本發(fā)明涉及土壤污染治理領(lǐng)域，具體涉及一種加速垃圾填埋場甲烷氧化制劑的制備及其應(yīng)用，利用外源添加微生物信號(hào)分子作為甲烷氧化制劑，提高垃圾填埋處信號(hào)分子的含量，從而減低填埋場中的甲烷含量。

背景技術(shù)：

人類活動(dòng)排放的溫室氣體所導(dǎo)致的全球變暖已成為世界重大環(huán)境問題之一。在溫室氣體中，CO₂、CH₄和氟氯烴構(gòu)成了最主要的溫室效應(yīng)。研究結(jié)果顯示，CH₄在近200年內(nèi)呈加速上升態(tài)勢，若不加以控制，預(yù)計(jì)2030年大氣中CH₄將達(dá)2.34μL·L^-1，可能成為溫室效應(yīng)的主要因素。由于CH₄的溫室效應(yīng)為CO₂的21倍，可見，若甲烷盡可能多地被氧化而轉(zhuǎn)化為CO₂，則總釋放氣體的增溫潛能會(huì)大幅下降，起到了溫室氣體減排的作用。我國的垃圾填埋場絕大多數(shù)都采用厭氧填埋工藝，此種工藝甲烷產(chǎn)生率較高，穩(wěn)定態(tài)填埋氣中CH₄含量約占45％～60％。作為《京都議定書》簽約國，找到一種經(jīng)濟(jì)高效的減少填埋場CH₄排放的方法十分必要，而填埋場甲烷氧化是控制甲烷釋放的一種經(jīng)濟(jì)高效的手段

甲烷氧化主要是由甲烷氧化細(xì)菌完成的。甲烷氧化菌是甲基氧化菌的一個(gè)分支，其獨(dú)特之處在干其能利用甲烷作為唯一的碳源和能源，將甲烷氧化為二氧化碳。此外甲烷氧化細(xì)菌還能參與其它一些重要的生態(tài)過程。但由于填埋場中甲烷氧化菌的活性較低，能夠氧化的甲烷量較少，所以目前垃圾填埋場中甲烷氧化的作用不明顯。

申請?zhí)枮?01310521595.0的中國發(fā)明專利提供了甲烷氧化菌菌液的制備方法、垃圾填埋場覆蓋材料及垃圾填埋場甲烷減排的方法，指出了以礦化垃圾作為甲烷氧化菌菌種來源，以滲濾液作為培養(yǎng)基混合培養(yǎng)甲烷氧化菌，得到甲烷氧化菌菌液來氧化甲烷。但由于操作比較復(fù)雜，成功率較低且成本較高，所以該方法難以大規(guī)模使用。申請?zhí)枮?01010157441.4的中國發(fā)明專利公布了一種加強(qiáng)填埋場覆蓋層甲烷氧化的方法，涉及一種能富集礦化垃圾內(nèi)部嗜甲烷微生物的方法，將糖溶液加入礦化垃圾后馴化為覆蓋層材料鋪在生活垃圾表面來提高覆蓋層的甲烷氧化效率。雖然成本較低，比普通的填埋場覆蓋材料的甲烷氧化效率要高，但甲烷氧化量還是有限，而且不適合大規(guī)模使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種加速垃圾填埋場甲烷氧化的方法，采用不同的微生物分泌的信號(hào)分子，提高垃圾中信號(hào)分子的含量，增強(qiáng)垃圾中甲烷氧化菌的活性，將產(chǎn)生的甲烷含量顯著降低。

一種加速垃圾填埋場甲烷氧化制劑，包括信號(hào)分子AHLs和自誘導(dǎo)物AI-2(Autoinducer-2)，其中AHLs類包含N-butanoyl-homoserine lacton(C4-HSL)、N-hexanoyl-homoserine lacton(C6-HSL)、N-octanoyl-homoserine lactone(C8-HSL)、N-3-oxo-hexanoyl-homoserine lactone(3-oxo-C6-HSL)以及N-3-oxo-octanoyl-homoserine lactone(3-oxo-C8-HSL)，以質(zhì)量百分比計(jì)組成如下：

各組分的質(zhì)量百分比之和是100％。

進(jìn)一步優(yōu)選，以質(zhì)量百分比計(jì)組成如下：

各組分的質(zhì)量百分比之和是100％。

在上述優(yōu)選范圍內(nèi)制備得到的制劑可使垃圾填埋場的甲烷含量降低55％以上。

更進(jìn)一步優(yōu)選地，以質(zhì)量百分比計(jì)組成如下：

各組分的質(zhì)量百分比之和是100％。

在上述優(yōu)選范圍內(nèi)制備得到的制劑可使垃圾填埋場的甲烷含量降低80％左右。

最優(yōu)選地，以質(zhì)量百分比計(jì)組成如下：

在上述優(yōu)選范圍內(nèi)制備得到的制劑可使垃圾填埋場的甲烷含量降低達(dá)85％。

本發(fā)明還提供一種如所述加速垃圾填埋場甲烷氧化制劑的制備方法，包括如下步驟：

將分泌對應(yīng)信號(hào)分子的不同細(xì)菌分別培養(yǎng)至對數(shù)期，所得培養(yǎng)液分別萃取提取對應(yīng)培養(yǎng)液中的信號(hào)分子，然后將所得信號(hào)分子按配比混合。

作為優(yōu)選，分泌所述信號(hào)分子的細(xì)菌購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心，包括銅綠假單胞菌(分泌C4-HSL)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1.2421；惡臭假單胞菌(分泌3-oxo-C6-HSL和3-oxo-C8-HSL)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1.2309；熒光假單胞菌(分泌C6-HSL)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1.3202；茄科羅爾斯通氏菌(分泌C8-HSL)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1.2839；大腸埃希氏菌(分泌AI-2)，保藏編號(hào)為CGMCC NO.1.4244。

優(yōu)選地，培養(yǎng)細(xì)菌所用培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基或casein培養(yǎng)基；進(jìn)一步優(yōu)選為casein培養(yǎng)基。細(xì)菌的培養(yǎng)條件為37℃，250rpm。

LB培養(yǎng)基的成分組分為：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、

pH 7.0。

casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄ 0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄1.5g/L、NH₄NO₃1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2。

優(yōu)選地，萃取所用溶劑為乙酸乙酯、甲醇或乙腈。進(jìn)一步優(yōu)選，所用溶劑為乙酸乙酯。

優(yōu)選地，所述溶劑需進(jìn)行酸化方可用于信號(hào)分子的濃縮提純，酸化處理所用試劑為冰乙酸、鹽酸或甲酸。本發(fā)明中將不同菌種在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，然后分別從對應(yīng)的培養(yǎng)液中提取信號(hào)分子，最后將所提取的信號(hào)分子按配比混合。

本發(fā)明還提供一種加速垃圾填埋場甲烷氧化的方法，包括如下步驟：將所述加速垃圾填埋場甲烷氧化制劑分別注射至垃圾填埋層的不同高度處，優(yōu)選為頂部、中部和底部。

具體的，通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中，注射的深度有三處，分別為垃圾的頂部，中部和底部。具體操作為：在垃圾填埋場上劃區(qū)設(shè)點(diǎn)，利用鋼針或借助打井，伸至垃圾內(nèi)部不同深度分別注射試劑。用量為每噸垃圾100～1000mg，每2～4天注射一次，注射10～15次，能夠顯著去除垃圾填埋場產(chǎn)生的甲烷含量。

最優(yōu)選的，甲烷氧化制劑的添加處為垃圾中部。

群體感應(yīng)作為一種廣泛存在于細(xì)胞間的交流調(diào)控機(jī)制，具有調(diào)控誘導(dǎo)細(xì)胞定向生長及胞外代謝產(chǎn)物合成的功能，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)加入信號(hào)分子能使甲烷氧化菌產(chǎn)生生物膜，增強(qiáng)抵抗外界干擾的能力，這對提高甲烷氧化菌的活性具有重要作用。本發(fā)明將不同種類群體感應(yīng)的信號(hào)分子作為加速垃圾填埋場甲烷氧化制劑，能夠顯著提高填埋場中甲烷氧化菌的活性，顯著地去除了甲烷含量，而且操作簡單，成本較低，是一種較好的實(shí)現(xiàn)垃圾填埋場甲烷氧化的方法。

為了保證一定甲烷去除率的前提下降低成本，添加的制劑用量為每噸垃圾300～700mg。

本發(fā)明對制劑的添加量及制備過程進(jìn)行了優(yōu)化，本發(fā)明能在較少的制劑使用量的情況下，達(dá)到較高的去除甲烷的效果，而且通過施加不同種類的信號(hào)分子，能夠?qū)Σ煌氖荏w菌(包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌)都產(chǎn)生作用，使甲烷的去除效率更高。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的成分組分為：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、pH 7.0，將不同菌種在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將不同菌種在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(3)通過比較，發(fā)現(xiàn)casein培養(yǎng)基的效果好于LB培養(yǎng)基，casein培養(yǎng)基產(chǎn)生的信號(hào)分子量相比LB培養(yǎng)基提高了30％。

實(shí)施例2

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期,每種細(xì)菌均培養(yǎng)三組。

(2)提取信號(hào)分子，第一組用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸來酸化。

(3)提取信號(hào)分子，第二組用甲醇作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前甲醇用冰乙酸來酸化。

(4)提取信號(hào)分子，第三組用乙腈作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙腈用冰乙酸來酸化。

(5)通過比較，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯作溶劑萃取效果較好，萃取所得產(chǎn)品的量要比其他溶劑高20％。

實(shí)施例3

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，每種細(xì)菌均培養(yǎng)三組。

(2)提取信號(hào)分子，第一組用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸來酸化。

(3)提取信號(hào)分子，第二組用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用鹽酸來酸化。

(4)提取信號(hào)分子，第三組用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用甲酸來酸化。

(5)通過比較，發(fā)現(xiàn)鹽酸酸化后，信號(hào)分子持續(xù)存在時(shí)間為10小時(shí)，甲酸酸化后為12小時(shí)，冰乙酸酸化后為20小時(shí)，所以用冰乙酸酸化效果更好。

實(shí)施例4

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干，對應(yīng)信號(hào)分子的含量采用HPLC或報(bào)告菌株法進(jìn)行檢測，具體可采用如下方法：

AHLs測定采用HPLC法：將含信號(hào)分子的乙酸乙酯于35℃、40r/min旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸出溶劑。用0.22um濾膜過濾的乙腈與水(1:1，v/v)2ml溶解信號(hào)分子，-80℃保存?zhèn)溆?，然后HPLC法檢測。

HPLC檢測條件為Waters X bridge^TMC18柱(5um d，4.6*250mm)柱溫為35℃，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(D)(A；D＝50:50，v/v)，流速為0.7mL/min，檢測波長為210nm。

AI-2可采用群體報(bào)告菌哈維氏弧菌Vibro harveyi BB170(luxN::Tn5:sensor1^-，sensor1^-)進(jìn)行測定(TAGA M E，XAVIER K B.Methods for Analysis of Bacterial Autoinducer-2 Production[J].Current Protocols in Microbiology，2005:1C.1.1-1C.1.15.)

6)定量檢測后-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

具體步驟為：通過要注射的制劑總量，分別計(jì)算每種信號(hào)分子要添加的量，再將含有對應(yīng)量信號(hào)分子的混合制得所需制劑。(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的頂部，用量為每噸垃圾500mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了55％左右。

實(shí)施例5

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的底部，用量為每噸垃圾500mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了65％左右。

實(shí)施例6

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的中部，用量為每噸垃圾500mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了70％左右。

實(shí)施例7

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的中部，用量為每噸垃圾700mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了80％左右。

實(shí)施例8

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的中部，用量為每噸垃圾700mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了80％左右。

實(shí)施例9

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的中部，用量為每噸垃圾700mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了80％左右。

實(shí)施例10

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的中部，用量為每噸垃圾700mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了80％左右。

實(shí)施例11

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的中部，用量為每噸垃圾700mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了80％左右。

實(shí)施例12

(1)首先對分泌信號(hào)分子的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，采用casein培養(yǎng)基：NaCl 1g/L、MgSO₄0.2g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、Na₂HPO₄ 1.5g/L、NH₄NO₃ 1g/L、酪蛋白10g/L、pH 7.2，將銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、茄科羅爾斯通氏菌和大腸埃希氏菌在各自培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期。

(2)分別提取各菌液中的信號(hào)分子，用乙酸乙酯作為溶劑進(jìn)行萃取，萃取前乙酸乙酯用冰乙酸酸化，具體步驟如下：

1)取3ml菌液到15ml玻璃離心管中，加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯，渦旋30s(用力搖晃10次)。

2)靜置10min使兩相分離，若不分層10000rpm 3min使兩相分離，若分層再不明顯再加入3ml含1‰冰乙酸的乙酸乙酯使其分層。

3)用移液槍吸取有機(jī)層到干凈10ml西林瓶中。

4)重復(fù)步驟1-3(西林瓶最后共9ml)。

5)氮吹最后的樣品至全干。

6)-20℃保存。

(3)將從各菌液提取的信號(hào)分子按如下質(zhì)量比混合(即混合后的各組分質(zhì)量百分比如下)：

(4)通過深注射的方法將該加速甲烷氧化制劑添加到垃圾中：利用鋼針注射器進(jìn)行添加，注射的位置為垃圾的中部，用量為每噸垃圾700mg。

(5)每3天注射一次，注射10～15次，垃圾填埋場的甲烷含量降低了85％左右。

以上所述僅為本發(fā)明專利的具體實(shí)施案例，但本發(fā)明專利的技術(shù)特征并不局限于此，任何相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)，所作的變化或修飾皆涵蓋在本發(fā)明的專利范圍之中。