本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體是大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA4及其制備方法。

背景技術(shù)：

抗氧化劑是阻止氧氣不良影響的物質(zhì)，它是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的抗氧化劑，這些抗氧化劑可以被分為以下兩大類：1)非基因編碼的小分子無助，如維生素E、維生素C、谷胱甘肽等；2)基因編碼的大分子物質(zhì)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、硫氧還蛋白等。這些抗氧化劑已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種領(lǐng)域，包括健康、食品、化妝品及各種工業(yè)中，比如作為燃料和潤滑劑的穩(wěn)定劑防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合從而避免引擎積垢形成的目的，單在2007年，工業(yè)用途的抗氧化劑的就創(chuàng)造了大約37億美元的收入?；诳寡趸瘎┑闹匾?，科學(xué)家們一直在孜孜不倦的尋找著新型抗氧化劑。

兩棲動物是水生動物過度到陸生動物之間的重要類群，其皮膚裸露，表面沒有毛發(fā)覆蓋，直接面對各種生存壓力，承當(dāng)著諸多重要的生物學(xué)功能，比如抵御微生物入侵、體色調(diào)節(jié)、水鹽平衡調(diào)節(jié)等。已經(jīng)有大量的研究證據(jù)表明，兩棲動物的皮膚能分泌大量的活性物質(zhì)(主要是蛋白和多肽)使得其能完成這些重要的生物學(xué)功能。最近，在一些兩棲動物(大綠臭蛙、滇蛙等)的皮膚中發(fā)現(xiàn)了一類新型的抗氧化劑，其化學(xué)本質(zhì)為多肽，和傳統(tǒng)的兩大類抗氧化劑不同，其由基因編碼，但分子量卻很小。和傳統(tǒng)的抗氧化劑相比，我們對這一類新型抗氧化劑的結(jié)構(gòu)和功能了解還知之甚少。

大綠臭蛙是中國特有的一種臭蛙，廣泛分布于強(qiáng)紫外照射的云貴高原，根據(jù)其生境，我們推測其皮膚能分泌高效的抗氧化劑使得其能抵御紫外照射所造成的傷害。發(fā)明人從中國產(chǎn)大綠臭蛙的皮膚中得到了1個新穎的抗氧化多肽AOP-OA4，其抗氧化活性很強(qiáng)，約為維生素E的1000倍。將本發(fā)明的大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA4全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供結(jié)構(gòu)簡單、抗氧化活性強(qiáng)的大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA4及其制備方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA4，所述抗氧化肽AOP-OA4的氨基酸序列中如序列表中SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明另一目的是提供大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA4的制備方法，從大綠臭蛙皮膚分泌物中分離純化得到，所分離得到的抗氧化多肽AOP-OA4具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述大綠臭蛙皮膚抗氧化多肽AOP-OA4的制備方法，具體包括以下步驟：

1)用電刺激法取大綠臭蛙皮膚分泌物，并將其溶解于生理鹽水，制得混合物，真空冷凍干燥，-80°保存?zhèn)溆茫?/p>

2)超濾：將混合物采用超濾管進(jìn)行超濾，截留分子量為10KDa；

3)高效液相色譜反相層析：將步驟2)所得物質(zhì)真空冷凍干燥后溶于去離子水，制得樣品，將樣品上樣于預(yù)先用含有三氟乙酸的超純水平衡好的Hypersil ODS2色譜柱中，在流速為1ml/min的條件下，用含三氟乙酸的乙腈在線性梯度條件下進(jìn)行洗脫即得，監(jiān)測波長為215nm，線性梯度條件：0-100％in 100min。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：超純水中三氟乙酸的質(zhì)量含量為0.1％。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：乙腈中三氟乙酸的質(zhì)量含量為0.1％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明得到的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4在自由基ABTS+清除實驗中顯示了較強(qiáng)的抗氧化活性，揭示本發(fā)明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4有潛在的應(yīng)用前景。大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4具有結(jié)構(gòu)簡單、抗氧化活性強(qiáng)的有益特點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4的HPLC反相C₁₈柱層析圖。

圖2為本發(fā)明分離純化大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4的自由基ABTS⁺清除活性圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4，其制備方法可以通過生物化學(xué)分離純化方法，由大綠臭蛙皮膚分泌物中得到。上述方法制備的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4，可通過質(zhì)譜及抗氧化活性進(jìn)行鑒定。

大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4的制備也可通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法，采用化學(xué)合成或基因表達(dá)的方式得到，它們的氨基酸序列與本發(fā)明SEQ ID NO:1相同。

實施例1

本發(fā)明實施例中，大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4分離純化和鑒定

1、分離純化

大綠臭蛙活體采自大綠保山，用電刺激法取其皮膚分泌物(溶解于生理鹽水)，真空冷凍干燥，-80°保存?zhèn)溆谩?/p>

第一步：超濾(用millipore超濾管，截留分子量為10KDa)。

第二步：高效液相色譜反相層析：

第一步所得樣品真空冷凍干燥后溶于去離子水后上樣于預(yù)先用超純水(含0.1％的三氟乙酸)平衡好的Hypersil ODS2 5mm柱子(伊利特產(chǎn)品，尺寸為4.6mm×300mm)，實驗儀器為Waters 1525高壓液相系統(tǒng)，在流速為1ml/min的條件下，用乙腈(含0.1％的三氟乙酸)在線性梯度(0-100％in 100min)條件下進(jìn)行洗脫，監(jiān)測波長為215nm。

AOP-OA4對應(yīng)HPLC反相C₁₈柱層析圖(圖1)中的3峰所示。

2、分子鑒定

氨基酸序列的測定：

純化得到的大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4在全自動蛋白質(zhì)序列測定儀(島津PPSQ-31A)上經(jīng)Edman降解法，測定了大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4氨基酸全序列，結(jié)果表明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4具有本發(fā)明SEQ ID NO:1所示的結(jié)構(gòu)：

GlyLeuPhe Pro Leu Ile LyrCys Ala AsnArg。

實施例2

大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4的抗氧化活性

本發(fā)明利用自由基ABTS+清除活性實驗檢測大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4的抗氧化活性，結(jié)果表明大綠臭蛙皮膚抗氧化肽AOP-OA4具有較強(qiáng)的抗氧化活性5mM的ABTS在水中和2.5mM的過硫酸鉀混合，室溫黑暗環(huán)境中反應(yīng)5.5個小時，使得ABTS被氧化成為ABTS⁺自由基，之后用去離子水稀釋48倍，取48μL稀釋液和48μL樣品混合，室溫黑暗環(huán)境下反應(yīng)30分鐘，之后，在415nm波長下測其吸光度。自由基ABTS⁺的清除率(％)用下述公式進(jìn)行計算：(A_blank-A_sample)×100/A_blank。不同濃度大綠臭蛙抗氧化肽AOP-OA4的抗氧化活性如圖2所示。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。