本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

新城疫(newcastledisease,nd)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus,ndv)引起的一種高度接觸性、致死性的烈性傳染病，禽類感染后以呼吸道、消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷為主要特征。ndv屬于副黏病毒科，為單股、不分節(jié)段、有囊膜的負(fù)鏈rna病毒，基因組結(jié)構(gòu)為3′-np-p-m-f-hn-l-5′，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，目前只有一個血清型。該病呈世界性分布，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。對于多數(shù)國家養(yǎng)禽業(yè)，不僅因暴發(fā)新城疫導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且控制本病成本較高。免疫接種是預(yù)防新城疫的有效手段，但需要反復(fù)監(jiān)測，成本較高。

核酸適配體，也稱適配子或適配體，作為“化學(xué)抗體”，能夠特異性識別和結(jié)合靶分子。1990年，tuerk利用體外篩選技術(shù)獲得能與t4dna聚合酶特異性結(jié)合的rna，并把該技術(shù)定義為指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)。同年，ellington發(fā)現(xiàn)了能與小分子有機(jī)染料結(jié)合的rna片段，將其命名為核酸適配體(aptamer)。適配體是一段具有特定三維構(gòu)象的單鏈寡核苷酸，長度一般在60～100nt，通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，從人工合成的隨機(jī)核苷酸序列文庫中經(jīng)過多輪篩選分離，獲得能與靶分子高特異性和高親和力結(jié)合的寡核苷酸序列。適配體是以其穩(wěn)定的三維構(gòu)象為基礎(chǔ)，主要包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖、三重體、假結(jié)體和g-四聯(lián)體。通過自身構(gòu)象變化和三維折疊形成能與靶分子特異性結(jié)合的位點(diǎn)。核酸分子在儲存、運(yùn)輸、處理和表達(dá)遺傳信息的生物過程中發(fā)揮重要作用，而適配體因其與靶分子分子具有特異性親和識別的性質(zhì)，拓寬了人們對核酸作為傳統(tǒng)遺傳物質(zhì)的概念認(rèn)識。適配體作為“化學(xué)抗體”，可作為功能阻斷劑影響病毒的復(fù)制和翻譯等過程，進(jìn)而阻止疾病的發(fā)生；此外，適配體也可以替代抗體的特定功能，用于相關(guān)病毒病的檢測。近年來，適配體被廣泛作為理想的識別元件用于目標(biāo)分子的檢測。適配體識別靶物質(zhì)的模式與傳統(tǒng)的抗體識別模式類似，與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體具有更多的優(yōu)勢，如表1所示。

表1適配體與抗體的特點(diǎn)比較

目前，各種改進(jìn)的selex篩選方法層出不窮，至今沒有固定標(biāo)準(zhǔn)。將篩選用的文庫和靶分子按一定比率混合，并選擇合適的條件(介質(zhì)、溫度、緩沖體系、時間等進(jìn)行孵育)，該步驟雖然簡單，但是不同條件會影響篩選的效率與配基的親和力。如何獲得具有更高特異性和親和力的適配體，剔除非特異性序列和特異性較差的序列，提高篩選的效率是亟待努力解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有蛋白抗體的技術(shù)不足，提供一種具有與靶分子高親和力、高特異性結(jié)合、易獲得、其過程不依賴動物、細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境、制備周期短，成本低、比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好的特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體。

本發(fā)明另一個目的是提供上述核酸適配體的篩選方法。

本發(fā)明再一個目的是提供上述核酸適配體在檢測新城疫病毒中的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體，所述核酸適配體的序列如seqidno.1所示。

所述核酸適配體的核苷酸序列上的兩端位置被氨基化、羧基化、巰基化或同位素化。

所述核酸適配體的核苷酸序列上結(jié)合熒光標(biāo)記物、生物素修飾、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記。

上述特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體的篩選方法，包括如下步驟：

s1.合成隨機(jī)核酸dna文庫和用于pcr擴(kuò)增的上游引物和上游引物：

隨機(jī)核酸文庫序列如seqidno.1所示；

上游引物f序列如seqidno.2所示；

下游引物r序列如seqidno.3所示；

生物素修飾上游引物biotin-f如seqidno.4所示；

s2.篩選核酸適配體：將步驟s1中隨機(jī)核酸文庫與靶分子進(jìn)行孵育，用硝酸纖維素濾膜進(jìn)行分離，得到與靶分子結(jié)合的寡核苷酸，即為篩選所得的特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體文庫；

s3.擴(kuò)增核酸適配體文庫：利用s1中合成的引物，將s2所得的寡核苷酸進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到雙鏈dna；

s4.制備單鏈dna文庫：以s3所得的雙鏈dna為模板，利用上游和下游引物，以s3中得到的雙鏈dna為模板，用不對稱pcr方法擴(kuò)增制備單鏈dna，通過乙醇沉淀方式回收擴(kuò)增的單鏈dna文庫；

s5.重復(fù)篩選：將步驟s4中的單鏈dna文庫替代步驟s2中的隨機(jī)文庫，并重復(fù)上述步驟s2-s4的過程至少5次；

s6.反篩：將步驟s5篩選得到的單鏈dna文庫與非靶分子15℃～37℃孵育30min，用微孔板進(jìn)行分離，得到與靶分子沒有結(jié)合的寡核苷酸；

s7.將s6得到的寡核苷酸作為模板，重復(fù)s3-s4步驟，制備下一輪篩選用的次級文庫制備；

s8.循環(huán)篩選：以步驟s7中的次級文庫替代s2中的隨機(jī)核酸文庫，重復(fù)上述步驟s2-s7至10次，得到特異性結(jié)合新城疫病毒gm株的單鏈dna文庫；以biotin-f和r為引物，每輪篩選得到的次級文庫為模板，擴(kuò)增得到生物素修飾單鏈dna，用elisa法測定單鏈dna文庫與靶分子的親和性，直至滿足親和力要求后，將所得產(chǎn)物經(jīng)克隆測序分析，最終得到核酸適配體。

優(yōu)選地，步驟s2中所述靶分子為新城疫h(yuǎn)n蛋白或新城疫病毒gm，步驟s6中所述非靶分子為禽流感病毒、spf雞胚尿囊液或牛血清白蛋白。

優(yōu)選地，步驟s2中所述孵育的時間為15～60min；步驟s6中所述孵育的時間為30min。

優(yōu)選地，步驟s3中所述制備雙鏈dna時，pcr的工藝條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，擴(kuò)增9～15個循環(huán)。

優(yōu)選地，步驟s4中所述不對稱pcr制備單鏈dna時，上下游引物含量比為50～100:1。

優(yōu)選地，步驟s4中所述制備單鏈dna時，pcr的工藝條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃延伸7min，擴(kuò)增30～40個循環(huán)。

另外，上述的核酸適配體在檢測新城疫病毒中的應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。適配體b53具有抑制病毒復(fù)制、血凝活性和形成蝕斑的能力，能夠特異性識別hn蛋白和新城疫病毒gm株，而對禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒和spf雞胚尿囊液無反應(yīng)性，可用于檢測新城疫病毒。

本發(fā)明首先在體外合成總長度為81nt的ssdna文庫，兩端為用于pcr擴(kuò)增的固定序列，中間為40nt的隨機(jī)序列。利用page和變性page分析pcr條件優(yōu)化結(jié)果，進(jìn)而確定了pcr的退火溫度、循環(huán)數(shù)以及不對稱引物含量。以原核表達(dá)的新城疫h(yuǎn)n蛋白和新城疫病毒gm株為靶分子，利用硝酸纖維素膜過濾法篩選和微孔板法反篩，經(jīng)過10輪的反復(fù)篩選，獲得特異性結(jié)合hn蛋白和新城疫病毒gm株的適配體。使用dnaman軟件對測序結(jié)果進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)分析，并利用mfold預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)。利用elisa和dotblot試驗(yàn)分析適配體的親和力和特異性，并通過血凝抑制試驗(yàn)和蝕斑抑制試驗(yàn)分析適配體生物學(xué)活性。結(jié)果表明，特異性結(jié)合新城疫病毒的核酸適配體具有與靶分子高親和力、高特異性結(jié)合、易獲得、其過程不依賴動物、細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境、制備周期短，成本低、比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好的特點(diǎn)，可用于檢測新城疫病毒。

目前各種改進(jìn)的selex篩選方法將篩選用的文庫和靶分子按一定比率混合，并選擇合適的條件(介質(zhì)、溫度、緩沖體系、時間等進(jìn)行孵育)，該步驟雖然簡單，但不同條件會影響篩選的效率與配基的親和力。本發(fā)明在硝酸纖維素濾膜方法的基礎(chǔ)上做出如下改進(jìn)：采用硝酸纖維素濾膜和微孔板結(jié)合的selex方法，通過交替使用不同孵育介質(zhì)，以獲得具有更高特異性和親和力的適配體。逐漸調(diào)整篩選條件，如減少靶分子和次級文庫的投入量，縮短孵育時間等，以獲得與靶分子結(jié)合力更強(qiáng)的寡核苷酸，比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好，可有效降低實(shí)際生產(chǎn)中批次間的差異。適當(dāng)?shù)姆春Y步驟，有利于非特異性序列和特異性較差序列的剔除，提高了篩選的效率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明采用硝酸纖維素濾膜和微孔板結(jié)合的selex篩選方法，通過交替使用不同孵育介質(zhì)，篩選獲得具有更高特異性和親和力的新城疫病毒的核酸適配體b53。該適配體b53具有抑制病毒復(fù)制的能力、血凝抑制活性和形成蝕斑的能力，能夠減少44.2％的gm株病毒蝕斑；能夠特異性識別新城疫h(yuǎn)n蛋白和新城疫病毒gm株，而對禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒和spf雞胚尿囊液無反應(yīng)性，可用于檢測新城疫病毒。

2.本發(fā)明通過體外篩選過程進(jìn)化，其過程不依賴動物、細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境；制備周期短，成本低且易獲得；通過減少靶分子和次級文庫的投入量，縮短孵育時間等逐漸優(yōu)化篩選條件，以獲得與靶分子結(jié)合力更強(qiáng)的寡核苷酸。比抗體更穩(wěn)定，重復(fù)性好，可有效降低實(shí)際生產(chǎn)中批次間的差異；同時，采用增加反篩過程，也利于剔除非特異性序列和特異性較差的序列，提高了篩選的效率。篩選得到的特異性結(jié)合新城疫病毒的適配體可為新城疫病毒的檢測及治療提供一個新思路。

附圖說明

圖1是selex篩選獲得的適配體b53的一級和二級結(jié)構(gòu)，其中，a圖表示適配體的一級結(jié)構(gòu)，b圖表示適配體的二級結(jié)構(gòu)。

圖2是每輪篩選得到的ssdna文庫親和力測定結(jié)果。

圖3是selex篩選獲得的適配體b53的elisa檢測結(jié)果，其中，a圖表示適配體對新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的親和力；b圖表示適配體對不同病毒的親和力。

圖4是selex篩選獲得的適配體b53的dot-blot檢測結(jié)果。a圖表示適配體對新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的結(jié)果；b圖表示適配體對不同病毒的結(jié)果。

圖5是selex篩選獲得的適配體b53的dot-blot分析結(jié)果。

圖6是selex篩選獲得的適配體b53的血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果。

圖7是selex篩選獲得的適配體b53的蝕斑抑制試驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖說明和具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

實(shí)施例1.新城疫病毒核酸適配體的體外篩選

s1.構(gòu)建合成長度為81nt的隨機(jī)核酸文庫，序列如seqidno.1所示，5'-ccggaattcctaatacgactc–(n)40–tattgaaaacgcggccgcgg-3'；其中，兩端分別為20和21個堿基的固定序列，中間40個堿基為隨機(jī)序列。

合成用于pcr擴(kuò)增的上游引物f和下游引物r的序列為：

上游引物f：5'-ccggaattcctaatacgactc-3'，如seqidno.2所示；

下游引物r：5'-ccgcggccgcgttttcaata-3'，如seqidno.3所示；

生物素修飾上游引物biotin-f：5'-biotin-ccggaattcctaatacgactc-3'，如seqidno.4所示。

s2.ssdna文庫與hn蛋白的孵育與分離，取35.5μgssdna文庫加入到100μl結(jié)合緩沖液中(50mmtris-hcl，25mmnacl，5mmmgcl2，10mmdtt(dithiothreitol)，ph7.5)，95℃水浴10min后，迅速冰浴10min。為減少非特異性ssdna與膜的結(jié)合，篩選前用結(jié)合緩沖液將膜浸濕，將文庫與裝在pop-top過濾器中的硝酸纖維素膜上過濾3次，濾過的ssdna用于下一步篩選。

s3.硝酸纖維素膜篩選：將硝酸纖維素膜裝入pop-top過濾器中，并確保硝酸纖維素膜與注射器內(nèi)壁結(jié)合緊密，用結(jié)合緩沖液把膜潤濕，取上一步驟中濾過的ssdna文庫加入到hn蛋白溶液中，室溫孵育90min(每輪篩選對應(yīng)ssdna文庫量和hn蛋白量隨著篩選輪數(shù)的增加而減少)。并把核酸和蛋白孵育的溶液用過濾器過濾，然后用結(jié)合緩沖液沖洗，洗掉未與蛋白結(jié)合的寡核苷酸。

s4.反篩：在第5輪篩選時加入反篩環(huán)節(jié)，即將不相關(guān)靶分子(禽流感病毒、spf雞胚雞胚尿囊液和牛血清白蛋白)包被于酶標(biāo)板中并用bsa溶液封閉，首先將ssdna和靶分子孵育溶液加入到酶標(biāo)板中，室溫孵育30min，然后再將溶液吸出加入到hn蛋白溶液中，室溫孵育。用過濾器過濾，然后用結(jié)合緩沖液沖洗，洗掉未與蛋白結(jié)合的寡核苷酸。

s5.用乙醇共沉劑回收ssdna，通過pcr擴(kuò)增目的條帶，不對稱pcr制備ssdna。獲得的ssdna作為次級文庫，用于下一輪篩選。

s6.測定每輪獲得的ssdna次級文庫的親和性，其基本原理是將洗脫的特異性ssdna序列用pcr的方法擴(kuò)增成雙鏈，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收后作為模板，通過不對稱pcr方法，用帶生物素標(biāo)記的bio-f和r作為引物，大量擴(kuò)增，通過乙醇沉淀的方式回收合成的次級文庫，測濃度備用。標(biāo)記生物素的ssdna作為一抗，hrp標(biāo)記的鏈酶親和素作為二抗，用elisa的方法測定文庫與靶分子的親和性。具體步驟如下：

(1)包被抗原：將新城疫病毒hn蛋白包被微孔板，空白對照孔加入等量的包被液，4℃過夜；

(2)封閉：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。加入1％的bsa封閉液37℃恒溫箱中封閉2h；

(3)加入biotin-ssdna文庫：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。將處理好的各輪亞庫投入到微孔板中，每孔投入量為500pmol，37℃恒溫箱中孵育2h；

(4)加入“二抗”：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。將1:5000稀釋的hrp標(biāo)記的鏈酶親和素作為“二抗”加入微孔板中，100μl/孔，37℃恒溫箱中孵育1h；

(5)顯色讀取數(shù)值：棄去微孔板中的液體，用pbst漂洗。加入100μl/孔tmb顯色后，加入等量終止液，讀取od450值。結(jié)果如圖2所示，觀察到隨著篩選輪數(shù)的增加，陽性比例增多，od450逐漸增大，而到了第9輪之后增大不明顯，且與第10輪沒有明顯的區(qū)別，表明篩選輪數(shù)增加不能再提高序列富集程度，篩選過程完成。

s7.將最后一輪篩選的次級文庫克隆、鑒定和測序，獲得核酸適配體序列。

實(shí)施例2.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)

將篩選獲得的核酸適配體送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并進(jìn)行生物素修飾，應(yīng)用elisa方法測定特異性。選取不同樣品，包被量為2μl/孔，同時設(shè)立空白對照組。4℃包被過夜，用1％的bsa37℃封閉后，將不同的生物素標(biāo)記的適配體加入孔內(nèi)進(jìn)行孵育，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素進(jìn)行孵育，加入底物進(jìn)行顯色，終止顯色，用酶標(biāo)儀測od450值。

圖3為selex篩選獲得的適配體b53的elisa檢測，a圖表示適配體對新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的親和力。如圖3所示，結(jié)果表明適配體b53均對新城疫病毒f48e9、gm和lasota株均具有親和力，其中對gm親和力最高；b圖表示適配體對不同病毒的親和力，結(jié)果表明，適配體b53均對ndvgm株表現(xiàn)出特異性親和，對aiv、ibdv和spf雞胚無反應(yīng)性。

實(shí)施例3..斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)(dot-blot)

將2μlhn蛋白(1mg/ml)、gm株純化病毒、aiv、ibv、spf雞胚雞胚尿囊液點(diǎn)至nc膜中，同時設(shè)立不滴加溶液的空白對照組；待nc膜干燥后，加入3％bsa封閉液37℃搖床封閉2h，用pbst溶液洗膜；將濃度為5pmol/μl生物素標(biāo)記的ssdna，加到nc膜上，37℃搖床孵育2h后，用pbst溶液洗膜；將nc膜加入到1:5000稀釋的streptavidin-hrp溶液中，37℃恒溫?fù)u床孵育1h后，用pbst溶液洗膜3次，每次3min；dab顯示10min后終止顯色，取出膜片，觀察膜片顯色情況。

適配體特異性分析結(jié)果如圖4所示，圖4a表示適配體對新城疫病毒不同毒株f48e9、gm和lasota的結(jié)果，b53能夠特異性結(jié)合新城疫病毒不同毒株，出現(xiàn)不同灰度的斑點(diǎn)。其中g(shù)m株灰度最強(qiáng)，說明適配體b53對gm的親和力比f48e9和lasota強(qiáng)；圖4b表示適配體對不同病毒的結(jié)果，b53能夠特異性結(jié)合hn蛋白和新城疫病毒gm株，出現(xiàn)不同亮暗程度的斑點(diǎn)，且ndv處的斑點(diǎn)比hn處淡，aiv、ibv和spf雞胚胚尿囊液處無斑點(diǎn)出現(xiàn)。說明適配體b53具有較高的特異性。結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。適配體對新城疫病毒和hn蛋白親和力分析結(jié)果如圖5所示，左圖表示適配體對不同濃度hn蛋白識別結(jié)果，右圖表示適配體對不同濃度ndv識別結(jié)果。隨著hn蛋白和gm濃度減低，dab顯色的斑點(diǎn)逐漸變暗，當(dāng)hn蛋白濃度低于0.25mg/ml、gm低于16hau時，dab顯色后無斑點(diǎn)出現(xiàn)。

實(shí)施例4.血凝抑制試驗(yàn)

用結(jié)合緩沖液將適配體稀釋成50pmol/μl，95℃水浴加熱10min后立即冰浴10min，處理過后的適配體與新城疫病毒gm株室溫下孵育30min。首先取96孔微反應(yīng)板，用微量移液器在1孔～12孔每孔加入25μlpbs；然后吸取25μl適配體與病毒混合液加入到第1孔中，吹打混勻；接著從第1孔中吸取25μl混合液加入到第2孔，混勻后吸取25μl加入到第3孔，依次進(jìn)行倍比稀釋到第11孔，最后從第11孔吸取25μl棄掉，第12孔為pbs空白對照組；最后每孔加入25μl體積分?jǐn)?shù)為1％的雞紅細(xì)胞懸液，室溫下靜置15min觀察結(jié)果。同時設(shè)置病毒對照組，即用等量的結(jié)合緩沖液代替適配體與新城疫病毒室溫孵育。

如圖6所示，篩選到的優(yōu)勢適配體與gm株病毒進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，設(shè)置病毒對照組。結(jié)果表明適配體均具有不同程度的針對gm株病毒的血凝抑制活性，其中病毒對照組血凝效價為11log2，a1處理組的血凝效價為9log2，a3處理組的血凝效價為7log2，a20處理組的血凝效價為10log2，b7、b53和b60處理組的血凝效價為8log2。

實(shí)施例5.蝕斑抑制試驗(yàn)

將次代cef鋪于6孔細(xì)胞板，待細(xì)胞長滿單層后，吸出培養(yǎng)基，每孔依次加入450μl新城疫病毒gm株病毒稀釋液(使用dmem培養(yǎng)基10倍稀釋，稀釋倍數(shù)為10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)，并設(shè)置未接毒的空白組，加入450μl的dmem。37℃培養(yǎng)1h吸出病毒液，pbs洗滌細(xì)胞1次。接著每孔覆蓋2ml固體培養(yǎng)基(dmem/2％fbs+2％低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，體積比為1:1，37℃培養(yǎng)3d后，每孔加入1ml0.1％中性紅溶液，染色20min后棄染液，37℃避光培養(yǎng)1h，即可用肉眼觀察計數(shù)空斑，以能清楚識別單個蝕斑的病毒稀釋度為最佳稀釋濃度。用結(jié)合緩沖液將適配體稀釋成100pmol/μl，95℃水浴加熱10min后立即冰浴10min，處理過后的適配體與新城疫病毒gm株室溫下孵育30min，并用dmem稀釋到最佳稀釋濃度，37℃培養(yǎng)1h吸出病毒液，pbs洗滌細(xì)胞1次。接著每孔覆蓋2ml固體培養(yǎng)基(dmem/2％fbs+2％低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，體積比為1:1，37℃培養(yǎng)3d后，每孔加入1ml0.1％中性紅溶液，染色20min后棄染液，室溫37℃避光培養(yǎng)1-5h，即可用肉眼觀察計數(shù)空斑，同時設(shè)置等體積結(jié)合緩沖液與新城疫病毒gm室溫孵育30min的病毒對照組。

如圖7所示，數(shù)值1表示空白組，無蝕斑；數(shù)值2表示病毒對照組，蝕斑數(shù)量為52；數(shù)值3表示適配體b53處理組，蝕斑數(shù)為29。結(jié)果表明，適配體能夠減少44.2％的gm株病毒蝕斑，具有較強(qiáng)的病毒蝕斑抑制能力。

本發(fā)明的上述實(shí)施例僅為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。