本發(fā)明涉及細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種基于臨床應(yīng)用的黑素細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

白癜風(fēng)(vitiligo)是一種常見的局部或泛發(fā)的色素脫失性皮膚病，該病發(fā)病率約為0.5-1％，與遺傳、免疫、氧化應(yīng)激失衡等因素有關(guān)系，目前對(duì)于其發(fā)病機(jī)制的研究?jī)A向于認(rèn)為以上綜合性的因素引起的黑素細(xì)胞被破壞，從而引起的色素脫失，及白斑形成。該病治療方法很多，如藥物、激光、手術(shù)等，但療效均不確切。

傳統(tǒng)的治療手段包括內(nèi)服藥物、外用糖皮質(zhì)激素、紫外線照射以及外科手術(shù)治療等。但藥物治療和紫外線照射的治愈率有限。

外科手術(shù)治療方法主要包括自體表皮移植、表皮細(xì)胞懸液移植以及培養(yǎng)的自體黑素細(xì)胞移植等。

這些治療方法證實(shí)是有效的，但表皮移植需大面積取皮，不適合大面積移植。黑素細(xì)胞懸液移植是近年來發(fā)展的新療法，但需要短時(shí)間內(nèi)在體外大量擴(kuò)增高純度的黑素細(xì)胞。

為此，前人設(shè)計(jì)了多種適合黑素細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基和純化方法，包括使用含有高濃度胎牛血清的培養(yǎng)基促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、使用細(xì)胞分裂促進(jìn)劑佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)促進(jìn)黑素細(xì)胞增殖、以及使用基因素(geneticin)選擇性去除非黑素細(xì)胞等。

這些方法存在潛在的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)：胎牛血清可能含有瘋牛病病毒，化學(xué)物質(zhì)TPA和基因素具有一定的致癌性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中，黑素細(xì)胞的臨床應(yīng)用安全性不足的問題。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的而采用的技術(shù)方案是這樣的，一種基于臨床應(yīng)用的黑素細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)取健康人群外科手術(shù)后1小時(shí)內(nèi)丟棄的皮膚作為材料；將材料置于無菌平衡鹽溶液中，修剪掉血塊和皮下脂肪；

2)將步驟1)中得到的經(jīng)過修剪后的材料使用無菌平衡鹽溶液進(jìn)行漂洗1～3次；

3)將步驟2)中得到的經(jīng)過漂洗后的材料剪成2mm寬的長(zhǎng)條；將修剪成長(zhǎng)條狀的材料置入濃度為0.25％的EDTA中，在4℃條件下消化8～12小時(shí)；

4)將步驟3)中得到的消化后的材料通過鑷子分離表皮和真皮，取表皮，將表皮通過無菌平衡鹽溶液進(jìn)行漂洗3次；

5)將步驟4)中得到的表皮剪成若干個(gè)2mm×2mm的片狀結(jié)構(gòu)；將片狀結(jié)構(gòu)置于濃度為0.25％的TrypLE^TM中(ThermoFisher Scientific 12563029)，在37℃條件下消化20min，得到混合物A；

6)向混合物A中加入無菌平衡鹽溶液，得到細(xì)胞懸液；所述無菌平衡鹽溶液的體積是混合物A的兩倍；

7)將步驟6)中得到的細(xì)胞懸液通過200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，離心，收集沉淀；

8)將步驟7)中收集到的沉淀重懸于黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中；

9)將步驟8)中的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度調(diào)整至1×10⁵個(gè)/mL后，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中；

10)將步驟9)中的培養(yǎng)瓶置于37℃條件下，濃度為5％的CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，6h后更換培養(yǎng)基去除未貼壁細(xì)胞；

11)待步驟10)中經(jīng)過更換培養(yǎng)基后的細(xì)胞長(zhǎng)至80％滿時(shí)，將細(xì)胞置于濃度為0.25％的TrypLE^TM中，消化3～10分鐘，得到分離純化后的黑素細(xì)胞；

12)將步驟11)中得到的分離純化后的黑素細(xì)胞，按照1︰2～1︰3進(jìn)行接種，傳代培養(yǎng)；

13)待步驟12)中得到的分離純化后的細(xì)胞生長(zhǎng)至足夠臨床移植后，留存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步，所述步驟5)和步驟12)中采用的TrypLE^TM為植物來源的細(xì)胞消化液。

進(jìn)一步，所述步驟7)中的離心過程的離心速率為1000rpm，離心時(shí)間為3min。

進(jìn)一步，所述步驟12)中采用差速消化的方法進(jìn)行分離純化黑素細(xì)胞。

進(jìn)一步，所述步驟8)中的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基配方包括市售的黑素細(xì)胞基本培養(yǎng)液Medium 254、市售的生長(zhǎng)成分HMGS-2、全反式維甲酸、2-巰基乙醇、維生素C、青霉素和鏈霉素；

其中，市售的黑素細(xì)胞基本培養(yǎng)液Medium 254的體積為1L；

所述市售的生長(zhǎng)成分HMGS-2在培養(yǎng)基中的體積配比為0.5～5％；

所述全反式維甲酸在培養(yǎng)基中的終濃度為1～1000nM；

所述2-巰基乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度為1～1000nM；

所述維生素C在培養(yǎng)基中的終濃度為2～2000nM；

所述青霉素在培養(yǎng)基中的體積配比為0.5～5％；

所述鏈霉素在培養(yǎng)基中的體積配比為0.5～5％；

進(jìn)一步，所述步驟1)～13)制得的黑素細(xì)胞在制備白癜風(fēng)藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)效果是毋庸置疑的，本發(fā)明具有以下效果：

1)本發(fā)明培養(yǎng)出的黑素細(xì)胞的純度較高、細(xì)胞活力強(qiáng)，能夠更好的應(yīng)用于移植治療色素減退或無色素性皮膚病患者。

2)本發(fā)明的培養(yǎng)基中僅含有低濃度的胎牛血清，并且培養(yǎng)過程不會(huì)帶入其他動(dòng)物來源的因素和/或有害性物質(zhì)的選擇培養(yǎng)方法。因而，本發(fā)明公開的方法降低了臨床應(yīng)用的風(fēng)險(xiǎn)。

附圖說明

圖1為體外培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞；

圖2為體外培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞的免疫熒光鑒定。

圖中，A：接種后6h換液，剛貼壁的黑素細(xì)胞；

B：培養(yǎng)3天后的黑素細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不應(yīng)該理解為本發(fā)明上述主題范圍僅限于下述實(shí)施例。在不脫離本發(fā)明上述技術(shù)思想的情況下，根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，做出各種替換和變更，均應(yīng)包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

一種基于臨床應(yīng)用的黑素細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)收取健康人群外科包皮環(huán)切手術(shù)后丟棄的皮膚作為材料；將材料置于無菌平衡鹽溶液中，修剪掉血塊和皮下脂肪；

2)將步驟1)中得到的經(jīng)過修剪后的材料使用無菌平衡鹽溶液進(jìn)行漂洗3次；

3)將步驟2)中得到的經(jīng)過漂洗后的材料剪成2mm寬的長(zhǎng)條；將修剪成長(zhǎng)條狀的材料置入濃度為0.25％EDTA(乙二胺四乙酸)中，在4℃條件下消化8小時(shí)；

4)將步驟3)中得到的消化后的材料通過鑷子分離表皮和真皮，取表皮，將表皮通過無菌平衡鹽溶液進(jìn)行漂洗3次；

5)將步驟4)中得到的表皮剪成若干個(gè)2mm×2mm的片狀結(jié)構(gòu)；將片狀結(jié)構(gòu)置于濃度為0.25％的TrypLE^TM(ThermoFisher Scientific 12563029)，在37℃條件下消化20min，得到混合物A；

6)向混合物A中加入無菌平衡鹽溶液，得到細(xì)胞懸液；所述無菌平衡鹽溶液的體積是混合物A的兩倍；

7)將步驟6)中得到的細(xì)胞懸液通過200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，離心，收集沉淀；所述離心過程的離心速率為1000rpm，離心時(shí)間為3min。

8)將步驟7)中收集到的沉淀重懸于黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中；

所述黑素細(xì)胞培養(yǎng)基配方包括市售的黑素細(xì)胞基本培養(yǎng)液Medium 254、市售的生長(zhǎng)成分HMGS-2、全反式維甲酸、2-巰基乙醇、維生素C、青霉素和鏈霉素；

其中，市售的黑素細(xì)胞基本培養(yǎng)液Medium 254的體積為1L；

所述市售的生長(zhǎng)成分HMGS-2在培養(yǎng)基中的體積配比為0.5；

所述全反式維甲酸在培養(yǎng)基中的終濃度為1nM；

所述2-巰基乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度為1nM；

所述維生素C在培養(yǎng)基中的終濃度為2nM；

所述青霉素在培養(yǎng)基中的體積配比為0.5％；

9)將步驟8)中的黑素細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度調(diào)整至1×10⁵個(gè)/mL后，將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中；

10)將步驟9)中的培養(yǎng)瓶置于37℃條件下，濃度為5％的CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，6h后更換培養(yǎng)基去除未貼壁細(xì)胞；此時(shí)的細(xì)胞如圖1的A所示。

11)待步驟10)中經(jīng)過更換培養(yǎng)基后的細(xì)胞長(zhǎng)至80％滿時(shí)，將細(xì)胞置于濃度為0.25％的TrypLE^TM中，消化10分鐘，得到分離純化后的黑素細(xì)胞；

12)將步驟11)中得到的分離純化后的黑素細(xì)胞，按照1︰3進(jìn)行接種，傳代培養(yǎng)；13)將步驟12)中得到的分離純化后的細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，三天后細(xì)胞數(shù)量生長(zhǎng)至足夠臨床移植后，留存?zhèn)溆茫藭r(shí)的細(xì)胞如圖1中的B所示。

對(duì)培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，如圖2所示，所有細(xì)胞都表達(dá)黑素細(xì)胞特異性標(biāo)志物Mitf_M,Trp-1,Trp-2，說明成功培養(yǎng)出了純化的人黑素細(xì)胞。