本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,特別是用于疫苗佐劑的一種細(xì)胞免疫佐劑TSA-41的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù):
疫苗類的生物制品通過刺激機(jī)體免疫系統(tǒng),產(chǎn)生免疫物質(zhì)(如抗體)才發(fā)揮其功效,在人體內(nèi)出現(xiàn)體液免疫、細(xì)胞免疫或細(xì)胞介導(dǎo)免疫。它是人類對事物認(rèn)識(shí)的深入和科技的進(jìn)步所帶來的產(chǎn)物,是人類抵御外界不利因素的威脅、提高健康質(zhì)量的一大利器。然而,單一疫苗的有效成分在進(jìn)行免疫提呈的過程中,往往受到各種生物途徑的影響,使得其無法實(shí)現(xiàn)預(yù)期的免疫效果,因此需要一些可增強(qiáng)機(jī)體對疫苗抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的佐劑作為輔助。
目前,臨床上已廣泛應(yīng)用的疫苗佐劑有氫氧化鋁等,這些佐劑對很多預(yù)防性疫苗的接種起到了很好的免疫增強(qiáng)效果。這些佐劑主要通過改變抗原的物理形狀,延長抗原在機(jī)體內(nèi)保留時(shí)間;刺激單核吞噬細(xì)胞對抗原的提呈能力;刺激淋巴細(xì)胞分化,增加擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力等機(jī)制來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。
隨著疫苗研究的不斷深入,傳統(tǒng)疫苗通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體而激發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的作用方式已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人類健康的需求。許多新型疫苗,如TAA(腫瘤相關(guān)抗原)疫苗等,以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)為手段,從而實(shí)現(xiàn)病變細(xì)胞在體內(nèi)得到生物清除的目的。這類疫苗對于一些腫瘤患者的生物治療有著極其重大的臨床意義。但是這類新型疫苗在臨床研究中往往面臨誘發(fā)特異性細(xì)胞免疫水平低下的困擾,造成臨床試驗(yàn)結(jié)果不理想。因此,迫切需要有一種佐劑來增強(qiáng)這些細(xì)胞免疫類疫苗的臨床效果。研究表明,氫氧化鋁無法對這類疫苗產(chǎn)生有效的佐劑功能,而實(shí)驗(yàn)室研究中被證明能有效提高細(xì)胞免疫水平的佐劑有非甲基化胞嘧啶-鳥嘌呤核苷酸基序的寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)等,但是CpG ODN作為一種核酸其安全性還存在很大的隱患,故而遲遲未能獲批上市。
因此,尋找一種安全、有效的佐劑來增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)對于細(xì)胞免疫類疫苗的研發(fā)有著巨大的推動(dòng)作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的是通過基因工程技術(shù)提供一種細(xì)胞免疫佐劑TSA-41的制備方法,并將該佐劑用于增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞免疫水平。
本發(fā)明為人工設(shè)計(jì)一種基因序列SEQ ID NO.1,通過基因工程技術(shù),將SEQ ID NO.1重組基因序列插入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),通過大腸桿菌高效表達(dá)出具有二聚體結(jié)構(gòu)的可溶性重組蛋白TSA-41,所得TSA-41重組蛋白通過分離、純化,最終得到高純度、高活性的重組蛋白。該重組蛋白作為佐劑可以有效提高細(xì)胞免疫類生物疫苗的免疫效果,避免了重組蛋白復(fù)性折疊的工藝步驟,大大提高了制備效率,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明細(xì)胞免疫佐劑TSA-41的制備方法,通過人工基因合成技術(shù)合成SEQ ID NO.1基因序列,以SEQ ID NO.1基因序列,該基因序列在重組大腸桿菌中能夠表達(dá)出具有二聚體結(jié)構(gòu)的可溶性重組蛋白,獲得的重組蛋白命名為TSA-41,以TSA-41重組蛋白作為佐劑的有效成分,SEQ ID NO.1基因序列為:
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCTGGCTTGTCCGTGGGCTGTATCTGGCGCACGTGCGTCTCCAGGCTCCGCAGCATCTCCGCGCCTGCGTGAAGGCCCGGAACTGTCCCCGGACGATCCGGCTGGTCTGCTGGATCTGCGTCAGGGCATGTTCGCACAACTGGTGGCACAGAACGTACTGCTGATTGATGGCCCGCTGTCTTGGTACTCCGATCCGGGTCTGGCAGGCGTGTCCCTGACCGGCGGTCTGAGCTATAAAGAGGATACTAAGGAACTGGTAGTTGCTAAAGCGGGCGTGTACTACGTGTTCTTCCAACTGGAGCTGCGTCGCGTTGTTGCAGGTGAGGGCAGCGGTTCTGTTAGCCTGGCGCTGCACCTGCAACCACTGCGCTCTGCGGCTGGTGCGGCAGCTCTGGCGCTGACCGTAGACCTGCCGCCAGCATCCAGCGAGGCGCGTAACTCCGCGTTCGGCTTCCAGGGCCGCCTGCTGCACCTGTCCGCAGGCCAGCGTCTGGGCGTACATCTGCATACCGAAGCGCGTGCACGTCACGCTTGGCAACTGACCCAGGGCGCTACCGTGCTGGGTCTGTTCCGTGTAACTCCAGAGATTCCGGCCGGTCTGCCGTCTCCGCGTTCCGAATAA。
本發(fā)明涉及細(xì)胞免疫佐劑TSA-41用SEQ ID NO.1基因序列經(jīng)過下列步驟得到TSA-41細(xì)胞免疫增強(qiáng)佐劑:
(1) 通過基因工程技術(shù)將SEQ ID NO.1基因序列插入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng),獲得表達(dá)SEQ ID NO.1基因的重組大腸桿菌;
(2) 將步驟(1)所得重組大腸桿菌進(jìn)行37℃培養(yǎng),15-25℃誘導(dǎo)其表達(dá)重組蛋白TSA-41,獲得誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌;
(3) 將步驟(2)所得誘導(dǎo)后的重組大腸桿菌進(jìn)行細(xì)胞破碎,通過離心獲得重組大腸桿菌破碎上清液;
(4) 將步驟(3)所得重組大腸桿菌破碎上清液通過鎳離子親和層析柱進(jìn)行分離純化,得到TSA-41重組蛋白初步純化液;
(5) 將步驟(4)所得TSA-41重組蛋白初步純化液通過凝膠排阻層析柱進(jìn)行分離純化,得到TSA-41重組蛋白純化液;
(6)將步驟 (5)所得TSA-41重組蛋白純化液置于透析袋中,用透析液進(jìn)行透析,獲得穩(wěn)定的TSA-41重組蛋白,該蛋白即為所需的TSA-41佐劑;所述透析液配方為:甘氨酸1-3克,氯化鈉5-20克,甘油20-100克,加水溶解定容至1升,調(diào)節(jié)pH值至7.0-9.0。
本發(fā)明涉及SEQ ID NO.1基因表達(dá)的TSA-41重組蛋白作為疫苗佐劑的有效成分,能有效刺激淋巴細(xì)胞的體外增殖。
本發(fā)明涉及SEQ ID NO.1基因表達(dá)的TSA-41重組蛋白作為疫苗佐劑的有效成分,能增強(qiáng)疫苗的細(xì)胞免疫效果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果:通過基因工程技術(shù)提供一種細(xì)胞免疫佐劑TSA-41的制備方法,SEQ ID NO.1基因序列通過大腸桿菌快速、高效表達(dá)具有細(xì)胞免疫佐劑活性的重組蛋白。該重組蛋白在大腸桿菌中以可溶的形式表達(dá),表達(dá)過程中直接形成二聚體結(jié)構(gòu),避免了重組蛋白復(fù)性折疊的工藝步驟,大大提高了制備效率,有利于工業(yè)化生產(chǎn)。通過本發(fā)明所制備的佐劑TSA-41可以顯著提高細(xì)胞免疫類生物疫苗的免疫效果。
附圖說明
圖1.為TSA-41重組蛋白的表達(dá)純化電泳圖譜
M:蛋白分子量Marker;
1:誘導(dǎo)表達(dá)前;
2:誘導(dǎo)表達(dá)后;
3:誘導(dǎo)后破菌液;
4:破菌液上清;
5:柱層析上樣;
6:柱層析流穿;
7:柱層析洗脫。
圖2.為TSA-41重組蛋白純化樣品聚體分析
M:蛋白分子量Marker;
1:樣品還原處理;
2:樣品非還原處理。
圖3. TSA-41佐劑對小鼠淋巴細(xì)胞體外增殖作用的結(jié)果
圖4.為酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫法檢測TSA-41佐劑對治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用(原始結(jié)果);
圖5.為酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫法檢測TSA-41佐劑對治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用(柱狀圖分析);
圖6.為小鼠腫瘤模型檢測TSA-41佐劑對治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明,而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制,在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi),對本發(fā)明作出的任何修改和改變,都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1 TSA-41佐劑的制備
(1)通過人工基因合成技術(shù)合成SEQ ID NO.1基因序列,并通過NdeⅠ和XbaⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)將SEQ ID NO.1基因插入pET28a大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒,得到表達(dá)SEQ ID NO.1基因序列的重組質(zhì)粒SEQ ID NO.1-pET28a。
(2)取裝有BL21(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞50微升的1.5毫升離心管置于冰上放置5分鐘,加入50納克SEQ ID NO.1-pET28a重組質(zhì)粒,輕輕混勻,并在冰上培養(yǎng)30分鐘;將離心管置于42℃水浴鍋中放置90秒,迅速取出置于冰上放置 5分鐘;向離心管中加入900微升LB液體培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)45分鐘,取培養(yǎng)產(chǎn)物200微升涂布于直徑10厘米的LB固體培養(yǎng)基平皿中,37℃培養(yǎng)過夜。最終得到表達(dá)SEQ ID NO.1基因序列的重組大腸桿菌單克隆菌落。
(3)挑取表達(dá)SEQ ID NO.1基因序列的重組大腸桿菌單克隆菌落,置于100毫升LB液體培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜進(jìn)行活化;按1:100的接種比例將活化
后的菌液接種于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中,37℃下培養(yǎng)菌體OD600至0.8,然后加IPTG濃度至1毫摩爾進(jìn)行誘導(dǎo),在25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)20小時(shí),誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后樣品取樣進(jìn)行電泳分析(見圖1所示)。
(4)用離心機(jī)離心收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌落,離心條件為:8000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。棄去上清,所得沉淀用破菌緩沖液以1:10的質(zhì)量體積比(g/v)重懸,并用超音儀超聲破菌,超聲后菌液用離心機(jī)14000 轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘收集上清。
(5)將破菌離心上清液用通用公司的5ml柱體積的鎳離子親和層析柱進(jìn)行層析純化,層析條件如下:先用50毫升破菌緩沖液平衡層析柱,然后取40毫升破菌離心上清液以4毫升/分鐘的流速上樣至層析柱中,再用50毫升破菌緩沖液平衡層析柱,最后用洗脫液洗脫得到TSA-41重組蛋白初步純化液(圖1所示)。
(6) 將所得TSA-41重組蛋白純化液同時(shí)進(jìn)行還原性和非還原性蛋白電泳,結(jié)果顯示(見圖2所示)所得TSA-41重組蛋白單體分子量為23千道爾頓(kD)左右,聚體分子量為46kD左右。
(7) 將所得TSA-41重組蛋白初步純化液用東曹公司的凝膠排阻層析柱進(jìn)行分離純化,去除未形成聚體的蛋白。
(8)將所得TSA-41重組蛋白純化液置于8000道爾頓透析袋中,用透析液進(jìn)行透析,獲得穩(wěn)定的TSA-41重組蛋白,該蛋白即為所需的TSA-41佐劑。
所用溶液如下:
LB液體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10克,酵母提取物5克,氯化鈉10克,加水溶解定容至1升。
LB固體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨10克,酵母提取物5克,氯化鈉10克,瓊脂粉15克,加水定容至1升。
破菌緩沖液:三羥甲基氨基甲烷2.4克,氯化鈉29.22克,咪唑3.4克,加水溶解定容至1升,調(diào)節(jié)pH值至8.5。
洗脫液:三羥甲基氨基甲烷2.4克,氯化鈉29.22克,咪唑34克,加水溶解定容至1升,調(diào)節(jié)pH值至8.5。
透析液:甘氨酸1.5克,氯化鈉9克,甘油50克,加水溶解定容至1升,調(diào)節(jié)pH值至8.0。
實(shí)施例2 TSA-41佐劑對小鼠淋巴細(xì)胞的體外增殖作用
(1)取C57/BL小鼠處死,在無菌條件下取脾臟輕輕碾壓,獲得脾臟細(xì)胞懸液。
(2)所得脾臟細(xì)胞懸液用紅細(xì)胞裂解液作用5分鐘,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心棄上清,再用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌兩次,最后將細(xì)胞沉淀重懸于一定量的血清RPMI-1640培養(yǎng)基中,獲得小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。
(3)將小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液稀釋至5×106個(gè)細(xì)胞/毫升,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100微升。
(4)將TSA-41佐劑用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成系列濃度4毫克/毫升、2毫克/毫升、1毫克/毫升、0.5毫克/毫升、0.25毫克/毫升、0.125毫克/毫升、0.063毫克/毫升、0.032毫克/毫升、0.016毫克/毫升,分別取各個(gè)濃度的佐劑1微升加至步驟(3)所述的含有淋巴細(xì)胞的孔板中,每個(gè)濃度的佐劑做三個(gè)細(xì)胞復(fù)孔,并且以佐劑透析緩沖液作為陰性對照。
(5)將用TSA-41佐劑刺激的淋巴細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
(6)在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入15微升CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑,細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時(shí),取出細(xì)胞培養(yǎng)板,在酶標(biāo)儀中用以630納米為參比波長讀取各孔的OD450(450納米波長下的吸光度值)。
(7)加入TSA-41佐劑的淋巴細(xì)胞其OD450要明顯高于未加佐劑的對照組(見圖3所示),說明加入TSA-41佐劑的淋巴細(xì)胞其生長水平要明顯高于未加佐劑的對照組。
實(shí)施例3 酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫法檢測TSA-41佐劑對治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用
(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每組設(shè)三只C57/BL小鼠,分為三個(gè)組: TSA-41佐劑組、治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗組以及治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗和TSA-41佐劑共同免疫組。其中,治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗接種量為100微克,TSA-41佐劑接種量為5微克,每只小鼠間隔兩天加強(qiáng)免疫,共接種三次。
(2)在初次免疫第10天處死小鼠,在無菌條件下取脾臟輕輕碾壓,獲得脾臟細(xì)胞懸液。
(3)所得脾臟細(xì)胞懸液用紅細(xì)胞裂解液作用5分鐘,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心棄上清,再用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌兩次,最后將細(xì)胞沉淀重懸于一定量的血清RPMI-1640培養(yǎng)基中,獲得小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液。
(4)將小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液稀釋至5×106個(gè)細(xì)胞/毫升,按照酶聯(lián)斑點(diǎn)免疫檢測說明書進(jìn)行操作。
(5)結(jié)果顯示:TSA-41佐劑自身不會(huì)引起小鼠產(chǎn)生特異性γ干擾素表達(dá)水平,但是TSA-41佐劑與治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗聯(lián)合免疫可以有效提高小鼠特異性γ干擾素的表達(dá)水平(見圖4、圖5所示)。
實(shí)施例4 小鼠腫瘤模型檢測TSA-41佐劑對治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗的免疫增強(qiáng)作用
(1)小鼠腫瘤模型的建立
將TC-1腫瘤模型細(xì)胞以1:4傳代,待細(xì)胞長至約90%融匯度時(shí),用37℃預(yù)熱的0.25% 胰酶消化20秒,含10%新生牛血清的1640培養(yǎng)基中和后,1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘,棄上清,重懸于無菌等滲磷酸鹽緩沖液,再次離心去上清并重懸于磷酸鹽緩沖液后,牛鮑氏計(jì)數(shù)板充池計(jì)數(shù)至目的濃度。所得細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液稀釋至2.5×105個(gè)/毫升,對實(shí)驗(yàn)小鼠C57/BL左腿內(nèi)側(cè)腹股溝處皮下接種腫瘤細(xì)胞100微升/只。
(2)分別用磷酸鹽緩沖液、TSA-41佐劑、治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗以及治療用人乳頭瘤病毒重組蛋白疫苗和TSA-41佐劑混合物分四個(gè)實(shí)驗(yàn)組接種已建立的小鼠腫瘤模型,間隔兩天加強(qiáng)免疫,共接種三次,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)10只腫瘤模型小鼠。
(3)定期對各個(gè)小鼠的程瘤情況進(jìn)行觀察并記錄。
(4)結(jié)果顯示:單獨(dú)的TSA-41佐劑不對小鼠腫瘤模型產(chǎn)生作用,TSA-41佐劑與疫苗聯(lián)合接種所得抗腫瘤效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)的疫苗接種(見圖6所示)。