本發(fā)明涉及一種銀耳多糖，特別涉及一種低分子量銀耳多糖及其制備方法與應用。
背景技術：
：銀耳又稱白木耳、雪耳、銀耳子等，有“菌中之冠”的美稱，其主要活性成分為多糖，包括酸性多糖、中性多糖、中性雜多糖、酸性低聚糖、胞壁多糖、胞外多糖等5種。銀耳多糖具有強心、延緩衰老、抗血栓、抗腫瘤、提高免疫力、抗衰老、祛除黃褐斑等功效，銀耳經(jīng)深加工后得到的銀耳多糖在食品、保健品及化妝品中應用廣泛。銀耳多糖主要為酸性多糖，約占銀耳總多糖的70～75％，其分子量可達100萬或以上。大分子量的銀耳多糖具有良好的保濕能力和優(yōu)越的成膜性，但又存在溶解度低、不易被皮膚吸收、在配方中應用會帶來黏膩感的缺點，作為保濕劑在化妝品中應用存在一定的缺陷。而銀耳多糖在較低的分子量情況下，具有良好的保濕能力的同時，容易被皮膚吸收，給皮膚提供深層保濕的作用，故低分子量銀耳多糖在化妝品中應用更方便、廣泛。低分子量銀耳多糖的制備一般通過提取、降解、純化、干燥四個步驟。提取過程中由于銀耳富含膠質(zhì)，膠質(zhì)能夠吸收大量的水分，且容易大量進入溶液中，對銀耳提取液進行提純，存在著處理量大、容易堵塞濾膜的問題。申請?zhí)枮?01510336334.0、發(fā)明名稱為銀耳多糖的制備方法的中國發(fā)明專利申請?zhí)峁┝艘环N銀耳多肽的制備方法，其對銀耳進行提取后，采用離心分離上清液的方法對銀耳提取液完成初步提純，但是市面上的離心機處理量都不大，難以實現(xiàn)工廠大生產(chǎn)；申請?zhí)枮?01610110386.0、發(fā)明名稱為一種銀耳多糖的提取方法的發(fā)明專利申請?zhí)峁┝艘环N銀耳多肽的提取方法，對銀耳進行提取，使用微濾膜對提取液過濾進行初步提純，但是銀耳提取液中含有大量膠質(zhì)，十分容易堵塞濾膜，同樣不適合處理大量的提取液。因此，銀耳多糖提取液的固液分離初步提純是從實驗室研究發(fā)展至工業(yè)化生產(chǎn)不得不面對的難題。銀耳多糖進行提取后一般通過化學降解法、酶解法等方法對其進行降解，再通過分級醇沉、離心干燥或分子膜過濾進行純化，最后通過噴霧干燥得到低分子量銀耳多糖。純化過程中通過分級醇沉需要大量的乙醇溶液，在不同的乙醇濃度下分離出不同分子量的多糖則成本高，操作繁瑣；通過分子膜對多糖溶液進行過濾濃縮會對多糖產(chǎn)生大量的損耗，且后續(xù)的噴霧干燥能耗大，容易破壞銀耳多糖的活性。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種低分子量銀耳多糖的制備方法。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的低分子量銀耳多糖。本發(fā)明的又一目的在于提供所述低分子量銀耳多糖的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種低分子量銀耳多糖的制備方法，包括如下步驟：(1)將銀耳粉末和水混合，通過pH調(diào)節(jié)劑將pH值調(diào)節(jié)為堿性，提取，得到粗提液；(2)調(diào)節(jié)粗提液的溫度和pH值，接著加入酶進行酶解；(3)酶解后得到的產(chǎn)物進行固液分離，得到的濾液進行濃縮，得到膏狀物；(4)在膏狀物中加入乙醇和H2O2進行多糖降解，靜置沉淀，離心，洗滌，干燥，得到低分子量銀耳多糖。步驟(1)中所述的銀耳優(yōu)選為干品銀耳。步驟(1)中所述的粉末的粒徑大小優(yōu)選為60～100目。步驟(1)中所述的水的用量優(yōu)選為按水和銀耳按質(zhì)量比100～200:1配比計算；更優(yōu)選為按質(zhì)量比150:1配比計算。步驟(1)中所述的pH調(diào)節(jié)劑優(yōu)選為NaOH。步驟(1)中所述的pH值優(yōu)選為9～10；更優(yōu)選為9。步驟(1)中所述的提取的條件優(yōu)選為80～90℃反應3～5小時；更優(yōu)選為85～90℃反應4～5小時；最優(yōu)選為90℃反應4小時。步驟(2)中所述的酶為果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶中的一種或兩種以上；優(yōu)選為果膠酶和纖維素酶復合得到的酶；更優(yōu)選為果膠酶和纖維素酶按質(zhì)量比1：1復合得到的酶。步驟(2)中所述的酶的質(zhì)量添加量按銀耳質(zhì)量的0.1～1％添加；優(yōu)選為按銀耳質(zhì)量的0.5％添加。步驟(2)中所述的溫度優(yōu)選為45～55℃；更優(yōu)選為50℃。步驟(2)中所述的pH值優(yōu)選為4.5～5.5；更優(yōu)選為5。步驟(2)中所述的酶解的時間優(yōu)選為2～6小時；更優(yōu)選為4小時。步驟(3)中所述的固液分離優(yōu)選為包括如下步驟：先通過紗布粗濾濾去濾渣，再用截留孔徑為1微米的陶瓷膜過濾除去雜質(zhì)。步驟(3)中所述的濃縮優(yōu)選為通過減壓濃縮的方式進行濃縮。步驟(3)中所述的濃縮的程度優(yōu)選為濃縮至原體積的1/10～1/9，優(yōu)選為濃縮至原體積的1/10。步驟(4)中所述的乙醇的用量按乙醇在最終體系中的終濃度為80～85％(v/v)計算；更優(yōu)選為按乙醇在最終體系中的終濃度為80(v/v)％計算。步驟(4)中所述的H2O2的用量按H2O2在最終體系中的終濃度為0.5～2.5％(v/v)計算；更優(yōu)選為按乙醇在最終體系中的終濃度為2％計算。步驟(4)中所述的多糖降解的時間優(yōu)選為24～48小時；更優(yōu)選為36小時。步驟(4)中所述的靜置沉淀的溫度優(yōu)選為2～5℃。步驟(4)中所述的靜置沉淀的時間優(yōu)選為12小時。步驟(4)中所述的離心的方式優(yōu)選為采用吊袋離心機進行離心。所述的離心的條件優(yōu)選為2000r/min。步驟(4)中所述的洗滌為采用銀耳多糖不溶性溶劑進行洗滌，優(yōu)選濃度為質(zhì)量百分比為95％的乙醇清洗。步驟(4)中所述的清洗的次數(shù)優(yōu)選為3～5次。步驟(4)中所述的干燥的條件優(yōu)選為于40～50℃干燥至恒重。步驟(4)中所述的低分子量銀耳多糖指的是分子量在10000道爾頓以下的多糖占總多糖95％以上的銀耳多糖；其分子量的分布優(yōu)選如下：分子量在10000～50000的百分比為0.47～4.13％、分子量在5000～10000的百分比為21.75～74.33％、分子量在1000～5000的百分比為23.51～59.26％、分子量小余1000的百分比為1.69～14.86％。一種低分子量銀耳多糖，通過上述所述的制備方法得到。所述的低分子量銀耳多糖中總多糖含量大于90％；優(yōu)選為90.6～93.4％。所述的低分子量銀耳多糖在食品、藥品、保健品和化妝品中的應用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：(1)本發(fā)明通過堿提、酶解工藝結合，改善了提取液的濾過性能，提高了多糖的提取率。(2)本發(fā)明簡化了銀耳多糖降解和分離提純工藝，將降解和醇沉結合，操作簡單，用于降解和清洗步驟的乙醇可以回收利用，減少了銀耳多糖和乙醇的損耗。(3)產(chǎn)品分子量可控制在較低范圍中，產(chǎn)品分子量在10000道爾頓的銀耳多糖占總糖的95％以上，提高了銀耳多糖的透皮吸收效果，提高了產(chǎn)品的溶解性，具有良好的保濕性能。(4)制備過程沒有使用有機溶劑，衛(wèi)生安全，干燥過程無需噴霧干燥，干燥成本低，干燥條件溫和，銀耳多糖保持了良好的活性。附圖說明圖1是本發(fā)明中經(jīng)酶處理前后提取液的過濾效率的對比圖。圖2是本發(fā)明制備的銀耳多糖、透明質(zhì)酸和市售銀耳多糖的保濕性測試結果圖。具體實施方式下面結合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1取干品銀耳30kg打粉，粉碎至可過篩60目，以液料比100:1(w/w)加水，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10，于85℃反應4小時，得粗提液，等粗提液溫度降至50℃，調(diào)節(jié)pH至5.5，加入0.15kg的果膠纖維素復合酶(果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1：1，其中，果膠酶的規(guī)格為3萬U/g，纖維素酶的規(guī)格為1萬U/g，均購于上海邁瑞爾化學技術有限公司)，反應4小時，紗布粗濾濾去濾渣后，用截留孔徑1微米的陶瓷膜過濾除去雜質(zhì)，得到濾液2470kg，減壓濃縮，濃縮至約原體積的十分之一，得到稠膏267kg。往稠膏中加入95％(w/w)乙醇約500mL，使體系乙醇的終濃度達80％(v/v)，加入H2O2使其終濃度達2％(v/v)，常溫下攪拌36小時，將溫度降至4℃，靜置12小時，使用吊袋離心機離心(2000r/min)至液體完全甩出，收集沉淀部分，沉淀用95％乙醇清洗，清洗3遍，離心(2000r/min)，回收乙醇，沉淀放置于45℃烘箱烘干，得到低分子量銀耳多糖7.63kg。實施例2取干品銀耳30kg打粉，粉碎至可過篩100目，以液料比150:1(w/w)加水，用NaOH調(diào)節(jié)pH至9，于85℃反應4小時，得粗提液，等粗提液溫度降至50℃，調(diào)節(jié)pH至5.5，加入0.15kg的果膠纖維素復合酶(果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1：1，其中，果膠酶的規(guī)格為3萬U/g，纖維素酶的規(guī)格為1萬U/g，均購于上海邁瑞爾化學技術有限公司)反應4小時，紗布粗濾濾去濾渣后，用截留孔徑1微米的陶瓷膜過濾除去雜質(zhì)，得濾液2611kg，減壓濃縮，濃縮至約原體積的十分之一，得到稠膏271kg。往稠膏中加入95％(w/w)乙醇500mL，使體系乙醇濃度達80％(v/v)，加入H2O2使其濃度達1.5％(v/v)，常溫下攪拌24小時后，將溫度降至4℃，靜置12小時，使用吊袋離心機離心(2000r/min)至液體完全甩出，收集沉淀部分，沉淀用95％乙醇清洗，清洗3遍，離心(2000r/min)，回收乙醇，沉淀放置于45℃烘箱烘干，得低分子銀耳多糖7.86kg。實施例3取干品銀耳30kg打粉，粉碎至可過篩90目，以液料比200:1(w/w)加水，用NaOH調(diào)節(jié)pH至10，于90℃反應5小時，得粗提液，等粗提液溫度降至50℃，調(diào)節(jié)pH至5.5，加入0.15kg的果膠纖維素復合酶(果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1：1，其中，果膠酶的規(guī)格為3萬U/g；纖維素酶的規(guī)格為1萬U/g，均購于上海邁瑞爾化學技術有限公司)反應4小時，紗布粗濾濾去濾渣后，用截留孔徑1微米的陶瓷膜過濾除去雜質(zhì)，得濾液2549kg，減壓濃縮，濃縮至約原體積的十分之一，得到稠膏268kg。往稠膏中加入95％(w/w)乙醇，使體系乙醇濃度達80％(v/v)，加入H2O2使其濃度達2.5％(v/v)，常溫下攪拌48小時后，將溫度降至4℃，靜置12小時，使用吊袋離心機離心(2000r/min)至液體完全甩出，收集沉淀部分，沉淀用95％乙醇清洗，清洗3遍，離心(2000r/min)，回收乙醇，沉淀放置于45℃烘箱烘干，得低分子銀耳多糖7.37kg。對比例1分子量的測定(1)檢測樣品：實驗組為實施例1～3分別制備得到的低分子銀耳多糖；對照樣品①的制備過程如下：操作步驟基本同實施例1，區(qū)別僅在于：用去離子水替代實施例1中往稠膏中加入的乙醇和H2O2，去離子水的加入量為乙醇和H2O2的總和，得到的銀耳多糖。對照樣品②的制備過程如下：操作步驟基本同實施例1，區(qū)別僅在于：用去離子水替代實施例1中往稠膏中加入的乙醇，去離子水的加入量等同于乙醇的加入量，得到的銀耳多糖。對照樣品③的制備過程如下：操作步驟基本同實施例1，區(qū)別僅在于：用去離子水替代實施例1中往稠膏中加入的H2O2，去離子水的加入量等同于H2O2的加入量，得到的銀耳多糖。(2)檢測方法：通過高效凝膠滲透色譜法進行分子量的測定(測定方法參照基于高效凝膠滲透色譜法的銀耳多糖質(zhì)量控制研究，[J]中草藥,2011,42(09):1732～1735中的測定方法檢測)，3)檢測結果：結果如表1所示，可見：實施例1得到的銀耳多糖中分子量在10000以下的銀耳多糖占到95.87％；實施例2得到的銀耳多糖中分子量在10000以下的銀耳多糖占到96.99％；實施例3得到的銀耳多糖中分子量在10000以下的銀耳多糖占到99.53％。實施例1～3與對照樣品①～③得到的銀耳多糖的分子量分布結果比較，實施例1～3得到的銀耳多糖的分子量在10000以下的占到總數(shù)的95％以上，而對照樣品①～③中的銀耳多糖分子量在10000以下的占到總數(shù)的60～80％，故在稠膏中添加乙醇和H2O2對銀耳多糖大分子降解為小分子起到明顯的作用。表1本發(fā)明生產(chǎn)的低分子銀耳多糖分子量分布結果對比例2過濾效率測試(1)設置以下對比實驗，分別測試樣品的過濾效率，其中：實驗組為實施例1中酶解后的粗提液；空白對照組為實施例1中酶解前的粗提液；對比組1為用0.15kg果膠酶替代實施例1中0.15kg果膠纖維素復合酶得到的酶解后的粗提液，其他步驟和實施例1相同；對比組2為用0.15kg纖維素酶替代實施例1中0.15kg果膠纖維素復合酶得到的酶解后的粗提液，其他步驟和實施例1相同；對比組3為用果膠纖維素復合酶(果膠酶：纖維素酶＝質(zhì)量比為1:2)替代實施例1中的果膠纖維素復合酶(質(zhì)量比為1:1)得到的酶解后的粗提液，其他步驟和實施例1相同；對比組4為酶解時間為2個小時得到的酶解后的粗提液，其他步驟和實施例1相同的酶解后的粗提液。(2)測試方法：使用SHB～Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵和帶刻度的抽濾瓶，在0.08Mpa的恒定真空度和95cm2恒定過濾面積下，抽濾100mL的樣品，每隔一定時間記錄過濾體積，以過濾體積和過濾時間作圖，觀察不同樣品的過濾效率，結果見圖1；以空白對照組的過濾效率(R1)為參照，其他實驗組的過濾效率(RX)與空白對照組對照，過濾效率提高/降低的百分比＝RX-R1，結果見表1；(3)測試結果：如圖1所示，從結果可以看出，相同體積相同條件下實驗組的濾過效率比空白組和對比組1～3的濾過效果好，說明在銀耳多糖提取過濾中果膠纖維素酶按照1:1的比例復配比單獨使用果膠酶(纖維素酶)或者使用果膠纖維素酶1:2的比例復配效果更好。實驗組比對比組4的濾過速度快，說明酶解4小時比酶解2小時更合理。從表1結果可以看出，實驗組相對于空白組和對比組1-4濾過效率顯著提高，說明實驗組中果膠纖維素復合酶(1:1)酶解4h對銀耳提取液的濾過速率有明顯的改善作用。表1濾過效率提高的百分比結果時間/S空白對照(％)實驗組(％)對比組1(％)對比組2(％)對比組3(％)對比組4(％)10028621414200325318203003416212440040312032500285416136002617101670021564780020391289001656106100085153120022222效果實施例(1)保濕性試驗品如下：實施例1得到的銀耳多糖的0.5％(w/w)水溶液、市售銀耳多糖(平均分子量85萬以上，用水溶解為0.5％(w/w)的水溶液)為對比例，以及0.5％透明質(zhì)酸水溶液。選取30名志愿者(年齡在22～42歲之間，男女各15名)，分別在左、右手臂內(nèi)側涂抹定量的實施例1、對比例和透明質(zhì)酸水溶液，每隔30分鐘分別進行皮膚水分含量測定(水份測量測定使用德國COURAGE+KHAZAKA(CK)公司生產(chǎn)的皮膚水份測量儀)，結果如圖2所示。從測試結果看出，相同濃度(0.5％)的實施例1、透明質(zhì)酸、對比例水溶液在240min內(nèi)具有良好的保濕能力，且0.5％(w/w)實施例1水溶液的保濕能力比0.5％(w/w)對比例水溶液的保濕能力好，與0.5％(w/w)透明質(zhì)酸水溶液的保濕能力相當。(2)經(jīng)皮吸收測試測試樣品為實施例1～3制備得到的銀耳多糖的0.5％(w/w)水溶液和市售銀耳多糖(平均分子量85萬以上，用水溶解為0.5％(w/w)的水溶液)作為對照的對比例；根據(jù)國標GB/T27818～2011《化學品皮膚吸收體外試驗方法》和GB/T15672～2009《食用菌中總糖含量的測定》，檢測在相同添加量條件下1小時內(nèi)，通過1cm2測試皮膚仿真模型的銀耳多糖的百分比，結果如表2：表2本發(fā)明生產(chǎn)的銀耳多糖水溶液的精辟吸收測試結果實施例1實施例2實施例3對比例通過皮膚的多糖百分比％10.0510.3510.590.07從表2數(shù)據(jù)表明，實施例1～3的銀耳多糖水溶液與對比例相比，實施例1～3的多糖透過率為10.05％～10.59％，對比例的多糖透過率為0.07％，說明實施例1～3的低分子銀耳多糖(分子量小于10000Da)更容易透過皮膚仿真模型，更有利于皮膚的吸收。(3)粗脂肪含量、總糖含量和蛋白質(zhì)含量的檢測試驗品為實施例1～3銀耳多糖和對比例制備成0.5％(w/w)水溶液，其中，對比例為市售銀耳多糖(平均分子量85萬以上，用水溶解為0.5％(w/w)的水溶液)；參考國標GB/T15674～2009《食用菌中粗脂肪含量的測定》、GB/T15672～2009《食用菌中總糖含量的測定》和GB/T15673～2009《食用菌中粗蛋白含量的測定》測定它們的粗脂肪、總糖和蛋白質(zhì)的含量，結果如表3：表3本發(fā)明銀耳多糖粗脂肪/總糖和蛋白質(zhì)含量測定結果實施例1實施例2實施例3對比例粗脂肪含量(％)5.24.82.810.1總糖含量(％)90.692.393.480.5蛋白質(zhì)含量(％)2.12.71.92.3從表3數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明制備的銀耳多糖的總多糖含量大于90％，與對比例比較總含糖量較高，蛋白質(zhì)含量相當，粗脂肪含量較對比例低。本發(fā)明制備的銀耳多糖與對比例從粗脂肪、總糖、蛋白質(zhì)三方面比較，本發(fā)明制備的銀耳多糖比對比例的銀耳多糖好。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3