本發(fā)明屬于藥物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物及其制備和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

一氧化氮是生物體內(nèi)一種重要的信使分子，參與體內(nèi)多種生命活動(dòng)。1987年，科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮是內(nèi)皮衍生松弛因子，在心血管系統(tǒng)中起著調(diào)控血管松弛的作用。已有證據(jù)顯示，一氧化氮在生物體的其他系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的作用，比如其在大腦中起著信號(hào)傳導(dǎo)的作用，在免疫系統(tǒng)中具有防御細(xì)菌攻擊和防止感染等作用。因此，一氧化氮成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。一氧化氮是一種氣體自由基，在生物體內(nèi)極不穩(wěn)定，使得生物體內(nèi)一氧化氮的檢測(cè)方法成為相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，因而，建立一種快速、高效、準(zhǔn)確、靈敏的一氧化氮檢測(cè)方法尤為重要。

熒光光度法檢測(cè)一氧化氮主要是基于熒光探針與一氧化氮的特異性反應(yīng)，生成強(qiáng)熒光的物質(zhì)。目前應(yīng)用最為廣泛的一氧化氮熒光探針是鄰苯二胺類，但其穩(wěn)定性差，使其應(yīng)用受到限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員仍致力于開(kāi)發(fā)一種檢測(cè)快速、高效、靈敏的一氧化氮熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物。

本發(fā)明的目的還在于提供上述含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物的制備方法及其在制備熒光探針中的應(yīng)用。

一種含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物，具有式I所示的結(jié)構(gòu)式：

式中，R為甲基，乙基，異丙基或丙基；R’為甲基，乙基，異丙基或丙基；n＝2-6。

優(yōu)選的，所述含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物如式Ⅱ所所示：

制備上述含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物的方法，按照如下步驟進(jìn)行：

1)以7-羥基-4-甲基香豆素為起始原料，在7-位引入甲基；

2)將4-位氧化成醛；

3)利用Hantzsch反應(yīng)引入1,4-二氫吡啶結(jié)構(gòu)單元。

以式Ⅱ化合物為例，其合成路線為：

上述含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物在制備一氧化氮檢測(cè)熒光探針中的應(yīng)用，其特征在于，所述含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物在pH值4-9條件下，與一氧化氮反應(yīng)，得到吡啶衍生物，在紫外光照射下產(chǎn)生熒光。

所述反應(yīng)是在溶劑中進(jìn)行，所述溶劑選自二甲基亞砜、二氯甲烷、乙醇、甲醇、乙腈中的一種。

合成得到的4d與一氧化氮的反應(yīng)為：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物，與一氧化氮反應(yīng)，生成熒光物質(zhì)，在紫外線照射下可定量檢測(cè)，具有檢測(cè)快速、高效、靈敏、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1為化合物4d與NO作用前后的紫外吸收光譜(c＝5μM)。

圖2為化合物4d與NO作用前后的熒光光譜(c＝5μM)。

圖3為化合物4d細(xì)胞內(nèi)NO的細(xì)胞顯像實(shí)驗(yàn)：明場(chǎng)(上)，對(duì)應(yīng)的熒光(下)(左)細(xì)胞在含有探針的培養(yǎng)基培養(yǎng)8h(右)細(xì)胞先在LPS的培養(yǎng)基先培養(yǎng)4h，后加入探針培養(yǎng)8h。

圖4為化合物4d及其與NO作用后產(chǎn)物4e對(duì)RAW264.7細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

實(shí)施例1：含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物的制備

合成路線如下所示：

化合物4a的合成

將7-羥基-4-甲基香豆素(3.5g，22mmol)用30mL丙酮溶解，加入碳酸鉀(6.03g，43.2mmol)，劇烈攪拌30min，加入碘甲烷(3.12g，22mmol)，加熱回流，用TLC板檢測(cè)反應(yīng)直至反應(yīng)完全。停止加熱，冷卻至室溫，減壓濃縮得白色固體，乙酸乙酯溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，飽和鹽水洗滌(50mL×3)，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，旋蒸除去溶劑得白色固體，乙醇重結(jié)晶得化合物4a，3.6g，產(chǎn)率95％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.50(d,J＝8.8Hz,1H),6.90–6.78(m,2H),6.14(d,J＝1.0Hz,1H),3.88(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ162.30,160.08,154.70,153.35,126.37,113.02,112.02,111.05,100.62,55.85,18.08.ESI-MS calculated 189.1,found 190.2[M+H]⁺。

化合物的4b合成

將(0.95g，5mmol)4a、50mL二甲苯加入圓底燒瓶中，攪拌并加熱，使其逐漸溶解。再加入二氧化硒(0.55g，5mmol)，回流反應(yīng)12h。停止加熱，熱抽濾，濾液遇冷有黃色固體析出，將濾液減壓濃縮得黃色固體4b(0.85g，產(chǎn)率84％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ10.08(s,1H),8.50(d,J＝9.0Hz,1H),6.93(dd,J＝9.0,2.6Hz,1H),6.87(d,J＝2.6Hz,1H),6.72(s,1H),3.89(s,3H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ193.69,162.55,160.36,155.87,143.51,126.87,121.27,112.83,108.16,101.07,55.93.ESI-MS calculated 203.2,found 204.1[M+H]⁺。

化合物的4b-1合成

將乙酰乙酸甲酯(10g，86mmol)、三乙二醇單甲醚(43g，258mmol)、4-二甲氨基吡啶(50mg，0.4mmol)依次加入250mL的圓底燒瓶中，同時(shí)加入溶劑甲苯50mL，加熱回流攪拌6h，停止加熱。將反應(yīng)液冷卻至室溫，減壓濃縮得黃色油狀殘留物，柱層析分離(石油醚：丙酮＝1:1)得黃色油狀物4b-1 15g，產(chǎn)率約為70％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.36–4.26(m,2H),3.76–3.69(m,2H),3.66(s,6H),3.56(s,2H),3.48(s,2H),3.38(s,3H),2.27(s,3H).ESI-MS calculated 248.1,found 271.2[M+Na]⁺。

化合物的4c合成

將上述產(chǎn)物4b(1.0g，5mmol)，4b-1(3.7g，15mmol)，溶于20mL乙醇中，攪拌下加入醋酸銨(1.1g，15mmol)，加熱回流4h，停止加熱，柱層析分離(石油醚：丙酮＝1:1)，得黃色油狀物4c，1.2g，產(chǎn)率40％。Mp.88-90℃,¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.21(d,J＝9.0Hz,1H),6.99–6.83(m,2H),6.78(s,1H),6.23(s,1H),5.38(s,1H),4.08-4.12(m,4H),3.87(s,4H),3.50-3.61(m,20H),3.36(s,6H),2.34(s,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ166.56,165.28,163.23,162.22,154.83,145.55,127.70,112.09,111.94,111.61,102.45,99.91,71.56,70.20,69.99,68.57,62.63,58.68,55.37,34.46,19.15.HRMS calcd for[M+H]⁺C₃₃H₄₆NO₁₃:663.2891,found 664.2964.IR(KRr)3336,3232,3086,3053,2879,1720,1691,1616,1496,1386,1274,1193,1095,840,748.

化合物4d的合成

將產(chǎn)物4c(0.2g，0.33mmol)溶于20mL二氯甲烷中，并加入5mL飽和的亞硝酸鈉溶液，攪拌條件下滴加2M鹽酸。2h后停止攪拌，反應(yīng)液用DCM萃取，飽和鹽水洗滌有機(jī)層3次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得黃色油狀產(chǎn)物4d(0.18g，產(chǎn)率約為90％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ6.84(d,J＝8.6Hz,1H),6.69(s,1H),6.63(d,J＝8.6Hz,1H),5.95(s,1H),3.96-4.00(d,J＝18.0Hz,4H),3.72(s,4H),3.34-3.44(m,19H),3.19-3.25(m,7H),2.54(s,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.61,162.34,159.32,157.13,154.51,150.70,139.98,127.11,124.48,111.67,111.52,111.46,100.25,71.20,69.82,69.79,69.70,67.75,64.10,58.29,55.18,22.95.HRMS calcd for[M+H]⁺C₃₃H₄₆NO₁₃:661.2736,found 662.2805.IR(KRr)3072,2875,1706,1608,1558,1510,1458,1388,1371,1294,1230,1147,1041,852,748.

實(shí)施例2：含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物及其與一氧化氮作用產(chǎn)物的紫外、熒光性質(zhì)

如圖1所示，為化合物4d與NO作用前后的紫外吸收光譜(c＝5μM)。

如圖2所示，含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物4d(λ_ex＝324nm,λ_em＝450nm)的自身熒光很弱，熒光量子產(chǎn)率0.3％，當(dāng)其捕捉到NO后，產(chǎn)物4e(λ_ex＝334nm,λ_em＝450nm)熒光強(qiáng)度明顯提高，熒光量子產(chǎn)率達(dá)到45％。

在本實(shí)施例條件下，一氧化氮的檢出限為18nmol/L。

實(shí)施例3:含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物對(duì)細(xì)胞內(nèi)一氧化氮的檢測(cè)

首先將細(xì)胞用含有LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)8h，向細(xì)胞培養(yǎng)基中加入含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物4d，使其濃度在20μM，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(加入含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物4d但不加LPS)。由圖3可知，加入含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物4d和LPS的實(shí)驗(yàn)組觀察到明顯的熒光現(xiàn)象，而對(duì)照組熒光不明顯。此外，為考察該含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物4d是否可用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO，還必須考慮其細(xì)胞毒性。通過(guò)MTT法來(lái)測(cè)定含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物4d對(duì)細(xì)胞存活率是否有明顯的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)使用的濃度范圍內(nèi)，含有多醚鏈二氫吡啶類衍生物4d及其與NO作用后產(chǎn)物4e對(duì)細(xì)胞存活率影響較小(如圖4所示)。

以上公開(kāi)的僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。