本發(fā)明涉及DNA重組技術(shù)，具體是一種可誘導(dǎo)剔除選擇標(biāo)記基因的pBLCK載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

進(jìn)行植株轉(zhuǎn)基因操作后，利用選擇標(biāo)記基因進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)基因植株的篩選是一種非常有效的方法。研究者可從含有大量未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，或者從大量的未轉(zhuǎn)化植株中獲得遺傳轉(zhuǎn)化的植株。選擇標(biāo)記基因編碼的蛋白可賦予轉(zhuǎn)基因個(gè)體對(duì)抗生素或除草劑的抗性等性狀，但由于其會(huì)整合在轉(zhuǎn)基因植物的基因組中，會(huì)引發(fā)對(duì)環(huán)境安全和食品安全等的憂慮。因此，成功轉(zhuǎn)化目的基因后，去除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標(biāo)記基因，成為亟待解決的問題。

國內(nèi)外研究者開發(fā)了多種有效策略以獲得無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植株，其中主要包括利用生物安全標(biāo)記基因、無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和去除轉(zhuǎn)基因植株中選擇標(biāo)記基因等三種方法。但由于前兩種方法存在費(fèi)時(shí)低效的缺點(diǎn)，故去除選擇標(biāo)記基因技術(shù)成為培育清潔轉(zhuǎn)基因植株的重要途徑。采用的方法主要包括共轉(zhuǎn)化法、利用位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)、轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)或同源重組系統(tǒng)等。目前，特異位點(diǎn)重組系統(tǒng)因表現(xiàn)出較高的可控性，在轉(zhuǎn)基因研究中具有較好的前景。其中，Cre/loxP位點(diǎn)特性重組系統(tǒng)是重組酶系統(tǒng)中應(yīng)用較為廣泛和完善的方法，是研究領(lǐng)域內(nèi)的熱點(diǎn)。

1991年，Dale,E.C.等首次使用Cre/loxP特異性重組酶系統(tǒng)，通過Cre組酶對(duì)lox序列進(jìn)行切割和重新連接,介導(dǎo)lox序列發(fā)生特異性重組，將轉(zhuǎn)基因煙草中的選擇標(biāo)記基因HPT切除，切除效率達(dá)到90.9％。但同其它去除選擇標(biāo)記基因方法一樣，該方法存在選育過程復(fù)雜及周期過長的缺點(diǎn)。因此，研究者在此基礎(chǔ)上開發(fā)了誘導(dǎo)表達(dá)的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，利用環(huán)境因子誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制重組酶的表達(dá)。將目的基因、選擇標(biāo)記基因和重組酶基因轉(zhuǎn)入受體植株中，然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候誘導(dǎo)重組酶表達(dá)，剔除選擇標(biāo)記基因和重組酶基因本身。所采用的啟動(dòng)子包括熱激誘導(dǎo)和化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子。研究中也發(fā)現(xiàn)了該方法的一些缺點(diǎn),例如，重組酶表達(dá)元件和選擇標(biāo)記基因表達(dá)元件位于不同載體中，需要通過雜交或多次轉(zhuǎn)基因才能剔除選擇標(biāo)記基因，目的基因的啟動(dòng)子不適于在單子葉植物中表達(dá)等問題。因此，研究者需要構(gòu)建更加適宜的載體，采用適于單子葉植物中高效表達(dá)的啟動(dòng)子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是為了解決現(xiàn)有的剔除選擇標(biāo)記基因的方法需要通過雜交或多次轉(zhuǎn)基因才能將選擇標(biāo)記基因剔除，且目的基因的啟動(dòng)子不適于在單子葉植物中表達(dá)等問題，所提出的一種可誘導(dǎo)剔除選擇標(biāo)記基因的pBLCK載體及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明是按照以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種可誘導(dǎo)剔除選擇標(biāo)記基因的pBLCK載體，在pBRACT806載體上引入ubiquitin啟動(dòng)子序列、loxP序列、CRE-GR融合基因和NPTⅡ抗性基因。

所述pBLCK載體含有Gateway組件。

一種上述可誘導(dǎo)剔除選擇標(biāo)記基因的pBLCK載體的制備方法，包括以下步驟：

Ⅰ.基因片段的擴(kuò)增：分別以pCRE-GR質(zhì)粒、pBRACT 302質(zhì)粒、pBin19質(zhì)粒為模板，通過設(shè)計(jì)引物引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，PCR獲得NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ、AatⅡ-ubi-HindⅢ、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ基因片段；

Ⅱ.pEASY-ubi-NPTⅡ載體構(gòu)建：將步驟Ⅰ中獲得的目的片段通過多次酶切、連接、轉(zhuǎn)化分別連接到pEASY-ubi-loxP載體的NotⅠ和AatⅡ、AatⅡ和HindⅢ、HindⅢ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)之間，構(gòu)建具有l(wèi)oxP序列、CRE-GR融合基因、ubiquitin啟動(dòng)子序列和NPTⅡ抗性基因的克隆載體pEASY-ubi-NPTⅡ；

Ⅲ.pBLCK載體構(gòu)建：使用限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、KpnⅠ分別對(duì)pBract806和pEASY-ubi-NPTⅡ進(jìn)行酶切，并將二者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，即為pBLCK載體。

本發(fā)明獲得了如下有益效果：本發(fā)明有效的解決了現(xiàn)有的剔除選擇標(biāo)記基因的方法需要通過雜交或多次轉(zhuǎn)基因才能將選擇標(biāo)記基因剔除，且目的基因的啟動(dòng)子不適于在單子葉植物中表達(dá)等問題。本發(fā)明所構(gòu)建的載體含有Gateway組件，可進(jìn)行外源目標(biāo)基因的高效重組整合；具有NPTⅡ基因，利于轉(zhuǎn)基因植株的篩選；具有可誘導(dǎo)剔除外源基因的CRE-GR組件，可在目標(biāo)基因成功轉(zhuǎn)入植物體并施加糖皮質(zhì)激素類誘導(dǎo)物后，GR受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域作為“分子開關(guān)”變構(gòu)后可將重組酶轉(zhuǎn)至細(xì)胞核，剔除基因組中兩個(gè)loxP中間的序列，即抗性選擇標(biāo)記基因(NPT II)和重組酶基因表達(dá)元件序列，獲得清潔轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明所構(gòu)建的載體具有的另一個(gè)重要特性是，其目標(biāo)基因、CRE-GR融合基因和NPT II基因都在ubiquitin強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下，因而在農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因育種，尤其是單子葉植物轉(zhuǎn)基因材料的創(chuàng)制中具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是本發(fā)明NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ、AatⅡ-ubi-HindⅢ、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ目的片段PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是本發(fā)明pEASY-ubi-NPTⅡ載體菌落PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3是本發(fā)明pEASY-ubi-NPTⅡ載體圖譜；

圖4是本發(fā)明pBLCK載體圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

質(zhì)粒pBract806和pBract 302購自英國John Innes Centre，質(zhì)粒pBin19由本實(shí)驗(yàn)室保存(構(gòu)建方法參見Bevan M(1984)Binary Agrobacterium vectors for plant transformation.Nucleic Acids Research 12(22):8711-8721)，質(zhì)粒pCRE-GR來自美國康奈爾大學(xué)Silin Zhong博士惠贈(zèng)(構(gòu)建方法參見Brocard J,Feil R,Chambon P,Metzger D(1998)A chimeric Cre recombinase inducible by synthetic,but not by natural ligands of the glucocorticoid receptor.Nucleic Acids Research 26(17):4086-4090)，pEASY-ubi-loxP為本實(shí)驗(yàn)室人員楊文麗構(gòu)建完成(楊文麗，丁博，王俊斌，李明，呂芳芳，謝曉東.TA載體pEASY-T1Simple在基因克隆中的新應(yīng)用[J].天津農(nóng)學(xué)院，2011,18(2)：13-16.)。大腸桿菌(E.coli)DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司，大腸桿菌(E.coli)DB3.1購自英國John Innes Centre。感受態(tài)細(xì)胞制備方法參照李振宇等的方法(李振宇,徐開林,潘秀英,等.氯化銣法制備感受態(tài)細(xì)胞[J].徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,24(4):315-316.)。

1.2主要試劑和生物學(xué)軟件

限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、NotⅠ、AatⅡ、HindⅢ和KpnⅠ均購自Fermentas技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TaKaRa Agrose Gel DNA Purification Kit)購自寶生物工程(大連)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Phusion超保真DNA聚合酶和T4連接酶購自NEB公司，2×Es Taq Master Mix(含染料)購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司。生物信息學(xué)分析所用軟件為Invitrogen公司(美國)的Vector NT ADVANCED 11。本試驗(yàn)的測序和引物合成由華大基因公司完成。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體積為50μL，反應(yīng)體系中含1×Phusion HF Buffer，200μmol/L dNTPs，0.5μmol/L引物，1U Phusion DNA聚合酶，100ngDNA模板。

反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃40s，38個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?8℃20s、63℃30s、72℃2min，最后72℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

擴(kuò)增引物為：CRE-GR F：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGTCCAATTTACT GACC，CRE-GR R：TATTATTATAGACGTCCTAGTAACATAGTGACACCG；ubi+AatⅡF：TATTATT ATAGACGTCCAGTGCAGCGTGACCCGG，ubi+AatⅡR：AAGAAGGAAGAAGCTTGTCCGCCTCGGTGGCACG；NPTⅡ-NOS F:AAGA AGGAAGAAGCTTATGGCAATTACCTTATCC，NPTⅡ-NOS R：TATTATTATAGGTACCATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT。

1.3.2酶切，連接，轉(zhuǎn)化

pEASY-ubi-loxP酶切反應(yīng)體積為20μL，反應(yīng)體系為：10×Fast Digest Buffer 2μL，NotⅠ/AatⅡ/HindⅢ/KpnⅠ1μL，DNA模板2μL，將混合物在37℃下保溫1h，產(chǎn)物回收后，通過T4連接酶將其連接。

連接反應(yīng)體積為10μL，反應(yīng)體系為：2×T4ligase buffer 5μL，T4DNA Ligase 1μL，載體pBract806DNA 0.4μL，插入片段3μL。

1.3.3重組質(zhì)粒的陽性克隆PCR鑒定

菌落PCR鑒定體系中含1×Es Taq MasterMix，0.4μmol/L引物，＜1μgDNA模板。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min，35個(gè)循環(huán)的程序?yàn)?4℃30s、60℃30s、72℃30s，最后72℃延伸2min。產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結(jié)果與分析

2.1目的片段PCR擴(kuò)增

根據(jù)生工質(zhì)粒提取試劑盒，分別提取質(zhì)粒pCRE-GR、pBRACT 302、pBin19，然后擴(kuò)增以下三個(gè)片段。

1、NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ：以pCRE-GR質(zhì)粒為模板，CRE-GRF、CRE-GR R為引物，利用PCR法擴(kuò)增片段NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ,設(shè)計(jì)引物時(shí)，在片段兩端添加NotⅠ和AatⅡ酶切位點(diǎn)，電泳條帶為與目的條帶大小相同(圖1中3、4泳道，片段大小為2364bp)。

2、AatⅡ-ubi-HindⅢ：以pBRACT 302質(zhì)粒為模板，AatⅡ+ubi F、AatⅡ+ubi R為引物，利用PCR法擴(kuò)增片段AatⅡ-ubi-HindⅢ,設(shè)計(jì)引物時(shí)，在片段兩端端添加AatⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，電泳條帶與目的條帶大小相同(圖1中5、6泳道，片段大小為2078bp)。

3、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ：以pBin19質(zhì)粒為模板，NPTⅡ-NOS F、NPTⅡ-NOS R為引物，利用PCR法擴(kuò)增片段HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ,設(shè)計(jì)引物時(shí)，在片段兩端添加HindⅢ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)，電泳條帶與目的條帶大小相同(圖1中1、2泳道，片段大小為1701bp)。

2.2pEASY-ubi-NPTⅡ載體構(gòu)建

載體pEASY-ubi-loxP上設(shè)計(jì)了多個(gè)適用于本實(shí)驗(yàn)的單一酶切位點(diǎn)：HpaⅠ、NotⅠ、AatⅡ、HindⅢ和KpnⅠ，然后采用多次酶切、連接、轉(zhuǎn)化的方法，將回收后的上述目的片段NotⅠ-CRE-GR-NOS-AatⅡ、AatⅡ-ubi-HindⅢ、HindⅢ-NPTⅡ-NOS-loxP-KpnⅠ分別連接到酶切位點(diǎn)NotⅠ和AatⅡ、AatⅡ和HindⅢ、HindⅢ和KpnⅠ之間，最終得到一個(gè)具有l(wèi)oxP序列、CRE-GR融合基因、ubiquitin啟動(dòng)子序列和NPTⅡ抗性基因的克隆載體pEASY-ubi-NPTⅡ。

根據(jù)卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選和菌落PCR鑒定(圖2)，選取鑒定正確的陽性菌落，送華大基因公司測序并保存。測序結(jié)果顯示，所測克隆與預(yù)期設(shè)計(jì)的pEASY-ubi-NPTⅡ載體圖序列完全一致(圖3)。

2.3pBLCK載體構(gòu)建

使用限制性內(nèi)切酶HpaⅠ、KpnⅠ分別對(duì)pBract806和pEASY-ubi-NPTⅡ進(jìn)行酶切，將回收后的產(chǎn)物利用T4連接酶進(jìn)行連接，然后通過熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DB3.1中，在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上進(jìn)行抗性篩選，挑取篩選后的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，對(duì)鑒定正確的陽性單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，取800μL加50％的甘油液氮速凍于-80℃保存，剩余的菌液送華大基因公司測序。測序結(jié)果顯示，所測克隆與預(yù)期設(shè)計(jì)的pBLCK載體圖序列完全一致(圖4)。

3結(jié)論與討論

培育無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因植物，需要在目的基因成功轉(zhuǎn)化后，剔除選擇標(biāo)記基因，以降低對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全和食品安全的憂慮。Cre/lox等位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)是目前比較常用的培育無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的系統(tǒng)。但是最初的作法是通過二次轉(zhuǎn)化或有性雜交引入重組酶，然后通過自交分離進(jìn)一步去除重組酶基因及轉(zhuǎn)化重組酶基因所帶入的另一個(gè)選擇標(biāo)記基因。這使得選育過程復(fù)雜，周期過長，且不適于無性繁殖作物。此后誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及組織特異型啟動(dòng)子的使用，使得選擇標(biāo)記基因的剔除程序簡化，但是尚不能做到僅一次轉(zhuǎn)化(目的基因、選擇標(biāo)記基因和重組酶基因同時(shí)轉(zhuǎn)化)、一次誘導(dǎo)即實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化、選擇標(biāo)記基因和重組酶基因剔除。同時(shí)，目前已有的相關(guān)載體，目的基因和抗性篩選基因的啟動(dòng)子在單子葉植物中的表達(dá)調(diào)控效率不高，需要更換成適于單子葉植物的高效組成型啟動(dòng)子。

本發(fā)明所構(gòu)建的載體pBLCK基于Cre/lox重組系統(tǒng)和受化學(xué)誘導(dǎo)的GR系統(tǒng)，將GR LBD結(jié)構(gòu)域與Cre重組酶構(gòu)建成融合蛋白，同時(shí)采用單子葉植物強(qiáng)啟動(dòng)子ubiquitin分別啟動(dòng)重組酶基因與目的基因的表達(dá)，與“分子開關(guān)”組合通過調(diào)節(jié)重組酶在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，以在特定的時(shí)空條件下剔除lox位點(diǎn)之間的選擇標(biāo)記基因表達(dá)元件。研究和應(yīng)用本發(fā)明所構(gòu)建的載體，不但可以大大提高單子葉植物中目的基因與標(biāo)記基因的表達(dá)效率，同時(shí)還可以在時(shí)空水平控制標(biāo)記基因的剔除，從而確保了轉(zhuǎn)基因植物，尤其是轉(zhuǎn)基因主要作物的生物安全性，具有廣闊的應(yīng)用前景。