2V617F陽性的人外周血基因組DNA和人骨髓基因組DNA標本各兩份，組成本申請實施例1試劑盒的準確性質(zhì)控品，具體如表16所示：表16：編號標本種類JAK2-P1JAK2V617F陽性的人外周血基因組DNA，稀釋至5ng/ulJAK2-P2JAK2V617F陽性的人外周血基因組DNA，稀釋至5ng/ulJAK2-P3JAK2V617F陽性的人骨髓基因組DNA，稀釋至5ng/ulJAK2-P4JAK2V617F陽性的人骨髓基因組DNA，稀釋至5ng/ul2、其他步驟同實施例2；檢測得到的實驗結果如表17所示：表17：由表17的實驗結果可知，各準確性質(zhì)控品在相應的反應液中，檢測結果陽性符合率為100％。實施例4：分析特異性檢測1、制備分析特異性質(zhì)控品選取檢定合格的JAK2V617F陰性的人外周血基因組DNA和人骨髓基因組DNA標本各一份，組成本申請實施例1試劑盒的特異性質(zhì)控品，具體如表18所示：表18：編號標本種類JAK2-N1JAK2V617F陰性的人外周血基因組DNA，稀釋至5ng/μl；JAK2-N2JAK2V617F陰性的人骨髓基因組DNA，稀釋至5ng/μl。2、其他步驟同實施例2；檢測得到的實驗結果如表19所示：表19：由表19的實驗結果可知，各特異性質(zhì)控品在相應的反應液中，檢測結果陰性符合率為100％。實施例5：精密度檢測1、制備精密度質(zhì)控品選用JAK2V617F陽性的HEL細胞株基因組DNA和JAK2V617F陰性的K562細胞株基因組DNA按比例混合，作為本申請實施例1試劑盒的精密度質(zhì)控品，具體如表20所示；表20：2、其他步驟同實施例2；用相應的反應液重復檢測10次，檢測得到的實驗結果如表21和表22所示：表21：表22：由表21和表22的實驗結果可知，檢測結果均為JAK2基因V617F突變陽性且CT值的變異系數(shù)(CV，％)≤5％。實施例6：最低檢測量檢測1、制備最低檢測量質(zhì)控品選取JAK2V617F陽性的HEL細胞株基因組DNA和JAK2V617F陰性的K562細胞株基因組DNA按比例混合，總基因組DNA濃度為25ng/μl，突變比例為0.1％，作為本申請實施例1試劑盒的檢測限質(zhì)控品，具體如表23所示；表23：2、其他步驟同實施例2；檢測得到的實驗結果如表24所示：表24：由表24的實驗結果可知，檢測限質(zhì)控品在相應的反應液中，本申請試劑盒能檢出在25ng人基因組DNA的背景下含0.1％的JAK2基因V617F突變。本申請雖然以較佳實施例公開如上，但并不是用來限定權利要求，任何本領域技術人員在不脫離本申請構思的前提下，都可以做出若干可能的變動和修改，因此本申請的保護范圍應當以本申請權利要求所界定的范圍為準。當前第1頁1 2 3