本發(fā)明涉及一種甲基羥基化葫蘆烷型三萜及其制法和用途，具體指3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮及其制法和用途。
背景技術(shù)：
：金佛山雪膽(HemsleyapengxianensisW.J.Changvar.jinfushanensisL.D.Shen&W.J.Chang)為葫蘆科(Fabaceae)雪膽屬屬植物，產(chǎn)于我國東南部地區(qū)，生于海拔2000米左右的林緣及山谷灌叢中。金佛山雪膽的果實呈卵形、長4-5厘米，直徑2.5-3.5厘米，果皮表面有細小的疣狀突起而與原變種相區(qū)別，主要活性成分分別為葫蘆烷型四環(huán)三萜及其皂苷和齊墩果烷型五環(huán)三萜及其皂苷，具有清熱解毒，抗菌消炎等多種功效，臨床上主要用于治療菌痢、各種炎癥、潰瘍、黃疸等多種疾病。金佛山雪膽的藥效主要來源于其中的葫蘆烷型三萜類化合物，因此，開發(fā)和利用雪膽中的的葫蘆烷型單體化合物，進一步挖掘其潛在的藥用價值，并對其單體化合物的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行確定和表征，對于開發(fā)利用金佛山雪膽資源具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明就是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從金佛山雪膽根莖中分離得到的具有重要生物活性和產(chǎn)業(yè)化利用價值的甲基羥基化葫蘆烷型三萜化合物。該單體化合物為從金佛山雪膽中首次分離得到，利用現(xiàn)代分析手段表征其結(jié)構(gòu)并確認其生物活性后，根據(jù)有關(guān)化合物的命名規(guī)則命名為3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮，該化合物為一新化合物。一種從金佛山雪膽根莖中分離得到的3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮，具有如下式所示結(jié)構(gòu)：上述從金佛山雪膽根莖子中分離得到的3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮按下述方法得到：金佛山雪膽根莖干燥后粉碎過篩，加95%乙醇加熱回流提取3次，每次1-3小時，合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮后得總浸膏，總浸膏用水分散后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液濃縮至干；取乙酸乙酯部位浸膏用硅膠柱色譜分離，氯仿-甲醇(1:0-0:1)梯度洗脫，得到12個餾分FrA-L，F(xiàn)r.G部分經(jīng)凝膠色譜洗脫后再用氯仿-甲醇作為洗脫液洗脫除去色素，然后樣品經(jīng)反相中壓色譜柱經(jīng)MeOH-H2O(60:40;70:30;80:20;90:10)梯度洗脫，得到四個部份Fr.G1-4，其中Fr.G2經(jīng)高效液相色譜純化分離，采用甲醇-水洗脫，收集26.8分鐘的洗脫液結(jié)晶即得。所述加熱回流提取中金佛山雪膽根莖與乙醇的質(zhì)量體積比為1:8-1:12。所述氯仿-甲醇洗脫液中氯仿與甲醇的體積比為45:55-60:40。所述甲醇-水洗脫液中甲醇與水的體積比為68:32。3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮為無色粉末，易溶于氯仿，甲醇，將3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮進行體外抗腫瘤藥效學實驗，體外抗腫瘤藥效學實驗利用MTT比色法。以3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮為實驗組，以Doxorubicin（多柔比星，抗腫瘤藥物）為對照組，同時設(shè)立空白組，實驗組、對照組和空白組選取HeLa（人宮頸癌）細胞和KB（人口腔表皮樣癌）為實驗對象，培養(yǎng)基稀釋后，以6×104/ml的密度接種于96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)24小時后，各組加入相對應(yīng)的藥物，使各組藥物的最終濃度分別為2.5μg/ml(1組)，5μg/ml(2組)，10μg/ml(3組)，20μg/ml(四組)，40μg/ml(5組)，共設(shè)5個濃度，每個濃度3個復(fù)孔；培養(yǎng)48小時后，于每孔加MTT10μl染色；繼續(xù)培養(yǎng)四小時后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO100μl，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，并于酶聯(lián)免疫檢測儀570nm波長處檢測光密度值，根據(jù)光密度值計算50%抑制濃度（IC50，μg/mL)，光密度值計算IC50的計算方法為現(xiàn)有公知技術(shù)。實驗組、對照組對HeLa細胞和KB細胞的IC50如表1所示。表1組別HeLa細胞KB細胞實驗組18.4±3.137.6±1.5對照組1.3±0.110.89±0.03通過上表的數(shù)據(jù)可以看出，本發(fā)明所述的3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮對HeLa細胞和KB細胞均具有一定的抑制作用，能夠作為制備防治腫瘤藥物的原料，具備較強的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用價值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：首次從金佛山雪膽根莖中分離得到了具有重要抗腫瘤活性的3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮，并利用現(xiàn)代分析手段確定了其化學結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)。經(jīng)功能性試驗證明：3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮對腫瘤細胞具有較強的抑制作用，能夠作為制備防治腫瘤藥物的原料，具有較強的應(yīng)用價值和市場前景。附圖說明圖1是3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮的分子結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮的核磁共振氫譜（1H-NMR）。圖3是3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮的核磁共振碳譜（13C-APT）。具體實施方式下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。第一步：金佛山雪膽根莖(5.0kg)干燥后粉碎過80目篩。第二步：藥材粉末加10倍量乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮后得總浸膏1033g。第三步：金佛山雪膽根莖總浸膏加適量水進行分散處理后，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取至無色，將萃取液減壓濃縮至干，稱量得石油醚部位總浸膏56g、氯仿部位總浸膏302g、乙酸乙酯部位總浸膏151g、正丁醇部位總浸膏409g。第四步：取乙酸乙酯層浸膏151g經(jīng)硅膠柱色譜(100～200目)分離，氯仿-甲醇(1:0-0:1)梯度洗脫，得到12個餾分FrA-L。第五步：Fr.G部分經(jīng)凝膠色譜洗脫，氯仿-甲醇（45:55）作為洗脫液洗脫除去色素，然后樣品經(jīng)反相中壓色譜柱經(jīng)MeOH-H2O(60:40;70:30;80:20;90:10)梯度洗脫，得到四個部份Fr.G1-4.第六步：其中Fr.G2經(jīng)高效液相色譜純化分離，采用甲醇-水(68:32)洗脫，收集26.8分鐘的洗脫液結(jié)晶即得到無色粉末，易溶于氯仿、甲醇。上述無色粉末的結(jié)構(gòu)表征和確認如下：將上述所得無色粉末進行核磁共振氫譜（1H-NMR）和核磁共振碳譜（13C-APT）分析，1H-NMR譜圖如圖2所示，13C-APT譜圖如圖3所示。對圖2和圖3進行圖譜解析，將圖2和圖3各峰進行歸屬，圖2和圖3的峰歸屬如表2所示，通過圖2、圖3以及表1的數(shù)據(jù)可知，無色粉末的化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示，根據(jù)有關(guān)化合物的命名規(guī)則命名為3β,26,27-三羥基-3β-甲氧基葫蘆烷萜-5,24(E)-雙烯-11-酮。英文名為3β,26,27-trihydroxy-3β-methoxycucurbita-5,24(E)-diene-11-one。表2化合物1的1H-NMR和13C-NMR(150MHz,C5D5N)譜數(shù)據(jù)上述只是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍的情況下，都可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容對本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動和修飾，或修改為等同變化的等效實施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均應(yīng)落在本發(fā)明技術(shù)方案保護的范圍內(nèi)。當前第1頁1 2 3