本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無(wú)苦味的蝦類低分子肽及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖和加工的大國(guó)，近幾年僅蝦類的年產(chǎn)量都超過(guò)100萬(wàn)噸。其中，蝦類加工產(chǎn)生大量的下腳料，以及捕撈獲得大量難以加工的小蝦，約占蝦類總量的40％以上，通常只能被用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料或生產(chǎn)蝦醬食品等。蝦類加工下腳料和低值小蝦富含蛋白質(zhì)，近期成為人們開(kāi)發(fā)氨基酸、活性肽、調(diào)味基料等產(chǎn)品的重要資源。低分子肽具有易被吸收和呈味等特性，其不同風(fēng)味取決于肽鏈長(zhǎng)短、氨基酸組成及排列等，是食品工業(yè)領(lǐng)域中開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的熱點(diǎn)。但是，肽鏈經(jīng)酶解作用后，過(guò)多的疏水氨基酸暴露于肽端，易導(dǎo)致產(chǎn)物呈現(xiàn)苦味，嚴(yán)重的苦味會(huì)影響低分子肽在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

低分子肽苦味去除的方法目前主要有吸附法、掩蓋法、微膠囊化法、酶解法和微生物法等，其中酶解法和微生物法是具有巨大潛力的脫苦方法，是苦味去除研究的熱點(diǎn)。酶解脫苦法主要直接利用氨肽酶對(duì)肽端的疏水氨基酸進(jìn)行切除，微生物脫苦法則通過(guò)微生物分泌氨肽酶，進(jìn)而切除肽端的疏水氨基酸而達(dá)到脫苦目的。氨肽酶高產(chǎn)菌種報(bào)道極少，國(guó)內(nèi)氨肽酶制劑生產(chǎn)尚是空白，目前僅有諾維信公司生產(chǎn)的風(fēng)味蛋白酶制劑可以應(yīng)用于低分子肽的脫苦。但是，風(fēng)味蛋白酶制劑是內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的混合制劑，利用它進(jìn)行酶解脫苦時(shí)，低分子肽酶解程度不易控制，易造成產(chǎn)物分子過(guò)小和特定產(chǎn)物得率過(guò)低。另外，氨肽酶提取與純化的成本約占酶制劑生產(chǎn)成本的70％左右，如果直接利用氨肽酶制劑進(jìn)行脫苦，還有生產(chǎn)成本過(guò)高的缺點(diǎn)。因此，選育氨肽酶高產(chǎn)菌種，直接利用微生物發(fā)酵法對(duì)低分子肽進(jìn)行脫苦，將具有產(chǎn)物得率高、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，是未來(lái)最具有應(yīng)用潛力的脫苦方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種枯草芽孢桿菌。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種無(wú)苦味的蝦類低分子肽的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到無(wú)苦味的蝦類低分子肽。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述無(wú)苦味的蝦類低分子肽的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌，菌種命名為Bacillus subtilis YBPE-4，是從豆豉中分離獲得的。

所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4的保藏信息：保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年6月30日，保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC NO:M 2016359。

一種無(wú)苦味的蝦類低分子肽的制備方法，包含如下步驟：

(1)蝦類酶解：將經(jīng)干燥處理的蝦粉碎過(guò)篩，得到粉體；粉體與水混合，然后加入中性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解后加熱對(duì)酶進(jìn)行滅活，得到酶解液；

(2)種子液的準(zhǔn)備：取部分步驟(1)制得的酶解液，加入15～25g/L可溶性淀粉和1.5～2.5g/L磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH6.5～7.5，滅菌冷卻后接入氨肽酶產(chǎn)生菌菌種，然后33～37℃、160～200rpm下培養(yǎng)24～28h，得到種子液；

(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦：取剩余步驟(1)制得的酶解液，加入30～40g/L可溶性淀粉和1.5～2.0g/L磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH6.5～7.5，裝入通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入步驟(2)制得的種子液，于33～37℃下進(jìn)行發(fā)酵，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200～250rpm，根據(jù)菌體需氧量控制通氣比為0.2～1.6vvm(相對(duì)于發(fā)酵液的初始體積)，至132～144h結(jié)束發(fā)酵；

(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥：將步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液進(jìn)行菌體滅活，然后離心去除發(fā)酵液中菌體和大顆粒物質(zhì)，收集上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜進(jìn)行超濾除去上清液中大分子物質(zhì)，得到透過(guò)液；再利用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過(guò)液進(jìn)行濃縮并去除小分子物質(zhì)，得到濃縮液；然后，將超濾濃縮液進(jìn)一步真空蒸發(fā)濃縮并干燥，得到無(wú)苦味的低分子肽。

為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，步驟(2)中所述的可溶性淀粉和磷酸二氫鉀均為食品級(jí)原料；

步驟(1)中所述的蝦優(yōu)選為小蝦，小蝦屬于低值蝦，才注重綜合利用；如果是大蝦，主要直接用于食用或簡(jiǎn)單加工后食用。

步驟(1)中所述的過(guò)篩優(yōu)選為過(guò)80～120目篩；

步驟(1)中所述的水與粉體的質(zhì)量比(液固比)優(yōu)選為(15～20):1；

步驟(1)中所述的中性蛋白酶的用量為每克蛋白質(zhì)(粉體所含蛋白)加入4000～5000U的中性蛋白酶；

步驟(1)中所述的酶解的條件優(yōu)選為45～55℃酶解4～6h；

步驟(1)中所述的滅活的條件優(yōu)選為加熱至80℃～90℃，恒溫10～15min；

步驟(2)中所述的酶解液的用量為步驟(1)制得的酶解液總質(zhì)量的5％～10％；

步驟(2)中所述的氨肽酶產(chǎn)生菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌YBPE-4，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2016359；

步驟(2)中所述的種子液中的菌體濃度優(yōu)選為(1.0～2.5)×10¹⁰個(gè)/mL；

步驟(2)和步驟(3)中所述的滅菌的條件優(yōu)選為121℃滅菌20min；

步驟(3)中所述的發(fā)酵液發(fā)酵至72h，亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3400～4000U/mL；

步驟(4)中所述的滅活的條件優(yōu)選為121～125℃，保溫15～25min，對(duì)菌體進(jìn)行加熱滅活；加熱滅活后優(yōu)選冷卻至70～75℃后再離心；

步驟(4)中所述的離心的條件優(yōu)選為5000～6000rpm離心15～25min；

步驟(4)中所述的收集上清液的方式優(yōu)選為：發(fā)酵液離心分離后，優(yōu)選用相當(dāng)于20％～30％發(fā)酵液體積的去離子水洗滌離心沉淀物，然后離心分離洗滌液，收集合并兩次離心所得的上清液；

步驟(4)所述的利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾，當(dāng)濃縮液體積達(dá)到上清液體積的10％～12％時(shí)，向濃縮液加入2～3倍體積的去離子水，再進(jìn)行第二次超濾，使最終的濃縮液體積為發(fā)酵液體積的10％～12％，收集與合并兩次超濾的透過(guò)液；

步驟(4)中所述的濃縮液的體積優(yōu)選為透過(guò)液的10％～12％；

步驟(4)中所述的濃縮的方式優(yōu)選為：利用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過(guò)液進(jìn)行濃縮，當(dāng)濃縮液體積達(dá)到透過(guò)液體積的10％～12％時(shí)，向濃縮液加入2～3倍體積的去離子水，再進(jìn)行第二次超濾，使最終的濃縮液體積為透過(guò)液體積的10％～12％，收集最終的濃縮液；

步驟(4)中所述的超濾濃縮液真空蒸發(fā)濃縮后，去除55％～65％水分；

步驟(4)中所述的干燥優(yōu)選噴霧干燥；

一種無(wú)苦味的蝦類低分子肽，通過(guò)上述制備方法制備得到；

所述的無(wú)苦味的蝦類低分子肽的分子量為360～5000Da，相對(duì)于原料中蛋白質(zhì)的得率為51％～54％；

所述的無(wú)苦味的蝦類低分子肽在食品生產(chǎn)或食品添加劑生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明原理：中性蛋白酶是內(nèi)切型蛋白酶，用于蝦蛋白的水解，可從任意位置切斷肽鏈，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為不同分子量的低分子肽；枯草芽孢桿菌CCTCC NO:M 2016359是高產(chǎn)氨肽酶的菌種，在含有上述低分子肽的培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝，可大量分泌氨肽酶，從肽鏈N端切除疏水氨基酸，使低分子肽的苦味減弱或消除；微生物發(fā)酵脫苦后，經(jīng)離心分離、超濾膜分離與濃縮，再經(jīng)干燥，最后可獲得無(wú)苦味的低分子肽。本發(fā)明的核心是氨肽酶高產(chǎn)菌種的發(fā)酵技術(shù)，通過(guò)微生物發(fā)酵脫苦作用，消除低分子肽的苦味，解決低分子肽苦味限制其應(yīng)用的問(wèn)題。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明利用氨肽酶高產(chǎn)菌種對(duì)低分子肽進(jìn)行發(fā)酵脫苦，與風(fēng)味蛋白酶脫苦法相比，不但具有苦味去除效果好、產(chǎn)物得率高等優(yōu)點(diǎn)，而且可節(jié)約酶制劑分離純化成本，有利于降低綜合生產(chǎn)成本。

(2)本發(fā)明在脫苦前，無(wú)需對(duì)酶解分離液進(jìn)行分離、干燥等處理，直接利用蝦干粉酶解液配制成氨肽酶高產(chǎn)菌種的培養(yǎng)基，可節(jié)省中間產(chǎn)物干燥而產(chǎn)生的能耗費(fèi)用，也有利于降低生產(chǎn)成本。

(3)本發(fā)明選擇低值蝦為原料，綜合利用酶解技術(shù)、微生物發(fā)酵技術(shù)和超濾膜分離技術(shù)等制取無(wú)苦味的低分子肽，既為低值蝦的綜合利用提供一個(gè)有效途徑，也為其它低值水產(chǎn)品的綜合利用提供有價(jià)值的參考，有利于促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及加工業(yè)的發(fā)展。

(4)本發(fā)明將蝦類經(jīng)干燥、粉碎、中性蛋白酶酶解，分離得到酶解液。利用酶解液、可溶性淀粉和磷酸二氫鉀配制成發(fā)酵培養(yǎng)基，接入成熟的枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)培養(yǎng)液，進(jìn)行攪拌通氣發(fā)酵132～144h；發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體，獲得上清液，經(jīng)超濾膜過(guò)濾，獲得分子量為360～5000Da的濾液；濾液經(jīng)干燥，最后獲得無(wú)苦味的蝦類低分子肽產(chǎn)品。本發(fā)明具有蝦類低分子肽苦味去除效果好、產(chǎn)物得率高等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)成本較低，適宜于低值蝦產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)無(wú)苦味低分子肽，應(yīng)用前景良好。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明蝦類多肽的微生物脫苦流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

中性蛋白酶購(gòu)自北京奧博星生物科技有限公司，酶活力6.0×10⁴U/g；

實(shí)施例中涉及到的滅菌的條件為121℃滅菌20min；

亮氨酸氨肽酶活力定義：在40℃、pH8.0的條件下，每分鐘催化L-亮氨酸-4-硝基苯胺生成1μg對(duì)硝基苯胺所需的酶量為1個(gè)酶活力單位；

實(shí)施例1

(1)氨肽酶高產(chǎn)菌種的分離與篩選

富集培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。

平板分離培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，酪蛋白15g/L，KH₂PO₄ 1g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，NaCl 5g/L，瓊脂20g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉40g/L，蛋白胨20g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，pH7.0，121℃滅菌20min，冷卻后備用。

豆豉為市售材料，將10g豆豉接入200mL的富集培養(yǎng)基中，置于30℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于平板分離培養(yǎng)基，置于30℃下培養(yǎng)36～48h，挑取菌落周圍有明顯透明圈的菌株56株，接入斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)出菌苔后，置于4℃冰箱保藏。

將各菌株的斜面菌種分別接入裝有200mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶，每瓶接入2環(huán)菌苔，置于37℃、200rpm的條件下振蕩培養(yǎng)72h。培養(yǎng)液在6000rpm條件下離心20min，取上清液，測(cè)定氨肽酶活力。氨肽酶活力測(cè)定方法參照文獻(xiàn)(吳慶勛,谷海先,趙光鰲.N⁺注入誘變選育氨肽酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件初步優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2006,32(1):15-18)。經(jīng)測(cè)定，菌株YBPE-4(即枯草芽孢桿菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359)的產(chǎn)酶最高，其發(fā)酵液的氨肽酶活力達(dá)3882U/mL，故優(yōu)選為本發(fā)明的發(fā)酵菌種。

(2)菌種的鑒定

利用16S rDNA進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，首先提取菌株YBPE-4(即枯草芽孢桿菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359)的16S rDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、純化，送至測(cè)序公司進(jìn)行序列檢測(cè)，然后在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中檢索同源性。

經(jīng)序列檢測(cè)，該菌種的1492R/27F PCR產(chǎn)物的DNA片段總長(zhǎng)為1439bp，即枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4菌株的16S rDNA序列，具體如下：

TCCTATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTGTAGGAGCCAGCCGCCGAAGTGACATG。

經(jīng)同源性檢索，發(fā)現(xiàn)該菌種與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的同源性達(dá)99％，故該菌種被鑒定為枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4。

(3)菌種的保藏

將該菌種送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，上述鑒定結(jié)果獲得中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的確認(rèn)，并獲得保藏編號(hào)，即為枯草芽孢桿菌YBPE-4CCTCC NO:M 2016359。

所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)YBPE-4的保藏信息：保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年6月30日，保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)：CCTCC NO:M 2016359。

實(shí)施例2

(1)蝦類酶解

將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過(guò)100目篩，得到粉體；稱取1200g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入18L水，混勻；然后加入56.2g中性蛋白酶，55℃酶解4h，然后加熱至85℃恒溫12min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；

(2)種子液的準(zhǔn)備

取900mL酶解液，加入18g可溶性淀粉和1.8g磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH7.0，平均分裝入5個(gè)1000mL三角瓶，滅菌冷卻后，接入枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌種，每瓶接入2環(huán)菌苔，于37℃、160rpm下培養(yǎng)24h，得到菌體濃度為1.08×10¹⁰個(gè)/mL的種子液；

(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦

取剩余的酶解液17.1L，加入684g可溶性淀粉和29.93g磷酸二氫鉀，混勻，調(diào)節(jié)pH7.0，裝入30L的通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入900mL步驟(2)制得的種子液，啟動(dòng)攪拌和通入無(wú)菌空氣進(jìn)行發(fā)酵：在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵溫度控制為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速控制為220rpm；發(fā)酵0～60h，隨著菌體量增大，通氣量由3.6L/min逐步增大至28.8L/min；發(fā)酵61～72h，通氣量控制為28.8L/min；發(fā)酵73～108h，通氣量控制為21.6L/min；發(fā)酵109～120h，通氣量控制為18L/min；發(fā)酵121～144h，通氣量控制為14.4L/min；發(fā)酵至144h，結(jié)束發(fā)酵；其中，發(fā)酵至72h，發(fā)酵液的亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3426U/mL；

(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥

用蒸汽加熱步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液至123℃，保溫20min，冷卻至70℃，5500rpm離心20min，用5.4L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到18.6L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)發(fā)酵液濃縮至2.23L時(shí)，加入6.69L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.23L，收集與合并兩次超濾的透過(guò)液，得透過(guò)液23L；然后用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過(guò)液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.76L時(shí)，加入8.28L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.76L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至1.24L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到365g粉體產(chǎn)品，即為無(wú)苦味的低分子肽。經(jīng)檢測(cè)與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為94.8％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為51.3％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定，所得產(chǎn)品沒(méi)有苦味。

實(shí)施例3

(1)蝦類酶解

將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過(guò)80目篩，得到粉體；稱取900g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入18L水，混勻；然后加入33.72g中性蛋白酶，50℃酶解5h，然后加熱至80℃，恒溫15min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；

(2)種子液的準(zhǔn)備

取1800mL酶解液，加入27g可溶性淀粉和2.7g磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH6.5，平均分裝入10個(gè)1000mL三角瓶，滅菌冷卻后，接入枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌種，每瓶接入2環(huán)菌苔，于33℃、200rpm下培養(yǎng)28h，得到菌體濃度為2.49×10¹⁰個(gè)/mL的種子液；

(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦：

取剩余的酶解液16.2L，加入567g可溶性淀粉和32.4g磷酸二氫鉀，混勻，調(diào)節(jié)pH6.5，裝入30L的通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入1800mL步驟(2)制得的種子液，啟動(dòng)攪拌和通入無(wú)菌空氣進(jìn)行發(fā)酵：在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵溫度控制為33℃，攪拌轉(zhuǎn)速控制為250rpm；發(fā)酵0～54h，隨著菌體量增大，通氣量由3.6L/min逐步增大至28.8L/min；發(fā)酵55～64h，通氣量控制為28.8L/min；發(fā)酵65～72h，通氣量控制為25.2L/min；發(fā)酵73～84h，通氣量控制為21.6L/min；發(fā)酵85～102h，通氣量控制為18L/min；發(fā)酵103～132h，通氣量控制為14.4L/min；發(fā)酵至132h，結(jié)束發(fā)酵；其中，發(fā)酵至72h，發(fā)酵液的亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3992U/mL；

(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥

用蒸汽加熱步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液至121℃，保溫25min，冷卻至72℃，5000rpm離心25min，用3.6L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到18.4L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)上清液濃縮至1.84L時(shí)，加入3.68L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至1.84L，收集與合并兩次超濾的透過(guò)液，得透過(guò)液20.2L；然后用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過(guò)液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.02L時(shí)，加入4.04L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.02L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至0.707L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到285g粉體產(chǎn)品，即為無(wú)苦味的低分子肽。經(jīng)檢測(cè)與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為95.3％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為53.7％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定，所得產(chǎn)品沒(méi)有苦味。

實(shí)施例4

(1)蝦類酶解

將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過(guò)120目篩，得到粉體；稱取1100g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入19.25L水，混勻，加入46.37g中性蛋白酶，于45℃酶解6h，然后加熱至90℃，恒溫10min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；

(2)種子液的準(zhǔn)備

取1540mL酶解液，加入38.5g可溶性淀粉和3.85g磷酸二氫鉀，調(diào)節(jié)pH7.5，平均分裝入8個(gè)1000mL三角瓶，121℃滅菌20min，冷卻后，接入枯草芽孢桿菌YBPE-4(CCTCC NO:M 2016359)的斜面菌種，每瓶接入2環(huán)菌苔，于35℃、180rpm下培養(yǎng)26h，得到菌體濃度為1.77×10¹⁰個(gè)/mL的種子液；

(3)低分子肽的發(fā)酵脫苦：

取剩余的酶解液17.71L，加入531g可溶性淀粉和26.57g磷酸二氫鉀，混勻，調(diào)節(jié)pH7.5，裝入30L的通氣攪拌發(fā)酵罐中，滅菌冷卻后，接入1540mL步驟(2)制得的種子液，啟動(dòng)攪拌和通入無(wú)菌空氣進(jìn)行發(fā)酵。在發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵溫度控制為35℃，攪拌轉(zhuǎn)速控制為200rpm；發(fā)酵0～60h，隨著菌體量增大，通氣量由3.85L/min逐步增大至30.8L/min；發(fā)酵61～72h，通氣量控制為30.8L/min；發(fā)酵73～84h，通氣量控制為23L/min；發(fā)酵85～108h，通氣量控制為19.25L/min；發(fā)酵109～140h，通氣量控制為15.4L/min；發(fā)酵至140h，結(jié)束發(fā)酵；其中，發(fā)酵至72h，發(fā)酵液的亮氨酸氨肽酶活力達(dá)到3764U/mL；

(4)脫苦后低分子肽的分離與干燥

用蒸汽加熱步驟(3)發(fā)酵后的發(fā)酵液至125℃，保溫15min，冷卻至75℃，6000rpm離心15min，用4.8L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到20.2L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)上清液濃縮至2.22L時(shí)，加入5.55L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.22L，收集與合并兩次超濾的透過(guò)液，得透過(guò)液23.5L；然后用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過(guò)液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.59L時(shí)，加入6.48L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.59L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至1.04L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到348g粉體產(chǎn)品，即為無(wú)苦味的低分子肽。經(jīng)檢測(cè)與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為94.9％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為53.4％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定，所得產(chǎn)品沒(méi)有苦味。

對(duì)比實(shí)施例1

(1)蝦類酶解

將經(jīng)干燥處理的小蝦粉碎過(guò)100目篩，得到粉體；稱取900g粉體(蛋白質(zhì)含量為56.2％)，加入18L水，混勻，加入33.72g中性蛋白酶，于50℃酶解5h，然后加熱至80℃，恒溫10min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫，得到酶解液；

(2)風(fēng)味蛋白酶的酶解脫苦

在步驟(1)制得的酶解液中，加入40.5g風(fēng)味蛋白酶(諾維信公司，酶活力1.5×10⁴U/g)，于50℃酶解2h，然后加熱至80℃，恒溫15min，對(duì)酶進(jìn)行滅活，冷卻至室溫備用；

(3)脫苦后低分子肽的分離與干燥

將脫苦后的酶解液于5000rpm離心20min，用5.4L去離子水洗滌離心沉淀物，再進(jìn)行第二次離心，收集與合并兩次離心所得的上清液，得到21.5L上清液；利用截留分子量為5000Da的超濾膜對(duì)上清液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃縮液體積為2.15L時(shí)，加入6.45L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.15L，收集與合并兩次超濾的透過(guò)液，得透過(guò)液25.8L；然后，用截留分子量為360Da的超濾膜對(duì)透過(guò)液進(jìn)行超濾，當(dāng)濃液體積達(dá)到2.58L時(shí)，加入5.16L去離子水，混勻，進(jìn)行第二次超濾，再次將濃液濃縮至2.58L，收集濃縮液，即為分子量為360～5000Da的低分子肽溶液；在真空度-0.08MPa、溫度60℃的條件下進(jìn)行真空蒸發(fā)，將濃縮液進(jìn)一步濃縮至0.92L，再進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度為180℃，出風(fēng)溫度為75℃，最后得到218g粉體產(chǎn)品。經(jīng)檢測(cè)與計(jì)算，粉體產(chǎn)品中低分子肽含量為94.3％，低分子肽相對(duì)于蛋白質(zhì)的得率為40.6％。以硫酸奎寧溶液為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物進(jìn)行苦味的感官評(píng)定(參考文獻(xiàn)：潘進(jìn)權(quán).毛霉AS3.2778脯氨酸氨肽酶的部分純化及性質(zhì)研究【J】.食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(4):26-31)，所得產(chǎn)品呈現(xiàn)微苦。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。