本發(fā)明屬于生物和醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一個(gè)新化合物dichotocejpin A及其制備方法和在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)是一類能夠從含有α-糖苷鍵底物的非還原端催化水解α-葡萄糖基酶的總稱。它存在于人體小腸刷狀緣上，能夠催化碳水化合物非還原末端的α-1,4糖苷鍵水解并釋放出葡萄糖的酶，包括麥芽糖酶、異麥芽糖酶、蔗糖酶和海藻糖酶等。人體對淀粉、糊精、蔗糖等碳水化合物的利用吸收依賴于小腸刷狀緣上該酶的活性(Asano N.et al.1997)，因此，α-葡萄糖苷酶抑制劑如阿卡波糖具有明確的降低餐后血糖的作用，尋找具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物，也是尋找具有治療糖尿病藥物的重要研究熱點(diǎn)之一(Xiao S.Z.et al.1999)。

海洋擁有特殊的環(huán)境，像高鹽、弱堿性、低營養(yǎng)、缺氧等，棲息于海洋環(huán)境的海洋微生物為了適應(yīng)這些特殊環(huán)境，產(chǎn)生了獨(dú)特的代謝途徑，由此能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)特異、生物活性特殊的次級代謝產(chǎn)物。近年來從海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了大量結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的化合物，如生物堿類、萜類、聚酮類等(Blunt J.W.et al.2015；Yang J.G.et al.2013)。目前，海洋微生物已經(jīng)成為天然產(chǎn)物研究的重要資源。與其它海洋微生物相比，海洋真菌來源的次生代謝產(chǎn)物不僅數(shù)量占到整個(gè)海洋微生物的一半左右，還具有產(chǎn)量大、結(jié)構(gòu)和活性多樣豐富等優(yōu)勢，已經(jīng)成為目前海洋微生物的研究熱點(diǎn)(Bugni T.S.et al.2013；Saleem M.et al.2013；Rateb M.E.2011；Blunt J.W.et al.2013)。

深海真菌Dichotomomyces cejpii FS110于2011年9月從南海(18°44.606′N,119°44.263′E)水深3739米處海底表層沉積物中分離得到。本發(fā)明的前期研究表明(楊小嵐.et al.2014)，深海真菌Dichotomomyces cejpii FS110的發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物具有很好的生物活性，因此我們對該深海真菌次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了深入的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性的化合物dichotocejpin A。

本發(fā)明中化合物dichotocejpin A，其特征在于，結(jié)構(gòu)如式(I)所示：

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種化合物dichotocejpin A制備方法，其特征在于，所述的化合物dichotocejpin A是從Dichotomomyces cejpii FS110的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備得到。

優(yōu)選，具體步驟如下：

制備Dichotomomyces cejpii FS110的發(fā)酵培養(yǎng)物，將發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層經(jīng)濃縮后得到浸膏；

將浸膏用石油醚-乙酸乙酯從30:1,20:1,10:1,7:1,9:2,3:1,2:1v/v梯度洗脫，收集石油醚:乙酸乙酯＝2:1v/v洗脫下來的餾分F6，將此餾分經(jīng)純化后得到的化合物dichotocejpin A。

所述的純化是通過HPLC純化。

所述的制備Dichotomomyces cejpii FS110的發(fā)酵培養(yǎng)物優(yōu)選是將活化的Dichotomomyces cejpii FS110接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，120rpm，培養(yǎng)5d制得種子液，將種子液以體積比10％的接種量接入到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，120rpm，振蕩培養(yǎng)7d，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供Dichotomomyces cejpii FS110在制備化合物dichotocejpin A中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過酶抑制活性測試發(fā)現(xiàn)，化合物dichotocejpin A對α-葡萄糖苷酶的IC₅₀值為138μM，陽性對照藥物阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的IC₅₀值為463μM。結(jié)果表明：本發(fā)明的化合物dichotocejpin A具有顯著的α-葡萄糖苷酶抑制活性，能用于制備治療糖尿病的藥物。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供化合物dichotocejpin A在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用

所述的治療糖尿病的藥物優(yōu)選為對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性的藥物。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種治療糖尿病的藥物，其特征在于，含有化合物dichotocejpin A作為有效成分。

所述的治療糖尿病的藥物優(yōu)選為對α-葡萄糖苷酶具有抑制活性的藥物。

本發(fā)明從Dichotomomyces cejpii FS110的發(fā)酵培養(yǎng)物中制備分離得到一個(gè)新的化合物dichotocejpin A，該化合物對α-葡萄糖苷酶具有明顯的抑制活性，可為治療糖尿病的新藥研發(fā)提供化學(xué)實(shí)體。

本發(fā)明所涉及的Dichotomomyces cejpii FS110公開于文獻(xiàn)：楊小嵐,陳玉嬋,李浩華,章衛(wèi)民.23株海洋真菌的分子鑒定及其抗植物病原真菌和細(xì)胞毒活性研究，2014,8:132-137。該菌株保藏于微生物研究所，并保證自申請日起20年內(nèi)向公眾提供。

附圖說明：

圖1是化合物1的¹H-NMR譜；

圖2是化合物1的¹³C-NMR譜；

圖3是化合物1的DEPT 135譜；

圖4是化合物1的HSQC譜；

圖5是化合物1的HMBC譜；

圖6是化合物1的¹H-¹H COSY譜；

圖7是化合物1的HRESIMS譜；

圖8是化合物1的實(shí)驗(yàn)與計(jì)算的CD圖譜。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1：

將活化的Dichotomomyces cejpii FS110接入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，120rpm，培養(yǎng)5d制得種子液，將種子液以體積比10％的接種量接入到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，28℃，120rpm，振蕩培養(yǎng)7d，而制得發(fā)酵培養(yǎng)物。將發(fā)酵培養(yǎng)物的發(fā)酵液和菌絲體分離，發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層經(jīng)濃縮后得到浸膏；浸膏先用石油醚-乙酸乙酯從30:1,20:1,10:1,7:1,9:2,3:1,2:1,1:1,1:2v/v梯度洗脫，再用乙酸乙酯洗脫，最后用二氯甲烷:甲醇＝5:1v/v洗脫，收集石油醚：乙酸乙酯＝2:1v/v洗脫下來的餾分F6，將此餾分進(jìn)行經(jīng)反相制備HPLC(YMC-pack ODS-A柱，250×20mm，5μm，12nm，MeOH/H₂O，20:80→50:50v/v，10mL/min)得F6.2(t_R＝34min)，F(xiàn)6.2經(jīng)正相制備HPLC(YMC-pack SIL柱，250×20mm，5μm，12nm，n-hexane/EtOAc，50:50v/v，10mL/min)得化合物1(1.4mg,t_R＝17min)。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基，每升是這樣配置的：將200g馬鈴薯切成小塊，加水加熱煮爛，用紗布過濾，濾液中加入20g葡萄糖，攪拌均勻，稍冷后再補(bǔ)足水至1L，滅菌備用。

化合物1經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振波譜分析(如圖1-7所示)，其結(jié)構(gòu)鑒定如下：

化合物1具有以下理化和波譜特性：淡黃色固體；UV(MeOH)λ_max(logε)207(4.37),244(4.34),296(4.15)nm；IRν_max 3372,2955,2922,2853,1709,1636,1587,1429,1391,1358,1259,1026cm^–1。HRESIMS m/z 291.0798[M+H]⁺(C₁₄H₁₅N₂O₃S,calcd for 291.0803)。¹H-NMR(500MHz,CDCl₃)δ:8.44(1H,dt，J＝8.3,1.0Hz,H-6),7.47(1H,ddd,J＝8.3,7.2,1.0Hz,H-7),7.42(1H,dt,J＝8.0,1.0Hz,H-9),7.26(1H,ddd,J＝8.0,7.2,1.0Hz,H-8),7.30(1H,d,J＝0.8Hz,H-10),4.46(1H,dd,J＝12.0,7.8Hz,H-3a),4.08(1H,dd,J＝12.0,4.8Hz,H-3a),3.32(3H,s,H₃C-N),1.90(3H,s,H₃C-S),3.39(1H,t,HO-3a)。¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:163.5(C-4),158.0(C-1),134.9(C-9a),129.1(C-5a),128.3(C-7),127.4(C-10a),125.9(C-8),122.8(C-9),116.9(C-6),115.1(C-10),76.7(C-3),64.2(C-3a),28.2(C-N),12.2(C-S)。實(shí)驗(yàn)的CD譜數(shù)據(jù)顯示該化合物1在300和237nm顯示正的Cotton效應(yīng)，在254nm顯示負(fù)的Cotton效應(yīng)，與計(jì)算的3R構(gòu)型的CD數(shù)據(jù)一致(如圖8)，因此，確定該化合物1的絕對構(gòu)型為3R。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，該化合物1為新化合物，命名為dichotocejpin A，具體結(jié)構(gòu)如式(I)中所示。

實(shí)施例2：

采用pNPG法測試化合物dichotocejpin A的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1、實(shí)驗(yàn)方法：酶液的制備：將α-葡萄糖苷酶凍干粉用PH7.0的0.1mol/L含0.2％BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成0.2U/mL的工作液，分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

底物(PNPG)的配制：PNPG用PH7.0的0.1mol/L PBS配制成10mmol/L的工作液。

待測樣品的制備：化合物dichotocejpin A均用DMSO溶解，配制成濃度為100mmol/L的儲(chǔ)存液，用PBS稀釋成所需濃度的工作液。

取20μL稀釋好的化合物dichotocejpin A溶液與20μL 0.2U/mLα-葡萄糖苷酶溶液、140μL PH 7.0的0.1mol/L PBS混合，37℃孵育10min，加入20μL 10mM PNPG，37℃反應(yīng)15min，再加入30μL 3％SDS終止反應(yīng)，405nm處測定吸光度值(A)。以上反應(yīng)在96孔板上完成，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以阿卡波糖為陽性對照，同時(shí)設(shè)：

陰性對照組＝160μL PBS+20μL酶液+20μL底物；

樣品背景組＝20μL樣品+20μL酶液+160μL PBS；

空白對照組＝160μL PBS+20μL酶液。

用以下公式計(jì)算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率：

抑制率(％)＝(1-(A_樣品-A_樣品背景)/(A_陰性對照-A_空白對照))×100％

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：化合物dichotocejpin A對α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC₅₀值為138μM，而陽性對照藥物阿卡波糖的IC₅₀值為463μM。結(jié)果表明：本發(fā)明的化合物dichotocejpin A具有顯著的α-萄糖苷酶抑制活性，因此，本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)為研究與開發(fā)新的治療糖尿病的藥物提供了候選化合物，為開發(fā)利用海洋真菌資源提供了科學(xué)依據(jù)。