本發(fā)明涉及菌株領(lǐng)域，具體涉及一種滴滴涕降解菌及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DDE(化學(xué)式：1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene，2,2-雙-(對(duì)氯苯基)-1,1-二氯乙烯)是有機(jī)氯農(nóng)藥滴滴涕的重要組分，是一種公認(rèn)的環(huán)境優(yōu)先控制污染物，也是典型的持久性污染物(POPs)，具有難以降解性、半揮發(fā)性、生物蓄積性和高毒性，對(duì)人類健康和環(huán)境的危害極大。我國已于1983年禁止了滴滴涕的生產(chǎn)和使用，但由于使用量大，在環(huán)境中降解緩慢、滯留時(shí)間長，使得此類農(nóng)藥仍然是在土壤、植物、水體、等環(huán)境介質(zhì)中檢出，并通過土壤和農(nóng)作物的積累作用，導(dǎo)致我國人均體內(nèi)滴滴涕的累積。據(jù)調(diào)查1988年呼和浩特市郊菜地土壤中滴滴涕濃度為5-852ng/g，平均192ng/g。2008年呼和浩特市城鄉(xiāng)結(jié)合部典型農(nóng)田土壤中滴滴涕殘留(主要為DDE)濃度仍然保持在632±285ng/g；植物蔬菜中殘留檢出率為87％，個(gè)別超標(biāo)嚴(yán)重，嚴(yán)重影響了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量。吉林省近期監(jiān)測(cè)食品(蔬菜、水果、糧豆類、肉蛋奶類)中滴滴涕污染比較普遍，食品中滴滴涕總量中位數(shù)為7.2ng/g。上海市人奶中(以奶脂計(jì))總滴滴涕的平均值為1594ng/g，高于德國20世紀(jì)90年代蓄積水平的6倍。及時(shí)對(duì)滴滴涕農(nóng)藥造成的污染土壤進(jìn)行修復(fù)，對(duì)環(huán)境保護(hù)、生態(tài)恢復(fù)及農(nóng)業(yè)發(fā)展和人類健康有者十分重要的意義。自然界滴滴涕農(nóng)藥殘留的降解主要依靠土壤中微生物來完成，但自然降解十分緩慢。而生物修復(fù)技術(shù)因其高效、安全、廉價(jià)和無二次污染正越來越受到重視。因此，有針對(duì)性地篩選高效微生物菌株，研制微生物修復(fù)接種劑，通過人工接種加速土壤長殘效滴滴涕農(nóng)藥的 消解進(jìn)程、消除農(nóng)田滴滴涕殘留危害是一項(xiàng)十分必要的工作和切實(shí)可行的途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明通過系統(tǒng)篩選獲得一種滴滴涕降解菌，利用該菌可降解滴滴涕，從而進(jìn)行土壤滴滴涕污染的修復(fù)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種滴滴涕降解菌，為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。

上述一種滴滴涕降解菌的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

S1、稱取粉碎后過1.0mm篩的長期受有機(jī)氯農(nóng)藥DDE污染的農(nóng)田土壤樣品10g，加入到100ml含20mg/L的缺碳富DDE培養(yǎng)基中，在36±1℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48h，得培養(yǎng)液；

S2、按3％接種量依次取所得培養(yǎng)液3ml傳代至含有50mg/L、100mg/L、200mg/L的缺碳富DDE培養(yǎng)基中，在36±1℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)篩選48h；

S3、完成缺碳富DDE培養(yǎng)篩選后，利用平板劃線接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在36±1℃恒溫培養(yǎng)20h，劃線分離得單菌落，經(jīng)檢驗(yàn)為G+，菌落灰褐色，扁平大菌落，邊緣整齊，顯挑起，凸出，顯微鏡下可見芽孢。

優(yōu)選地，所述缺碳富DDE培養(yǎng)基通過以下步驟制備：

稱取營養(yǎng)肉湯4份作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入用過0.22μm無菌濾膜的丙酮與無菌吐溫-80溶解的DDE純品20mg、50mg、100mg和200mg，則制成的缺碳富DDE培養(yǎng)基中DDE終濃度分別為20mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L.

優(yōu)選地，所述營養(yǎng)肉湯由以下原料制備而成：

8g蛋白胨，5g牛肉膏，5g氯化鈉，1000mL蒸餾水。

優(yōu)選地，所述營養(yǎng)肉湯的pH為7.4，所述丙酮與無菌吐溫-80的質(zhì)量比為1:1。

本發(fā)明的菌株在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中4天對(duì)20mg/LDDE的降解率達(dá)到45.2％。

本發(fā)明的滴滴涕降解菌可用于修復(fù)土壤滴滴涕污染，具體的，可利用缺碳富滴滴涕培養(yǎng)基馴化液體培養(yǎng)，制成菌懸液；可使用草碳富集，用水控制濕度，適當(dāng)增加溶解性有機(jī)質(zhì)，制成粉狀固體接種劑；可進(jìn)行田間溝施，輔以須根植物促進(jìn)土壤中滴滴涕降解。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的蠟狀芽孢桿菌(Baci l lus cereus)具有對(duì)滴滴涕的降解功能，可用于土壤滴滴涕污染的修復(fù)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例

DDE耐受菌馴化分離

1.DDE耐受菌的篩選

1)缺碳富DDE培養(yǎng)基：稱取營養(yǎng)肉湯4份(組成公開：10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g氯化鈉，1000mL蒸餾水，pH7.4)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入用丙酮(過0.22μm無菌濾膜)與無菌吐溫-80(1:1比例混合)溶解的DDE純品20mg、50mg、100mg和200mg，則制成的缺碳富DDE培養(yǎng)基中DDE終濃度分別為20mg/L、50mg/L、100mg/L和200mg/L。

2)稱取粉碎后過1.0mm篩的長期受有機(jī)氯農(nóng)藥DDE污染的農(nóng)田土壤樣品10g，加入到100ml含20mg/L的DDE營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在36±1℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)48h。再按3％接種量依次取上代培養(yǎng)液3ml傳代至含有50mg/L、100mg/L、200mg/L的缺碳富DDE培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上。

2、DDE耐受菌劃線分離

經(jīng)過不同DDE濃度梯度的缺碳富DDE培養(yǎng)篩選后，利用平板劃線接種至營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在36±1℃恒溫培養(yǎng)20h。劃線分離得單菌落，經(jīng)檢驗(yàn)為G+，菌落灰褐色，扁平大菌落，邊緣整齊，顯挑起，凸出，顯微鏡下可見芽孢。

DDE降解菌篩選

1.方法：利用不同濃度DDE作唯一碳源篩選DDE降解菌

2.DDE降解菌的篩選過程：

1)將劃線分離得到單菌落接種于DDE終濃度為100mg/L的細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于36±1℃、150r/min搖床培養(yǎng)4d后，培養(yǎng)基變渾濁的，說明培養(yǎng)菌能利用DDE作為碳源在細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長。

2)細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基的公開配方：

0.5g MgSO₄·7H₂O,1.0g(NH4)₂SO₄,0.5g KH₂PO₄,0.5g NaCl,0.05g酵母膏，1.5g K₂HPO₄,0.1g CaCl₂,0.01g FeCl₃,蒸餾水1L，pH7.0。

3)將培養(yǎng)4d后的培養(yǎng)液劃線接種至DDE終濃度100ppm的營養(yǎng)瓊脂中培養(yǎng)，出現(xiàn)菌落降解圈，觀察菌落形態(tài)均一，鏡檢結(jié)果與之前挑取的細(xì)菌形態(tài)一致，說明此細(xì)菌能夠在細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基中利用DDE為碳源生長，純化效果較好。

DDE的細(xì)菌降解特性

1.方法：在DDE濃度分別為100mg/L、20mg/L的細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)4d后，用氣相色譜法測(cè)定DDE殘留量并計(jì)算降解率。

2.DDE降解特性試驗(yàn)過程：

1)選取具有降解特性的細(xì)菌作為菌源進(jìn)行降解特性試驗(yàn)

2)采用細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基，同時(shí)做空白對(duì)照

3)設(shè)置培養(yǎng)基中DDE終濃度分別為100mg/L、20mg/L

4)接種后于36±1℃、150r/min搖床恒溫培養(yǎng)4d

5)萃取培養(yǎng)基中的DDE：取10ml充分混勻的培養(yǎng)液，加入90ml正己烷至250ml三角瓶中，渦旋振蕩約2min，取3ml上層有機(jī)相于10ml離心管中，加 入0.5g無水硫酸鈉，渦旋振蕩后取0.1ml至含有1ml正己烷的上樣小瓶中，供GC-ECD檢測(cè)

6)經(jīng)過4d培養(yǎng)后，原20mg/L的培養(yǎng)基中的DDE的殘留濃度為9.4mg/L，空白對(duì)照為18.5mg/L(理論為20mg/L)，檢測(cè)結(jié)果證明DDE的細(xì)菌降解率為45.2％。原100mg/L的培養(yǎng)基中的DDE的殘留濃度為79.2mg/L，空白對(duì)照為97.5mg/L，DDE的細(xì)菌降解率為18.1％。

降解菌的理化試驗(yàn)結(jié)果如下表所示。

五、接種劑制備

利用細(xì)菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基，添加DDE濃度至25mg/L，接種DDE降解菌，36 ±1℃、150r/min搖床恒溫培養(yǎng)2d，收集菌懸液，使用630um草碳富集(菌懸液體積與草炭的重量比值為200ml：500g)，增加吐溫-80溶解性有機(jī)質(zhì)10ml，加蒸餾水控制濕度為40％，制成粉狀固體接種劑，塑封袋4℃保存。

六、接種劑應(yīng)用

在長期受DDE污染的田間溝施使用(畝施1.5kg)，輔以苜蓿等須根植物促進(jìn)土壤中滴滴涕降解。可用于修復(fù)土壤DDE污染。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。