本發(fā)明涉及一種檢測(cè)引物及其PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

馬鈴薯青枯病(Potato bacterial wilt)，又名細(xì)菌性枯萎病。從發(fā)生地域或危害性來(lái)說，青枯病是馬鈴薯病害中僅次于晚疫病的一種常見病和多發(fā)病，為世界性重大細(xì)菌性病害。青枯病分布范圍極廣，主要分布在溫暖潮濕、雨量充沛的熱帶和亞熱帶地區(qū)。由于青枯病較難控制，既無(wú)免疫抗原，又可經(jīng)土壤傳染，一旦發(fā)生青枯病，發(fā)病田塊大幅度減產(chǎn)，發(fā)病重的產(chǎn)量損失達(dá)80％左右。

此病是由一種稱為青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的細(xì)菌侵染引起的。此菌是一種維管束寄生的植物病原細(xì)菌，病菌侵入維管束后迅速繁殖，并堵塞導(dǎo)管，妨礙水分運(yùn)輸，最后導(dǎo)致植株萎蔫。此種細(xì)菌的寄主范圍很廣，可侵染33科100余種植物，除茄科蔬菜如番茄、茄子、辣椒等外還侵染煙草、芝麻、花生、大豆、蘿卜等多種農(nóng)作物，病菌生長(zhǎng)發(fā)育最適溫度為30-37攝氏度，是一種要求高溫的細(xì)菌，對(duì)濕度的要求也較高。該菌主要隨病殘?bào)w留在田間或馬鈴薯塊上越冬，無(wú)寄主時(shí)，病菌可在土中營(yíng)腐生生活長(zhǎng)達(dá)14個(gè)月～6年，是一種頑固的兼性腐生菌。

青枯病是危害嚴(yán)重的病害。一般幼苗期較少顯癥，多在現(xiàn)蕾開花后表現(xiàn)急性顯癥，染病植株比健株稍矮縮，葉色較淺，在晴天的午間一般是上部個(gè)別小葉或復(fù)葉出現(xiàn)萎蔫，晚間及清晨尚可恢復(fù)，以后逐漸加重，致全株葉片萎垂不能再恢復(fù)，全株莖葉萎蔫死亡，但仍保持青綠顏色，葉片亦不脫落，隨后葉脈逐漸變褐，莖部亦出現(xiàn)褐色條紋。病株所結(jié)薯塊如染病輕，外表無(wú)明顯癥狀，染病重的臍部變灰褐色濕潤(rùn)狀，切開病薯，維管束環(huán)變褐，稍擠壓亦溢出污白色細(xì)菌膿液，嚴(yán)重的塊莖外皮龜裂，髓部軟腐潰爛。此病對(duì)馬鈴薯有潛伏侵染，外表雖無(wú)明顯癥狀，但因細(xì)菌已侵入并潛伏薯塊內(nèi)，在貯運(yùn)銷售期間，若條件合適就會(huì)繼續(xù)發(fā)展及致引起塊莖大量腐爛。

常用的馬鈴薯青枯病菌鑒定檢測(cè)方法如革蘭氏染色法和血清學(xué)方法。革蘭氏染色法需要加上對(duì)菌體形態(tài)特征進(jìn)行觀察，對(duì)生理生化反應(yīng)特性進(jìn)行測(cè)定，才能最終判定，這種檢測(cè)方法需要對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化，試驗(yàn)的結(jié)果因培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短、培養(yǎng)基成分和確定陰性陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)不同而變化，穩(wěn)定性差，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于生產(chǎn)上的應(yīng)用。血清學(xué)方法盡管靈敏度有所提高，但仍然存在缺點(diǎn)，在與其它相近病菌的交叉反應(yīng)或制備的抗血清不能和所有的待檢測(cè)的某一種病菌的所有菌株雜交。隨著分子生物學(xué)技術(shù)在許多領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用，尤其是利用各種生物所特有的基因組堿基序列，而發(fā)展起來(lái)的特異性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的應(yīng)用，但是這種技術(shù)對(duì)檢測(cè)過程需要嚴(yán)格的要求，引物方面也是關(guān)鍵，不同的引物對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，對(duì)檢測(cè)范圍，檢測(cè)的靈敏度，特異性等均有很大的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有方法對(duì)馬鈴薯青枯病的病原菌檢測(cè)范圍窄，特異性差，靈敏度差，檢測(cè)效率低的問題。而提供了一種檢測(cè)馬鈴薯青枯病菌的引物及其PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的一種檢測(cè)馬鈴薯青枯病菌的引物，該引物對(duì)如下：

QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'

QK3-1：5'-GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'。

本發(fā)明的一種檢測(cè)馬鈴薯青枯病菌的PCR方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA；

二、以權(quán)利要求1的引物作為檢測(cè)引物，步驟一提取的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

三、PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳；

四、對(duì)擴(kuò)增片進(jìn)行分析：在591bp位置有擴(kuò)增條帶，表示樣品為陽(yáng)性，待檢測(cè)樣品中含有鈴薯青枯病菌。

本發(fā)明包含以下有益效果：

本發(fā)明的馬鈴薯青枯病菌PCR檢測(cè)引物，該引物可以對(duì)引起馬鈴薯青枯病的病原菌Ralstonia solanacearum四種生化型(BV Ⅱ～BV Ⅴ)的菌株進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，檢測(cè)范圍廣泛。檢測(cè)特異性好，可以避免其它馬鈴薯細(xì)菌病原物產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增。檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1pg的模板DNA。檢測(cè)效率高，檢測(cè)樣品可以是馬鈴薯植株DNA、塊莖DNA，甚至可以直接以菌液作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。

本發(fā)明的檢測(cè)引物，檢測(cè)特異性強(qiáng)，定性檢測(cè)效果好。在常見的馬鈴薯病害環(huán)腐病、黑脛病、軟腐病和晚疫病等病原菌內(nèi)均無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，僅有青枯病菌能夠獲得目的片段。(避免了陳永芳等2005年利用RAPD法建立的PCR檢測(cè)法中環(huán)腐病和黑脛病有擴(kuò)增條帶，只是帶型不同的問題)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，1-6泳道分別為：RS1～6的青枯病菌；

圖2為實(shí)施例1中退火溫度優(yōu)化的電泳圖；

圖3為實(shí)施例1中馬鈴薯青枯病菌PCR擴(kuò)增電泳圖；其中，M為DL2000；1：陰性對(duì)照；2～13：RS1～12的DNA電泳圖；

圖4為實(shí)施例1中PCR檢測(cè)的特異性鑒定電泳圖；其中，M：DL2000；1：陰性對(duì)照；2～4：RS1～4的DNA電泳圖；6～8：馬鈴薯黑脛病菌DNA電泳圖；9～11：馬鈴薯環(huán)腐病菌DNA電泳圖；12～14：馬鈴薯晚疫病菌DNA電泳圖；

圖5為實(shí)施例1中PCR檢測(cè)的靈敏性鑒定電泳圖；其中，M為DL2000；1：陰性對(duì)照；2～7表示：1ng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg的樣品電泳圖；

圖6為實(shí)施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴(kuò)增電泳圖第一批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、水對(duì)照、陰性對(duì)照、1-1～6、2-2～4、3-1～12；

圖7為實(shí)施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴(kuò)增電泳圖第二批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、3-13～16、5-1～4；

圖8為實(shí)施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴(kuò)增電泳(引物RS32和RS37)第一批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、水對(duì)照、陰性對(duì)照、1-1～6、2-2～4、3-1～12；

圖9為實(shí)施例2的廣西省、廣東省、福建省的樣品擴(kuò)增電泳(引物RS32和RS37)第二批；其中，由左至右順序依次為Marker DL2000、3-13～16、5-1～4；

圖10為實(shí)施例2的內(nèi)蒙古的四個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)菌株同時(shí)進(jìn)行兩對(duì)引物的擴(kuò)增電泳結(jié)果圖；其中A為本發(fā)明的引物擴(kuò)增后電泳圖，B為檢疫標(biāo)準(zhǔn)推薦引物擴(kuò)增后電泳圖。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式的一種檢測(cè)馬鈴薯青枯病菌的引物，該引物對(duì)如下：

QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'

QK3-1：5'-GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式的一種檢測(cè)馬鈴薯青枯病菌的PCR方法，它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、提取待檢測(cè)樣本的基因組DNA；

二、以權(quán)利要求1的引物作為檢測(cè)引物，步驟一提取的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；

三、PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳；

四、對(duì)擴(kuò)增片進(jìn)行分析：在591bp位置有擴(kuò)增條帶，表示樣品為陽(yáng)性，待檢測(cè)樣品中含有鈴薯青枯病菌。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是：PCR擴(kuò)增的PCR體系如下：

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50～63℃退火40s，72℃延伸100s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。其它與具體實(shí)施方式二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是：步驟一中提取基因組DNA，是從馬鈴薯植株或馬鈴薯塊莖提取。其它與具體實(shí)施方式二相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式二不同的是：基因組DNA提取步驟如下：

一、取馬鈴薯塊莖或馬鈴薯植株0.1g放入勻漿管中，再加入2mL勻漿緩沖液，將材料立即破碎后將液體抽出，放在5mL離心管中后，加入20μL巰基乙醇，立即在65℃水浴中過夜；

二、將上一步的離心管從水浴鍋中取出后，加入等體積飽和酚，蓋緊離心管，來(lái)回顛倒離心管在20min內(nèi)混勻；

三、在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，用移液管小心取出上清液，放另一離心管中，棄下層有機(jī)相；

四、向步驟三取的上清中加入等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇后來(lái)回顛倒離心管，混合10min后，在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，重復(fù)此步驟1-2次，直至取出的水相加入有機(jī)溶劑時(shí)無(wú)白色云霧狀物；

五、取上步驟四離心后的上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，混合10min，在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min；

六、取上一步離心后的上清，加入2倍體積的凍存后的無(wú)水乙醇，水平旋轉(zhuǎn)50～100轉(zhuǎn)后，在-20℃冰箱中放置30min以上，沉淀DNA；

七、將上一步放置于-20℃的離心管取出，在10000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min后，收集沉淀，得DNA；

八、向上一步得到的DNA中加入1mL體積百分含量為75％的乙醇，來(lái)回顛倒數(shù)次離心管，在8000rpm轉(zhuǎn)速下離心4～5min，倒掉乙醇，將管倒置在干凈的吸水紙上，干燥DNA沉淀；

九、向上一步干燥后的DNA中加入100-200μL滅菌的去離子水，在55℃水浴中溶解DNA；

十、向上一步的提取液中加入1μL的RNase，在常溫下放置30min，然后用0.1％的凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，-20℃冰箱中保存。其它與具體實(shí)施方式二相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)具體實(shí)施方式的組合同樣也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過以下實(shí)施例驗(yàn)證本發(fā)明有益效果：

實(shí)施例1

1、試驗(yàn)材料

本實(shí)施例所采用的馬鈴薯青枯病菌菌株如表1所示，菌株RS1～4由國(guó)際馬鈴薯中心(簡(jiǎn)稱CIP)提供用于科學(xué)研究，其余菌株均為本課題組通過TZC分離培養(yǎng)基對(duì)馬鈴薯青枯病感病植株進(jìn)行分離純化后，制成水溶液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1供試菌株名稱和來(lái)源

2、試驗(yàn)方法

2.1、試驗(yàn)所用細(xì)菌的基因組DNA提取

DNA提取方法參見商品化試劑盒的說明書。

2.2、馬鈴薯塊莖的DNA提取

1、取馬鈴薯塊莖0.1g放入勻漿管中，再加入2mL勻漿緩沖液，將材料迅速破碎后將液體抽出，放在5mL離心管中后，加入20μL巰基乙醇，迅速在65℃水浴中過夜；

2、將離心管從水浴鍋中取出后，加入等體積飽和酚，蓋緊離心管。緩慢來(lái)回顛倒離心管至少20min以混勻。不要過于劇烈，以防將DNA打斷；

3、10000rpm離心10min。含DNA的水相在上層，含蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片的有機(jī)相在下層；

4、用移液管小心取出上清液，放另一離心管中，棄下層有機(jī)相；

5、加入等體積的飽和酚/氯仿/異戊醇后緩慢來(lái)回顛倒離心管，混合10min后10000rpm離心10min。重復(fù)此步驟1-2次，直至取出的水相加入有機(jī)溶劑時(shí)看不到白色云霧狀物；

6、取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇，混合10min，10000rpm離心10min。

7、取上清，加入2倍體積的、冰冷的無(wú)水乙醇，水平旋轉(zhuǎn)50～100轉(zhuǎn)后放在-20℃冰箱中30min以上，沉淀DNA；

8、將離心管取出，10000rpm離心10min后，可見管的下方有沉淀，即DNA；

9、小心地倒掉液體，加入1mL 75％的乙醇，來(lái)回顛倒數(shù)次離心管，以移去沉淀塊中可能有的異物，8000rpm離心4-5min，小心倒掉乙醇，將管倒置在干凈的吸水紙上，讓乙醇流盡，干燥DNA沉淀；

10、根據(jù)沉淀塊的大小加入100-200μL滅菌的去離子水，在55℃水浴中溶解DNA；

11、為了去除提取到的RNA，在提取液中加入1μL RNase，在常溫下放置30min，然后用0.1％的凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。-20℃冰箱中保存。

上述步驟提取DNA的方式，也可以從植株體中提取DNA。

2.3、PCR特異性引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)Genebank中的登錄號(hào)為DQ924957的Ralstonia solanacearum strain TW56 16S rRNA序列，使用Primers5.0軟件設(shè)計(jì)馬鈴薯青枯病菌的特異性擴(kuò)增引物，引物由上海生工生物公司合成，引物序列如下：

QK5-1：5'-GCTAATACCGCATACGAC-3'

QK3-1：5'–GAGCGTCAGTGTTATCCC-3'；

目的片段長(zhǎng)度為591bp。

2.4、PCR擴(kuò)增

PCR的反應(yīng)體系均為25mL。PCR反應(yīng)條件確定主要是對(duì)擴(kuò)增程序的最適退火溫度。

2.4.1.PCR反應(yīng)體系

2.4.2.PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)PCR反應(yīng)條件中退火溫度進(jìn)行優(yōu)化：

2.4.5.PCR檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證

用設(shè)計(jì)合成的特異性引物對(duì)所供試病菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別以馬鈴薯青枯病菌(RS1～4)、馬鈴薯黑脛病菌(BYH2、GSH1、NMH1)DNA、馬鈴薯環(huán)腐病菌(by06-6、hc-42、p06-4)DNA、馬鈴薯晚疫病菌(ch10、ch11、ncppb)DNA為模板，檢測(cè)PCR檢測(cè)體系的特異性。

2.4.6.PCR檢測(cè)體系的靈敏度驗(yàn)證

為鑒定所設(shè)計(jì)引物及PCR反應(yīng)體系所能測(cè)定的DNA最小濃度，將提取的DNA依次稀釋成1ng，100Pg，10Pg，1Pg，100fg，10fg的6個(gè)不同濃度，用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)凝膠電泳結(jié)果測(cè)定引物的靈敏度。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

3、試驗(yàn)結(jié)果

3.1青枯病菌基因組DNA提取

將所提取的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。從圖中可看出，獲得的DNA完整，質(zhì)量較好，沒有降解，能夠滿足PCR分離基因的要求，可以用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。

4、PCR的擴(kuò)增

4.1退火溫度的篩選

對(duì)馬鈴薯青枯病菌常規(guī)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的條件為退火溫度。篩選結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示：59℃為最適退火溫度。

4.2PCR擴(kuò)增

用馬鈴薯青枯病菌特異性引物對(duì)供試12個(gè)青枯病菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。

4.3PCR檢測(cè)的特異性鑒定

用馬鈴薯青枯病菌特異性引物對(duì)供試菌株的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4。由圖可以看出，所用的青枯病菌都能擴(kuò)增出大小為591bp的條帶，而其他參考病原菌及對(duì)照均未擴(kuò)增出條帶，說明設(shè)計(jì)的引物對(duì)青枯病菌具有高度的特異性。

4.4PCR檢測(cè)的靈敏性鑒定

采用馬鈴薯青枯病菌特異性引物對(duì)稀釋成1ng，100pg，10pg，lpg，100fg，10fg的共6個(gè)不同濃度的青枯病菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示。由結(jié)果可以看出檢測(cè)到最低濃度為1pg的模板DNA。

4.5目的片段測(cè)序

將經(jīng)過鑒定的陽(yáng)性菌液送到上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列如下(下劃線部分為引物)。

AAATCGGTCAGTGCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGAGCGTCAGTGTTATCCCAGGGGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACTGCTACACGTGGAATTCTACCCCCCTCTGACACACTCTAGCCGTGCAGTCACCAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGATTTCACATCGGTCTTGCACAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGGACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTCCTTATTCTTCCGGTACCGTCATCGACCCCAGGTATTAACCAGAGCCATTTCTTTCCGGACAAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCGTCCTCTCAGACCAGCTACTGATCGTCGCCTTGGTGAGCCTTTACCTCACCAACTAGCTAATCAGACATCGGCCGCTCCTATAGCATGAGGCCTTGCGGTCCCCCACTTTCACCCTCAGGTCGTATGCGGTATTAGCAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAGGCGGTAATACGGTATCCACAGATCAGGGGATACGCAGAAAGACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAGGCCAGGACCGTAAAAGGCGCGTTGCTGGCGTTTTCCATAGG。

實(shí)施例2

本實(shí)施例應(yīng)用本發(fā)明的PCR引物和檢疫標(biāo)準(zhǔn)推薦PCR檢測(cè)引物，對(duì)采自我國(guó)廣西省、廣東省、福建省、內(nèi)蒙古等省份的35份感染細(xì)菌病害的樣品進(jìn)行比較試驗(yàn)。

1材料與方法

1.1樣品

健康馬鈴薯植株(陰性對(duì)照)由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所提供。

馬鈴薯青枯病標(biāo)準(zhǔn)菌株Ralstonia solanacearum購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院微生物保藏中心。

待測(cè)樣品：從我國(guó)廣西省、廣東省、福建省、內(nèi)蒙古等地區(qū)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)采集，見表2。

表2樣品信息

1.2試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP、購(gòu)自TaKaRa(大連)公司，引物合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3植物基因組DNA提取

按照天根新型植物基因組DNA提取試劑盒說明書推薦方法提取塊莖DNA。

1.4 PCR擴(kuò)增

供試引物序列見表3。本發(fā)明的引物QK5-1和QK3-1的退火溫度為59℃，而檢疫標(biāo)準(zhǔn)推薦的引物RS32和RS37的退火溫度為60℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察。

表3引物序列

2結(jié)果分析

2.1本發(fā)明引物的擴(kuò)增結(jié)果

供試樣品經(jīng)引物QK5-1和QK3-1擴(kuò)增后結(jié)果見圖6和圖7，從圖中可知，廣西省檢出4份青枯病樣品；廣東省16份樣品均檢出青枯病菌；福建省4份樣品的青枯病菌檢測(cè)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性。

2.2檢疫標(biāo)準(zhǔn)推薦引物的擴(kuò)增結(jié)果

供試樣品經(jīng)已知檢疫標(biāo)準(zhǔn)中推薦的引物擴(kuò)增結(jié)果見圖8和圖9，從圖中可知，廣西省的樣品(1-1～6、2-2～4)均為陰性；廣東省16份樣品均檢出青枯病菌；福建省4份樣品的青枯病菌檢測(cè)呈現(xiàn)弱陽(yáng)性。

2.3兩對(duì)引物的擴(kuò)增效率比較

以內(nèi)蒙古的四個(gè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)菌株同時(shí)進(jìn)行兩對(duì)引物的擴(kuò)增，電泳結(jié)果見圖10。從圖中可知，標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA濃度為20ng/μL，自行設(shè)計(jì)的引物QK5-1和QK3-1擴(kuò)增獲得目的產(chǎn)物，而RS32和RS37則未獲得目的產(chǎn)物。待測(cè)樣品的擴(kuò)增效率方面，自行設(shè)計(jì)的引物QK5-1和QK3-1優(yōu)于推薦引物RS32和RS37。

上述結(jié)果表明本發(fā)明所建立的PCR檢測(cè)體系，準(zhǔn)確率比推薦的檢測(cè)方法更高，擴(kuò)增效率也更高。