本發(fā)明涉及一種利用柚苷酶制備滸苔寡糖的方法，具體涉及一種以滸苔為原料利用纖維素酶和柚苷酶兩步酶解制備滸苔寡糖的方法，屬于活性成分提取領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：滸苔是一種大型綠藻，俗稱苔條、青海苔等，為綠藻門石莼目、石莼科、滸苔屬的藻類植物，常生長(zhǎng)于潮間帶巖石上，廣泛分布于我國(guó)沿海，資源豐富。滸苔中含有豐富的多糖成分，含量可達(dá)滸苔干重的40%以上，其中可溶性多糖主要由鼠李糖和葡萄糖組成。研究顯示，由滸苔中可溶性多糖制備的滸苔寡糖，具有抗凝血、抗氧化、抗菌和增強(qiáng)免疫力等多種活性，具有很高的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。CN105567762A公開(kāi)了一種具有輔助降血糖作用的滸苔寡糖的制備方法。該工藝流程利用微波輔助提取滸苔硫酸多糖，經(jīng)脫脂及除蛋白和色素后，依次添加多聚半乳糖醛酸酶、á-L-鼠李糖苷酶和木聚糖酶進(jìn)行酶解，滅酶活后，采用乙醇去除酶和未降解多糖，離心上清液過(guò)分子篩，截留物冷凍干燥后得到滸苔活性寡糖，其經(jīng)動(dòng)物藥效學(xué)證實(shí)，滸苔寡糖能夠顯著降低高血糖模型小鼠血糖值。CN105603023A公開(kāi)了一種促進(jìn)腸道益生菌增殖的唾液酸化滸苔寡糖制備方法。滸苔干燥后超微粉碎，利用乙醇回流提取工藝，得到干燥脫脂的滸苔粉末，經(jīng)微波輔助提取、脫蛋白及去除多糖和色素后獲得滸苔寡糖，再將唾液酸轉(zhuǎn)移酶加入到含有滸苔寡糖的反應(yīng)體系中，進(jìn)行糖基化反應(yīng)，制備得到所述的唾液酸化滸苔寡糖，該寡糖能顯著提高腸道益生菌數(shù)量，可用于制備改善腸道菌群的藥品或保健品。CN105695537A公開(kāi)一種降血糖及調(diào)節(jié)腸道菌群的糖基化滸苔寡糖制備方法，其制備方法為：滸苔干燥后超微粉碎，經(jīng)乙醇回流提取工藝，濃縮、干燥粉碎后得到脫脂的滸苔粉末，經(jīng)脫蛋白、去除多糖及色素后，再將巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶加入含有滸苔寡糖的反應(yīng)體系中，進(jìn)行巖藻糖基化反應(yīng)，制備得到所述的巖藻糖基化滸苔寡糖。經(jīng)證實(shí)糖基化滸苔寡糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有強(qiáng)抑制活性，顯著提高腸道益生菌數(shù)量，可用于制備防治糖尿病改善腸道菌群等代謝性疾病的藥品或保健品。CN103570445B提供了一種磷酸化滸苔寡糖粉劑肥料的制備方法，其特點(diǎn)是：以滸苔為主要原料，經(jīng)過(guò)原料預(yù)處理、酶解、過(guò)濾、濃縮等工藝過(guò)程，有效提取滸苔中的滸苔寡糖，以此為基液，通過(guò)磷酸化試劑共價(jià)修飾，然后經(jīng)過(guò)瞬時(shí)噴霧干燥得到磷酸化滸苔寡糖粉劑肥料。上述現(xiàn)有技術(shù)表明，滸苔寡糖是具有多種生物活性的滸苔提取組分，目前有多名研究者已經(jīng)開(kāi)始對(duì)其基團(tuán)進(jìn)行修飾并探索其新的生物活性潛力，目前其制備方法多采用微波提取和/或酶解的方式，但基于滸苔內(nèi)復(fù)雜的生物組分以及酶的局限性，使得滸苔寡糖的收率偏低，終產(chǎn)物中多糖的殘余率以及其它組分的存在使得滸苔多糖的純度偏低。因此，尋找一種酶促反應(yīng)效率高以及能夠提高滸苔多糖收率的酶用于滸苔多糖的制備工藝中具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。柚苷酶是一種能水解柚皮苷（4,5,7-三羥基二氫黃酮-7-鼠李葡萄苷）生成鼠李糖、葡萄糖和橘皮素，起到脫苦味作用的酶，目前主要應(yīng)用于蜜柚果汁的生產(chǎn)。常用的柚苷酶生產(chǎn)菌為黑曲霉、米曲霉和青霉屬的一些菌種。經(jīng)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)有柚苷酶用于制備滸苔多糖的報(bào)道?；诖?，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中滸苔寡糖的收率較低，且終產(chǎn)品中未降解多糖含量高的技術(shù)不足，本發(fā)明的目的在于提供一種以滸苔為原料利用柚苷酶制備滸苔寡糖的方法。該方法中首次將柚苷酶應(yīng)用于滸苔寡糖的制備方法中，采用纖維素酶和柚苷酶兩段酶解，然后通過(guò)納濾膜得到濃縮液，濃縮液經(jīng)干燥即可得到滸苔寡糖，該制備方法的滸苔寡糖的收率高，產(chǎn)品中雜質(zhì)和未降解多糖低，產(chǎn)品非常適合進(jìn)一步加工功能型農(nóng)業(yè)制品、飼料添加劑以及食品添加劑等。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述的一種以滸苔為原料利用柚苷酶制備滸苔寡糖的方法，其包括滸苔預(yù)處理、降解、純化、噴霧干燥四個(gè)步驟，所述的具體步驟如下：1）預(yù)處理：將含水量70-90%的新鮮滸苔（如含水量過(guò)低，可加入適量自來(lái)水）打漿至呈糊狀，投入提取罐進(jìn)行酶解反應(yīng)；或者將干滸苔粉碎至20目以下，加入6-10倍重量的自來(lái)水，投入提取罐中進(jìn)行酶解反應(yīng)；2）酶解：按如下三個(gè)階段進(jìn)行酶解反應(yīng)：第一階段，調(diào)節(jié)提取罐內(nèi)pH為4.5-5.5，按每公斤干滸苔300-1000個(gè)酶活力單位加入纖維素酶，攪拌并升溫至45-55℃，保溫2-3小時(shí)，用于降解細(xì)胞壁中的纖維素，促進(jìn)多糖的提取。第二階段，調(diào)節(jié)提取罐內(nèi)pH為3.5-5.0，按每公斤干滸苔100-600個(gè)酶活力單位加入柚苷酶，升溫至50-60℃，保溫10-12小時(shí)，使?jié)G苔多糖降解為寡糖。第三階段，調(diào)節(jié)提取罐內(nèi)pH為6.5-7.0，升溫至90℃以上，保溫15分鐘，滅酶活，得到酶解液；3）純化：將酶解液過(guò)濾或離心，將得到的濾液或離心液依次通過(guò)截留分子量為2000-3500Da和300-500Da的納濾膜，截取分子量300-2000Da的部分，并達(dá)到脫鹽的目的，得到納濾濃縮液；4）干燥：納濾濃縮液進(jìn)一步濃縮至固形物達(dá)到25-35%，噴霧干燥，即可得到滸苔寡糖。優(yōu)選地，所述步驟2）中纖維素酶的加入量為每公斤干滸苔650個(gè)酶活力單位，所述纖維素酶的最佳酶解條件為：提取罐內(nèi)pH為5.0，酶解溫度為50℃，保溫時(shí)間為2.5小時(shí)。優(yōu)選地，所述步驟2）中柚苷酶的加入量為每公斤干滸苔350個(gè)酶活力單位，所述柚苷酶的最佳酶解條件為：提取罐內(nèi)pH為4.0，酶解溫度為55℃，保溫時(shí)間為11小時(shí)。優(yōu)選地，所述步驟3）中的過(guò)濾操作中濾布的目數(shù)為600-1000目；所述步驟3）中的離心操作中離心轉(zhuǎn)速為3500轉(zhuǎn)/分，離心時(shí)間為10min。申請(qǐng)人根據(jù)上述條件的組合對(duì)本發(fā)明的制備方法進(jìn)行了深入研究，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明最優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，所述的具體步驟如下：1）預(yù)處理：將含水量90%的新鮮滸苔打漿至呈糊狀，投入提取罐進(jìn)行酶解反應(yīng)；2）酶解：按如下三個(gè)階段進(jìn)行酶解反應(yīng)：第一階段，調(diào)節(jié)提取罐內(nèi)pH為5.0，按每公斤干滸苔300-1000個(gè)酶活力單位加入纖維素酶，攪拌并升溫至50℃，保溫2.5小時(shí)，用于降解細(xì)胞壁中的纖維素，促進(jìn)多糖的提取。第二階段，調(diào)節(jié)提取罐內(nèi)pH為5.0，按每公斤干滸苔350個(gè)酶活力單位加入柚苷酶，升溫至55℃，保溫11小時(shí)，使?jié)G苔多糖降解為寡糖。第三階段，調(diào)節(jié)提取罐內(nèi)pH為6.8，升溫至90℃以上，保溫15分鐘，滅酶活，得到酶解液；3）純化：將酶解液過(guò)濾或離心，將得到的濾液或離心液依次通過(guò)截留分子量為2800Da和400Da的納濾膜，截取分子量400-2800Da的部分，并達(dá)到脫鹽的目的，得到納濾濃縮液；4）干燥：納濾濃縮液進(jìn)一步濃縮至固形物達(dá)到30%，噴霧干燥，即可得到滸苔寡糖。本發(fā)明效果實(shí)施例顯示，按照本發(fā)明制備的滸苔寡糖的收率高，且滸苔寡糖中多糖殘余量少，產(chǎn)品的純度高。與對(duì)比實(shí)施例1相比，本發(fā)明制備的滸苔寡糖的收率顯著提高，且多糖殘余量更低，其中以實(shí)施例5所述的方法的制備的產(chǎn)品的收率最高，為本發(fā)明的最佳實(shí)施例。本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)按照上述方法制備得到的滸苔寡糖。上述滸苔寡糖還可以進(jìn)一步制備成功能型農(nóng)業(yè)制品、飼料添加劑以及食品添加劑，其營(yíng)養(yǎng)含量高，用于食品添加劑或飼料添加劑時(shí)可以顯著增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，促進(jìn)動(dòng)物的快速成長(zhǎng)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于：1）滸苔寡糖的收率高，從而大幅度降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明效果實(shí)施例顯示，按照本發(fā)明制備的滸苔寡糖的收率高，其收率在38%-43%之間，遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)所制備的滸苔寡糖，且本發(fā)明制備得到的滸苔寡糖的純度高，不低于現(xiàn)有技術(shù)所獲得的滸苔寡糖。2）產(chǎn)品中的多糖殘余率低。本發(fā)明采用纖維素酶和柚苷酶結(jié)合的方式使得終產(chǎn)品中的多糖殘余率極低，產(chǎn)品的品質(zhì)大幅度提升。現(xiàn)有技術(shù)中滸苔寡糖中殘留未酶解多糖，影響著產(chǎn)品的品質(zhì)。3）本發(fā)明滸苔寡糖還可以進(jìn)一步制備成功能型農(nóng)業(yè)制品、飼料添加劑以及食品添加劑，其營(yíng)養(yǎng)含量高，用于食品添加劑或飼料添加劑時(shí)可以顯著增強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，促進(jìn)動(dòng)物的快速成長(zhǎng)。具體實(shí)施方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述：實(shí)施例1：取10kg新鮮滸苔，含水量為90%，濕料粉碎機(jī)粉碎后放入提取罐中，開(kāi)啟攪拌，加入17mL1mol/L的鹽酸溶液，攪拌均勻后，檢測(cè)pH為5.1，升溫至50℃，加入400U纖維素酶，持續(xù)攪拌并控溫50℃，pH5.0范圍內(nèi)，3小時(shí)后，再加入11mL1mol/L的鹽酸溶液，攪拌均勻，檢測(cè)pH為4.3，升溫至55℃，加入300U柚苷酶，持續(xù)攪拌并控溫55℃，pH4.3范圍內(nèi)，酶解10小時(shí)。升溫至95℃并保溫15min，滅酶活。酶解液板框過(guò)濾（750目濾布），得到7L濾液，加入7L自來(lái)水稀釋，并通過(guò)截留分子量3500Da的納濾膜，流出液13.5L通過(guò)截留分子量500DA的納濾膜，至濃縮液體積濃縮至5L，濃縮液再用三效濃縮器進(jìn)一步濃縮至固形物30%，噴霧干燥，得到380g滸苔寡糖。實(shí)施例2：干滸苔用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20目篩，取15kg投入提取罐中，加入90L自來(lái)水，開(kāi)啟攪拌，加入21mL濃鹽酸，攪拌均勻后，檢測(cè)pH為4.9，升溫至50℃，加入8000U纖維素酶，持續(xù)攪拌并控溫50℃，pH5.0范圍內(nèi)，提取2小時(shí)，再加入16mL濃鹽酸，攪拌均勻，檢測(cè)pH為4.4，升溫至55℃，加入4200U柚苷酶，持續(xù)攪拌并控溫55℃，pH4.3范圍內(nèi)，酶解12小時(shí)。升溫至95℃并保溫15min，滅酶活。酶解液板框過(guò)濾（750目濾布），得到85L濾液，加入80L自來(lái)水稀釋，并通過(guò)截留分子量3500Da的納濾膜，流出液147L通過(guò)截留分子量500DA的納濾膜，至濃縮液體積濃縮至60L，濃縮液再用三效濃縮器進(jìn)一步濃縮至固形物30%，噴霧干燥，得到6.1kg滸苔寡糖。實(shí)施例3-實(shí)施例8按照如表1所述參數(shù)制備滸苔寡糖，除下述參數(shù)不同外，實(shí)施例3-實(shí)施例5制備方法同實(shí)施例1，實(shí)施例6-實(shí)施例8同實(shí)施例2。表1實(shí)施例3-實(shí)施例8中主要參數(shù)對(duì)比實(shí)施例1按照CN105567762A實(shí)施例1制備得到的滸苔活性寡糖。分別測(cè)定按照本發(fā)明實(shí)施例1-實(shí)施例8所制備得到的滸苔寡糖的收率，滸苔寡糖中多糖殘余率，其測(cè)定結(jié)果如表2所示。滸苔寡糖的收率=滸苔寡糖/干滸苔×100%，或者滸苔寡糖/（新鮮滸苔×(1-含水率)）×100%。多糖的測(cè)定方法按照現(xiàn)有技術(shù)中所公開(kāi)的方法測(cè)定，其殘余率為滸苔寡糖中多糖含量除以提取前干滸苔中多糖含量。測(cè)定結(jié)果如表2所示。滸苔寡糖收率（%）寡糖中多糖殘余率（%）寡糖中雜質(zhì)含量（%）實(shí)施例138.000.250.65實(shí)施例240.670.290.59實(shí)施例343.620.190.24實(shí)施例440.180.220.51實(shí)施例542.610.210.43實(shí)施例641.920.270.49實(shí)施例743.100.240.43實(shí)施例839.950.250.43對(duì)比實(shí)施例118.960.950.22由表2可以看出，按照本發(fā)明制備的滸苔寡糖的收率高，且滸苔寡糖中多糖殘余量少，產(chǎn)品的純度高。與對(duì)比實(shí)施例1相比，本發(fā)明制備的滸苔寡糖的收率顯著提高，且多糖殘余量更低，其中以實(shí)施例5所述的方法的制備的產(chǎn)品的收率最高，為本發(fā)明的最佳實(shí)施例。以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其進(jìn)行限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護(hù)的技術(shù)方案的精神和范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3