本發(fā)明涉及一種利用文蛤蛋白制備α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的方法，屬于天然活性物質(zhì)制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，其基本病理特點(diǎn)為胰島素分泌絕對(duì)或者相對(duì)不足，或者外周組織對(duì)胰島素不敏感，引起以糖代謝紊亂為主，并包括脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種全身綜合性疾病。治療糖尿病的作用機(jī)理是直接或者間接增加胰島素的分泌量，抑制胰高血糖素分泌，改善胰島素抵抗，刺激胰腺導(dǎo)管前體細(xì)胞分化再生胰島β細(xì)胞，抑制胰島β細(xì)胞過度凋亡；糖分解過程中的各種酶抑制劑也是糖尿病的治療思路。

α-葡萄糖苷酶是一類主要分布于小腸上皮絨毛膜刷狀沿上，可降解蔗糖、麥芽糖、乳糖在內(nèi)的一系列低聚糖的糖苷酶。α-葡萄糖苷酶抑制劑可競(jìng)爭(zhēng)性抑制葡萄糖苷水解酶，進(jìn)而抑制多糖及蔗糖的分解，抑制碳水化合物在小腸上部的吸收，緩解餐后血糖的升高，預(yù)防因血糖波動(dòng)引發(fā)的心血管疾病等。目前抑制α-糖苷酶水解的藥物主要是阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇、乙格列酯，都屬于化學(xué)合成類藥物，主要依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴、產(chǎn)率低、活性低及生產(chǎn)過程中存在的安全性和設(shè)備要求高等問題。

我國擁有豐富的海洋動(dòng)物資源，如果能利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)海洋動(dòng)物蛋白質(zhì)資源進(jìn)行深加工，合理的選用靶酶類用以制備相對(duì)應(yīng)的天然抑制劑等產(chǎn)物，將使海洋動(dòng)物生物活性產(chǎn)物的研究具有更廣闊的前景。天然海洋蛋白原料可控酶解法制備的α-葡萄糖苷酶抑制劑還可以作為一種合適的輔助降血糖類保健功能食品的生產(chǎn)原料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決目前關(guān)于α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的低產(chǎn)率、低活性和高成本，以及生產(chǎn)過程中存在的安全性和設(shè)備要求高等問題，本發(fā)明提供了一種利用海洋動(dòng)物蛋白制備α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的方法，采用綠色生物轉(zhuǎn)化的理念，重點(diǎn)創(chuàng)新基于生物酶定點(diǎn)催化可控酶解制備α-葡萄糖苷酶抑制劑的高效生產(chǎn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了海洋動(dòng)物蛋白資源的高值化利用。

本發(fā)明的制備α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的方法，包括：以高蛋白海洋動(dòng)物為原料，原料經(jīng)脫水、烘干、粉碎得到文蛤蛋白粉后，加入蛋白酶進(jìn)行第一次酶解，在酶解后的上清液中加入蛋白酶進(jìn)行第二次酶解，煮沸滅酶，收集第二次酶解的上清液，即為富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的酶解液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述高蛋白海洋動(dòng)物為文蛤。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第一次酶解所用的蛋白酶優(yōu)選為堿性蛋白酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第二次酶解所用的蛋白酶為復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一種或者多種，并最終選出其中效果最佳的一種或多種。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述復(fù)合蛋白酶為購自諾維信公司的型號(hào)為Protamex的復(fù)合蛋白酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第一次酶解的反應(yīng)條件如下：文蛤蛋白粉：緩沖液＝1:70～1:100(質(zhì)量體積比，單位g/mL)，蛋白酶添加量6-10KU/g干基質(zhì)，反應(yīng)溫度45～55℃，反應(yīng)時(shí)間4～8h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第一次酶解和第二次酶解的酶解反應(yīng)是在pH 8～10下進(jìn)行。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述第一次酶解的反應(yīng)條件如下：文蛤蛋白粉：緩沖液＝1:100(m/v，單位g/mL)，蛋白酶添加量8KU/g干基質(zhì)，反應(yīng)溫50℃，反應(yīng)時(shí)間6h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述緩沖液為NaHPO₄-NaH₂PO₄(0.02mol/L，pH9.0)緩沖液。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的第二次酶解的反應(yīng)條件如下：按照1.5×10⁴U/mL～2.5×10⁴U/mL的量添加蛋白酶，酶解時(shí)間為2-4h，反應(yīng)溫度45～55℃。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的第二次酶解的反應(yīng)條件如下：按照2×10⁴U/mL的量添加蛋白酶，酶解時(shí)間為3h，反應(yīng)溫度50℃。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法還包括將富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的酶解液進(jìn)行干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制劑產(chǎn)品。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法具體包括以下步驟：

(1)新鮮的文蛤蛋白經(jīng)脫水，烘干至2～10％含水量，然后粉碎至0.025～0.1mm；

(2)于步驟(1)粉碎后物料中加入一定量堿性蛋白酶，混合均勻，置于反應(yīng)器中45～55℃反應(yīng)一段時(shí)間，離心后，收集上清液；

(3)取步驟(2)中上清液重新以1.5×10⁴U/mL～2.5×10⁴U/mL的量加入蛋白酶，混合均勻，45～55℃下反應(yīng)2-4h，滅酶，收集濾液，即為富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的酶解液，保藏備用；

(4)將收集步驟(3)中的濾液混勻后，經(jīng)干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(3)中所述蛋白酶主要是指復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、氨肽酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一種，并最終優(yōu)選出復(fù)合蛋白酶。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(4)中的干燥是指空氣噴霧干燥和/或冷凍干燥，目的產(chǎn)物為粉末狀固體，得率為30–60％，即1g文蛤蛋白粉可得到粉末狀固體0.3-0.6g。

本發(fā)明還要求保護(hù)按照上述所述的方法得到的α-葡萄糖糖苷酶抑制劑，及其在制備藥物方面的應(yīng)用。

所述藥物，是指治療和/或抑制和/或緩解糖尿病或者心腦血管疾病的藥物。

本發(fā)明的有益效果：

(1)我國擁有豐富的海洋動(dòng)物資源，本發(fā)明利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)資源進(jìn)行深加工，合理的選用酶類等用以制備蛋白酶抑制劑等天然產(chǎn)物，使海洋動(dòng)物生物活性的研究具有更廣闊的前景。

(2)以文蛤蛋白為原料，用蛋白酶對(duì)文蛤中蛋白進(jìn)行組合可控酶解獲得具備α-葡萄糖糖苷酶抑制活性的酶解液。該酶解液主要成分為多肽類，具有良好的熱穩(wěn)定性、一定的抗氧化性及對(duì)個(gè)別蛋白酶表現(xiàn)出一定的抑制性。所得天然食物來源的肽類有藥食兩用的保健治療作用。對(duì)未來的醫(yī)藥保健與食品的健康發(fā)展具有推動(dòng)與促進(jìn)意義。

(3)按照本發(fā)明方法得到的富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的文蛤酶解液，多肽濃度為3.75mg/ml，對(duì)0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率為56.44％，文蛤蛋白酶解液中相對(duì)分子質(zhì)量占1000Da以下的要占95.18％；對(duì)α-葡萄糖苷酶、木瓜蛋白酶都有抑制效果，而且還具有一定的抗氧化性。

(4)按照本發(fā)明方法，利用1g文蛤蛋白粉可得到粉末狀α-葡萄糖糖苷酶抑制劑0.3-0.6g。

附圖說明

圖1為文蛤蛋白制備α-葡萄糖糖苷酶抑制劑流程圖；

圖2為文蛤酶解液多肽分子量分布圖；

圖3為文蛤酶解液的溫度穩(wěn)定性；

圖4為文蛤酶解液抑制糖苷酶活性的“量-效”關(guān)系曲線；

圖5為文蛤酶解液抑制木瓜蛋白酶活性的“量-效”關(guān)系曲線。

具體實(shí)施方式

α-葡萄糖糖苷酶抑制率的測(cè)定：

采用PNPG法，首先取1mL待測(cè)樣品加入離心管中，接著加入1ml的0.5mg·mL^-1α-葡萄糖苷酶，混合均勻后于37℃水浴保溫100min，再加入1mL的10mmol·L^-1PNPG反應(yīng)1h后加入1mL的1mol·L^-1Nα₂CO₃終止反應(yīng)，在405nm處測(cè)定吸光度Αi；1mL待測(cè)樣品加入離心管中，接著加入1mL的0.5mg·mL^-1α-葡萄糖苷酶，混合均勻后于37℃水浴保溫10min，加入1mL的磷酸鈉緩沖液反應(yīng)1h，操作同上，吸光值為Αj；取1mL緩沖液加入離心管中，操作同上，吸光值為Αo，樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率的公式：

實(shí)施例1：文蛤蛋白的制備與第一次酶解

以文蛤蛋白粉為原料，溶于質(zhì)量體積比為1:100的NaHPO₄-NaH₂PO₄(0.02mol/L，pH9.0)緩沖液中，堿性蛋白酶加入量E/S＝8000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后50℃酶解6h。酶解結(jié)束后煮沸滅酶15min，靜止冷卻后離心(8000r/min)，棄去沉淀得到含有α-糖苷酶抑制劑的文蛤酶解液。酶解液中多肽濃度約為2.89mg/ml，酶解原液對(duì)α-葡萄糖糖苷酶抑制率達(dá)到50％左右。

此外，發(fā)明人還嘗試過分別采用胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶酶解文蛤粉，測(cè)定酶解液酶解前后α-葡萄糖葡萄糖糖苷酶抑制率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未酶解的文蛤蛋白粉緩沖液對(duì)α-葡萄糖糖苷酶沒有抑制作用，胰蛋白酶酶解前后原液α-葡萄糖糖苷酶抑制率只增加了30％左右，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶酶解文蛤蛋白粉，α-葡萄糖糖苷酶抑制率幾乎沒有變化或者降低。

由此可見，堿性蛋白酶酶解文蛤產(chǎn)物的前后α-葡萄糖糖苷酶抑制性效果要顯著好于其他酶的酶解效果。

實(shí)施例2：二次酶解文蛤蛋白粉制備α-糖苷酶抑制劑

第一次酶解：新鮮的文蛤蛋白經(jīng)脫水，烘干至5％含水量，然后粉碎得到文蛤蛋白粉，以文蛤蛋白粉為原料，溶于質(zhì)量體積比為1:100的NaHPO₄-NaH₂PO₄(0.02mol/L，pH9.0)緩沖液中，堿性蛋白酶加入量E/S＝8000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后50℃酶解6h，離心、取上清液，即得到第一次酶解液。

第二次酶解：向第一次酶解液中重新加入2×10⁴U/mL蛋白酶，混合均勻，置于50℃的反應(yīng)器中反應(yīng)3h，滅酶，離心后，收集濾液，即為富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的文蛤酶解液，保藏備用。

發(fā)明人嘗試了分別使用復(fù)合蛋白酶(購買自諾維信公司，型號(hào)為Protamex)、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶進(jìn)行第二次酶解，并比較了最終酶解液分子量的差異及對(duì)α-糖苷酶抑制率的變化。結(jié)果顯示，(1)二次酶解后酶解液一千以上的分子量含量均有降低，說明一次酶解所獲得的α-糖苷酶抑制劑為混合肽類，它可以被蛋白酶繼續(xù)降解發(fā)生分子量的變化；(2)除了復(fù)合蛋白酶外，酶解液中α-糖苷酶抑制率均降低；中性蛋白酶酶解液α-糖苷酶抑制活性下降5％左右，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的繼續(xù)降解酶解液α-糖苷酶抑制活性下降超過10％；復(fù)合蛋白酶酶解液α-糖苷酶抑制活性不降反而提高，酶解液抑制活性提高到55％以上。這可能是因?yàn)閺?fù)合蛋白酶具有內(nèi)切與外切兩種蛋白酶活性，通過它進(jìn)一步對(duì)一次酶解液的協(xié)同水解作用后所獲得的特定水解肽產(chǎn)物區(qū)段的活性有提高，二次酶解也同時(shí)考察了一次酶解產(chǎn)物對(duì)幾種蛋白酶的敏感性，最終優(yōu)選出復(fù)合蛋白酶為二次可控酶解的最佳酶類。

經(jīng)復(fù)合蛋白酶處理得到的文蛤酶解液的多肽濃度為3.75mg/ml，酶解原液對(duì)0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率為56.44％。

將富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的文蛤酶解液，經(jīng)空氣噴霧干燥和/或冷凍干燥得到粉末狀固體，得率為30–60％，即1g文蛤蛋白粉可得到粉末狀固體0.3-0.6g。

實(shí)施例3：肽分子量分布

將細(xì)胞色素(MW 12500)，乙胺酸-乙胺酸-酪氨酸-精氨酸(MW 451)，桿菌酶(MW 1450)，乙胺酸-乙胺酸-乙胺酸(MW 189)標(biāo)準(zhǔn)品用0.22μm濾膜處理后，經(jīng)過以下色譜條件上樣：液相色譜柱TSKgel 2000SWxl(300mm×7.8mm，5μm)；柱溫30℃，流動(dòng)相：水：三氯乙酸：乙腈＝550:450:1(V:V)，流速為1mL·min^-1，進(jìn)樣量5μL，檢測(cè)波長為220nm，根據(jù)出峰圖繪制相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線。

取實(shí)施例2得到的文蛤酶解液5mL與10％的三氯乙酸5mL混合均勻，靜止10min，10000r·min^-1離心10min，上清液用0.22μm濾膜處理，相同色譜條件下上樣測(cè)量α-糖苷酶抑制劑的分子量分布，結(jié)果表明文蛤蛋白酶解液中相對(duì)分子質(zhì)量占1000Da以下的要占95.18％。

實(shí)施例4：文蛤蛋白二次酶解所得α-糖苷酶抑制劑特性分析鑒定

將實(shí)施例2得到的經(jīng)二次酶解的富含α-糖苷酶抑制劑的文蛤酶解液進(jìn)行生物活性及性質(zhì)的表征，主要包括熱穩(wěn)定性、糖苷酶抑制率、蛋白酶抑制率及抗氧化性等。

(1)溫度穩(wěn)定性

將文蛤酶解液37℃、40℃、50℃、60℃和70℃下保溫5h，測(cè)定酶解液的α-糖苷酶活性抑制率。結(jié)果如圖3所示，由圖3可知，37℃下對(duì)α-糖苷酶活性抑制率達(dá)56.5％左右，在50℃抑制率保持在53％左右，70℃下抑制率也能維持在47％左右。以上數(shù)據(jù)表明，按照本發(fā)明方法得到的文蛤酶解液具有良好的溫度穩(wěn)定性。

(2)糖苷酶抑制率的測(cè)定

首先取1mL待測(cè)樣品(調(diào)整文蛤酶解液濃度，配置多肽濃度不同的樣品)加入離心管中，接著加入1mL的0.5mg·mL^-1α-葡萄糖苷酶，混合均勻后于37℃水浴保溫100min，再加入1mL的10mmol·L^-1PNPG反應(yīng)1h后加入1mL的1mol·L^-1Nα₂CO₃終止反應(yīng)，在405nm處測(cè)定吸光度Αi；1mL待測(cè)樣品加入離心管中，接著加入1mL的0.5mg·mL^-1α-葡萄糖苷酶，混合均勻后于37℃水浴保溫10min，加入1mL的磷酸鈉緩沖液反應(yīng)1h，操作同上，吸光值為Αj；取1mL緩沖液加入離心管中，操作同上，吸光值為Αo，樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制量效曲線如圖4所示。在一定范圍內(nèi)抑制率隨著樣液的含量增加而增加，其IC₅₀為2.16mg/ml。

(3)蛋白酶抑制率的測(cè)定

蛋白酶抑制劑可以通過調(diào)節(jié)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解達(dá)到一定的保健與治療疾病的目的，用天然活性物質(zhì)酶解后提取制備的蛋白酶抑制劑可以克服傳統(tǒng)生化蛋白酶抑制劑在食品、醫(yī)藥上的弊端，具有廣泛應(yīng)用前景。

采用福林酚測(cè)蛋白法：準(zhǔn)確吸取酶液1mL，緩沖液1mL，在40℃恒水浴中預(yù)熱l～2min，加入0.4mol/L三氯醋酸2mL搖勻使酶變性失活，2％酪蛋白溶液lmL，40℃反應(yīng)10min，靜置10min，吸取濾液1ml加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL，福林試劑1mL，40℃恒溫水浴內(nèi)保溫20min顯色。吸光值Α_j(680nm)；準(zhǔn)確吸取酶液1mL，樣液1mL，(樣液指本發(fā)明的文蛤酶解液配置的不同濃度的多肽溶液)在40℃恒水浴中預(yù)熱l～2min，加入2％酪蛋白溶液1mL，40℃反應(yīng)10min，0.4mol/L三氯醋酸2mL搖勻使酶變性失活，吸取濾液1ml加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5mL，福林試劑1mL，40℃恒溫水浴內(nèi)保溫20min顯色，吸光值Αi。以緩沖液代替上述樣液，吸光值Α₀以緩沖液代替酪蛋白操作同上，吸光值為Αj。

測(cè)定對(duì)于1mg/ml木瓜蛋白酶抑制率為12％。

(4)抗氧化活性的測(cè)定

a.DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基清除率(％)＝Α₀-(Αs-Αc)/Α₀×100％

公式中，Α₀—2.0ml蒸餾水+2.0mlDPPH溶液的吸光度值

Αs—2.0ml樣品溶液+2.0mlDPPH溶液的吸光度值

Αc—2.0ml樣品溶液+2.0ml蒸餾水的吸光度

通過計(jì)算可得文蛤酶解液DPPH清除率為23％。

b.羥自由基(OH^-)清除能力測(cè)定

采用鄰氮二菲法。取0.5mL樣品加入1mL 0.15mol L^-1磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，接著加入0.5mL用緩沖液溶解的1.8mmol·L^-1鄰二氮菲溶液和0.5mL 1.8mmol L^-1FeSO₄水溶液，迅速混勻，最后加入0.5mL 0.02％(V/V)的H₂O₂，在37℃下水浴60min，于536nm下測(cè)其吸光值(Αs)。用水代替樣品作為對(duì)照(Αc)。用水代替樣品和H₂O₂作為空白(Α₀)。

清除率(％)＝[(Αs-Αc)/(Α₀-Αc)]×100。

通過計(jì)算可得文蛤酶解液羥自由基清除率為15.58％。

實(shí)施例5：α-糖苷酶抑制劑的制備

第一次酶解：以文蛤蛋白粉為原料，溶于質(zhì)量體積比為1:70的NaHPO₄-NaH₂PO₄(0.02mol/L，pH9.0)緩沖液中，堿性蛋白酶加入量E/S＝6000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后55℃酶解8h，離心、取上清液，即得到第一次酶解液。

第二次酶解：向第一次酶解液中重新加入2.5×10⁴U/mL復(fù)合蛋白酶，混合均勻，置于55℃的反應(yīng)器中反應(yīng)2h，滅酶，離心后，收集濾液，即為富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的文蛤酶解液。

得到的文蛤酶解液的多肽濃度為3.55mg/ml左右，對(duì)0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率為53.12％，相對(duì)分子質(zhì)量占1000Da以下的占93.38％。

酶解液經(jīng)干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制劑。

實(shí)施例6：α-糖苷酶抑制劑的制備

第一次酶解：以文蛤蛋白粉為原料，溶于質(zhì)量體積比為1:90的NaHPO₄-NaH₂PO₄(0.02mol/L，pH9.0)緩沖液中，堿性蛋白酶加入量E/S＝10000U/g文蛤蛋白粉，充分混合后45℃酶解4h，離心、取上清液，即得到第一次酶解液。

第二次酶解：向第一次酶解液中重新加入1.5×10⁴U/mL復(fù)合蛋白酶，混合均勻，置于45℃的反應(yīng)器中反應(yīng)4h，滅酶，離心后，收集濾液，即為富含α-葡萄糖糖苷酶抑制劑的文蛤酶解液，得到的文蛤酶解液的多肽濃度為3.62mg/ml左右，對(duì)0.5mg/ml的α-糖苷酶抑制率為54.09％，相對(duì)分子質(zhì)量占1000Da以下的占94.52％。

酶解液經(jīng)干燥得到α-葡萄糖糖苷酶抑制劑。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。