本發(fā)明涉及一種抗旱相關(guān)的新miRNA，尤其是一種來(lái)源于棉花的、能夠用于分析和調(diào)節(jié)棉花抗旱性的新miRNA；本發(fā)明還涉及此miRNA的前體、其前體的編碼基因及其用途。

背景技術(shù)：

非生物脅迫影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，影響農(nóng)作物的產(chǎn)量，干旱脅迫是重要的非生物脅迫之一。在干旱脅迫下，棉花根系向土壤深層伸展，地上部分的主莖、果枝均受到抑制，節(jié)間縮短，植株變小，根莖比增大。另外，干旱脅迫下，棉花葉片氣孔部分或完全關(guān)閉，光合作用受到影響，蕾鈴脫落增加，降低產(chǎn)量。全世界干旱與半干旱地區(qū)耕地面積共約2.74億公頃，占總耕地的20%，對(duì)棉花抗旱性進(jìn)行研究，擴(kuò)大干旱和半干旱地區(qū)棉花種植面積對(duì)解決棉花供需矛盾和棉糧爭(zhēng)地矛盾意義重大。

miRNA是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)20-24 nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNA。miRNA基因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生pri-miRNA，然后在核內(nèi)被Drosha酶加工成大約70 nt的具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出核，在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過(guò)序列互補(bǔ)與特定靶基因的mRNA結(jié)合，引起mRNA降解或抑制mRNA翻譯從而對(duì)基因的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用(Llave et al., 2002; Palatnik et al., 2003; Tang et al., 2003)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明miRNA在植物非生物脅迫應(yīng)答機(jī)制中有非常重要的作用，相關(guān)miRNAs被不斷報(bào)道。棉花中，已有研究證明miRNA在抗鹽、抗旱等非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制中有重要作用。

本發(fā)明中，利用solexa技術(shù)，分別對(duì)正常條件下和干旱脅迫條件下生長(zhǎng)的棉花葉片中小RNA進(jìn)行測(cè)序，及前體序列分析，鑒定得到棉花中干旱脅迫相關(guān)的新的miRNA，并利用Real-time PCR技術(shù)對(duì)其在干旱脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行了驗(yàn)證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種與植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫相關(guān)的miRNA——ghr-miR01，本發(fā)明同時(shí)提供此miRNA的前體序列及其前體的編碼基因序列，利用此miRNA能夠分析和調(diào)節(jié)棉花的抗旱性，對(duì)棉花應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的試驗(yàn)研究進(jìn)而培育優(yōu)良的棉花品種具有實(shí)際應(yīng)用意義。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。

一種與植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫相關(guān)的miRNA，其具有序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

上述miRNA的前體序列，其具有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

上述miRNA前體序列的編碼基因，其具有序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

上述miRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列，其具有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

上述所述miRNA的cDNA Gene Specific RT Primer的引物序列，其具有序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

上述miRNA在實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作中的引物序列，ghr-miR01F具有序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，ghr-miR01R具有序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列； U6-F具有序列表中SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；U6-R具有序列表中SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

上述的miRNA在植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫試驗(yàn)分析中的應(yīng)用，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定所述miRNA在植物中的表達(dá)模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中表達(dá)未明顯上調(diào)（比如上調(diào)不足2倍），提示目的植物未受到干旱脅迫，則返回修改試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

上述的miRNA在植物應(yīng)對(duì)非干旱脅迫試驗(yàn)分析中的應(yīng)用，在植物應(yīng)對(duì)非干旱脅迫試驗(yàn)的分析中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定所述miRNA在植物中的表達(dá)模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中的表達(dá)未明顯上調(diào)（比如上調(diào)不足2倍），則排除目的植物受到干旱脅迫的影響，從而排除干旱脅迫對(duì)非干旱脅迫試驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響。

上述的miRNA在培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，在目的植物中過(guò)表達(dá)SEQ ID NO：1所示的miRNA，或采用其反義寡核苷酸抑制SEQ ID NO：1所示miRNA的表達(dá)，或過(guò)表達(dá)SEQ ID NO：4所示miRNA前體的基因序列,培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因目的植物。

上述miRNA的應(yīng)用優(yōu)選實(shí)施在棉花作物品種上。

采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：

本發(fā)明提供了一種新的棉花miRNA，Solexa測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明miRNA的表達(dá)受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)，說(shuō)明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機(jī)制中起重要作用。

基于此，可以在植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的試驗(yàn)分析中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定miRNA在植物中的表達(dá)模式來(lái)確認(rèn)目的植物是否受到干旱脅迫，避免實(shí)驗(yàn)操作失誤導(dǎo)致的試驗(yàn)結(jié)果偏差。

在植物應(yīng)對(duì)非干旱脅迫的應(yīng)激試驗(yàn)研究中，還可以利用本發(fā)明的miRNA檢測(cè)目的植物是否受干旱脅迫的影響。在植物應(yīng)對(duì)非干旱脅迫試驗(yàn)的分析中，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定所述miRNA在植物中的表達(dá)模式，如果與非脅迫植物相比所述miRNA在目的植物中的表達(dá)未明顯上調(diào)，則排除目的植物受到干旱脅迫的影響，從而排除干旱脅迫對(duì)非干旱脅迫試驗(yàn)數(shù)據(jù)的影響。

另外，本發(fā)明的研究強(qiáng)烈的提示上述miRNA還可應(yīng)用于培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物，即在目的植物中過(guò)表達(dá)SEQ ID NO：1所示的miRNA，或采用其反義寡核苷酸抑制SEQ ID NO：1所示miRNA的表達(dá)，或過(guò)表達(dá)SEQ ID NO：4所示miRNA前體的基因序列,培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因目的植物。

附圖說(shuō)明

圖1為ghr-miR01在Solexa測(cè)序中非干旱脅迫和干旱脅迫條件下表達(dá)次數(shù)的比較，結(jié)果顯示，ghr-miR01在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)數(shù)為12，干旱處理后表達(dá)次數(shù)為339，表明ghr-miR01的表達(dá)受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)，說(shuō)明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機(jī)制中起重要作用。

圖2為ghr-miR01前體序列的莖環(huán)結(jié)構(gòu)圖，可見其前體序列折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。

圖3為實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)ghr-miR01在干旱脅迫條件下和正常條件下表達(dá)特征的分析結(jié)果，結(jié)果顯示ghr-miR01的表達(dá)受干旱誘導(dǎo)明顯上調(diào)，達(dá)19.1倍，說(shuō)明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機(jī)制中起重要作用。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項(xiàng)設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買直接獲得。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

本發(fā)明提供的miRNA來(lái)源于棉花（石早1號(hào)棉花）葉片，命名為ghr-miR01，其長(zhǎng)度為21nt；參看附圖2，其前體序列可折疊成一種穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬于miRNA前體典型的二級(jí)結(jié)構(gòu)，符合miRNA前體的結(jié)構(gòu)特征。

實(shí)施例1：Solexa測(cè)序分析驗(yàn)證ghr-miR01在棉花抗旱機(jī)制中的作用

一、材料培養(yǎng)及干旱處理：石早1號(hào)棉花種子播種于蛭石和營(yíng)養(yǎng)土3:1混合的基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，溫度為28 ℃，相對(duì)濕度為70%。對(duì)照材料分別于播種后第7、14、21、28天澆水，每次澆水150 mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80 ℃儲(chǔ)藏；干旱處理材料分別于播種后第7、14、21澆水，每次澆水150 mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80 ℃儲(chǔ)藏。

二、Solexa測(cè)序分析及新miRNA的鑒定：上步所得樣品送往上海美吉生物公司，進(jìn)行solexa測(cè)序及分析。參看圖1，結(jié)果顯示，ghr-miR01在正常生長(zhǎng)條件下表達(dá)數(shù)為12，干旱處理后表達(dá)次數(shù)為339，這表明ghr-miR01的表達(dá)受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)，說(shuō)明其在棉花適應(yīng)干旱脅迫機(jī)制中起重要作用，在棉花中過(guò)表達(dá)ghr-miR01，或采用其反義寡核苷酸抑制ghr-miR01的表達(dá)，將影響棉花對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力，培育出具有高抗旱性的轉(zhuǎn)基因棉花，對(duì)提高棉花的產(chǎn)量具有重大的意義。用Mfold在線軟件對(duì)其前體序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示符合miRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)特征（圖2）：要有較低的折疊自由能能量，RNA和其周圍序列應(yīng)該形成一個(gè)發(fā)夾式的二級(jí)結(jié)構(gòu)；小RNA序列在二級(jí)結(jié)構(gòu)的臂部即位于5′arm或3′臂上；在前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，miRNA最多只能有6 nt的錯(cuò)配；前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)上，miRNA與miRNA*之間沒(méi)有大的loop 或break。

實(shí)施例2：Real-time PCR分析驗(yàn)證ghr-miR01在棉花抗旱機(jī)制中的作用

一、材料培養(yǎng)及NaCl處理

石早1號(hào)棉花種子播種與蛭石和營(yíng)養(yǎng)土3:1混合的基質(zhì)的培養(yǎng)盆中，溫度為28 ℃，相對(duì)濕度為70%。對(duì)照材料分別于播種后第7、14、21、28天澆水，每次澆水150 mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80 ℃儲(chǔ)藏；干旱處理材料分別于播種后第7、14、21澆水，每次澆水150 mL，第35天取幼嫩葉片，液氮冷凍，-80℃儲(chǔ)藏。

二、RNA的分離

用GIANGEN公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（目錄號(hào)：DP441）提取總RNA，提取方法如下：

1、勻漿處理。50-100 mg葉樣用液氮在研缽內(nèi)快速磨碎，加入500 μL已加入β-巰基乙醇的SL液，立即渦旋劇烈震蕩；

2、12,000 rpm 離心2 min；

3、將上清液轉(zhuǎn)移至過(guò)濾柱CS上，12,000 rpm 離心2 min，小心吸取收集管中的上清至新的RNase-Free的離心管中，吸頭避免接觸收集管中的細(xì)胞碎片沉淀；

4、緩慢加入0.4倍上清體積的無(wú)水乙醇，混勻，將得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入吸附柱CR3中，12,000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

5、向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

6、DNase I 工作液的配制：取10 μl DNase I 儲(chǔ)存液放入新的RNase-Free離心管中，加入70 μl RDD溶液，輕柔混勻；

7、 向吸附柱CR3中央加入80 μl的DNase I 工作液，室溫放置15 min；

8、向吸附柱CR3中加入350 μl 去蛋白液RW1，12,000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

9、向吸附柱CR3中加入500 μl漂洗液RW（使用前先加入乙醇），12,000 rpm離心15 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；

10、 重復(fù)步驟9；

11、12,000 rpm離心2 min，將吸附柱CR3放入一個(gè)新的RNase-Free離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加30-50 μl RNase-Free ddH₂O，室溫放置2 min，12,000 rpm離心1 min，得到RNA溶液。

三、反轉(zhuǎn)錄為cDNA

用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒，將提取的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1、去除基因組DNA。在冰上配置10.0 μl反應(yīng)體系混合液：5×gDNA Eraser Buffer, 2.0 μl; gDNA Eraser, 1.0 μl; Total RNA, 2.0 μl; RNase Free dH₂O, 5.0 μl。輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落，42 ℃反應(yīng)2 min，4 ℃存放用于下步實(shí)驗(yàn)。

2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在冰上配置內(nèi)參基因U6所用混合液：步驟1的反應(yīng)液，10.0 μl;PrimeScript RT Enzyme Mix 1, 1.0 μl; RT Primer Mix, 4.0 μl; 5×PrimeScript Buffer 2，4.0 μl；RNase Free dH₂O, 1.0 μl；總體積，20 μl，輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落。在冰上配置miRNA所用混合液：步驟1的反應(yīng)液，10.0 μl;PrimeScript RT Enzyme Mix 1, 1.0 μl; Gene Specific RT Primer , 1.0 μl; 5×PrimeScript Buffer 2，4.0 μl；RNase Free dH₂O, 4.0 μl；總體積，20 μl，輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心使得管壁上的反應(yīng)液沉落。37 ℃,15 min; 85℃, 5 sec; 合成的cDNA反應(yīng)液放置-20 ℃保存，也可以直接進(jìn)行下游熒光定量檢測(cè)。

Gene Specific RT Primer 引物序列為：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTC GCACTGGATACGACCGTCGT（SEQ ID NO：5）。

四、實(shí)時(shí)熒光定量PCR

混勻如下反應(yīng)體系，然后分裝入96孔光學(xué)板中，并覆蓋上專用光學(xué)膜。擴(kuò)增使用的儀器為ABI公司的熒光定量PCR儀。

20 μl反應(yīng)體系配制如下：反轉(zhuǎn)錄cDNA模板，2 μl；正向引物（10 μM），1 μl；反向引物（10 μM），1 μl；2×RealStar Green Power Mixture，10 μl；RNase Free dH₂O，6 μl。

擴(kuò)增程序?yàn)椋簲U(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃， 30 sec；95 ℃， 15 s，60 ℃， 34 s，40 cycles；72 ℃ 30 s。

引物序列為：ghr-miR01F：GGACCGTGTTTCGCGCGTGG（SEQ ID NO：6）；ghr-miR01R: GTGCAGGGTCCGAGGT（SEQ ID NO：7）； U6-F：GGGGACATCCGATAAAATTGG（SEQ ID NO：8）；U6-R：CATTTCTCGATTTGTGCGTGTC（SEQ ID NO：9）；（U6為內(nèi)參基因）。

五、結(jié)果分析

參看圖3，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析的結(jié)果顯示ghr-miR01的表達(dá)受干旱誘導(dǎo)明顯上調(diào)，達(dá)19.1倍，這同樣表明ghr-miR01的表達(dá)受到干旱脅迫的調(diào)節(jié)?；诖?，可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定所述miRNA在植物中的表達(dá)模式，從而確認(rèn)或排除目的植物受到干旱脅迫，同時(shí)上述試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)烈的提示上述miRNA還可應(yīng)用于培育抗旱轉(zhuǎn)基因植物。

上述描述僅作為本發(fā)明可實(shí)施的技術(shù)方案提出，不作為對(duì)其技術(shù)方案本身的單一限制條件。

序 列 表

<110> 石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院

<120> 一種與植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫相關(guān)的miRNA——ghr-miR01及其應(yīng)用

<160> 9

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 棉花(Anemone vitifolia Buch)

<400> 1

GUGUUUCGCG CGUGGACGAC G 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

GTGTTTCGCG CGTGGACGAC G 21

<210> 3

<211> 73

<212> RNA

<213> 棉花(Anemone vitifolia Buch)

<400> 3

UUGUCCACGC GCGACACGCA CUGCAUUUGU GCUUUUUCAA AGCUUUGUAU GUGUGUUUCG 60

CGCGUGGACG ACG 73

<210> 4

<211> 73

<212> DNA

<213> 棉花(Anemone vitifolia Buch)

<400> 4

TTGTCCACGC GCGACACGCA CTGCATTTGT GCTTTTTCAA AGCTTTGTAT GTGTGTTTCG 60

CGCGTGGACG ACG 73

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

GTCGTATCCA GTGCAGGGTC CGAGGTATTC GCACTGGATA CGACCGTCGT 50

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

GGACCGTGTT TCGCGCGTGG 20

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

GTGCAGGGTC CGAGGT 16

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

GGGGACATCC GATAAAATTG G 21

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

CATTTCTCGA TTTGTGCGTG TC 22