本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定期自裂解的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)由于具有生長(zhǎng)速度快、發(fā)酵周期短、胞外分泌蛋白能力強(qiáng)等特點(diǎn)，正在為應(yīng)用生物學(xué)發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)作為研究透徹模式菌株又是被普遍認(rèn)為是安全的(GRAS)，已廣泛應(yīng)用于食品和藥品的研究和生產(chǎn)中。

但是，利用枯草芽孢桿菌過(guò)量表達(dá)某些酶分子和合成一些胞內(nèi)代謝產(chǎn)物時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)這些產(chǎn)物本身性質(zhì)的原因不能夠大量的分泌到細(xì)胞外，而枯草芽孢桿菌由于其革蘭氏陽(yáng)性菌的特質(zhì)，胞外具有很厚的肽聚糖層，破碎過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且容易造成目標(biāo)產(chǎn)物變性。因此，一種能夠自降解的表達(dá)宿主對(duì)于生產(chǎn)胞內(nèi)蛋白或分泌能力較差的產(chǎn)物具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了滿足目前利用枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)代謝產(chǎn)物和酶制劑等過(guò)程中需要在穩(wěn)定期自發(fā)裂解并釋放胞內(nèi)目的物質(zhì)的需求，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定期自裂解枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主，并將其應(yīng)用至蛋白分子的表達(dá)。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種穩(wěn)定期自裂解的枯草芽孢桿菌載體，所述載體攜帶穩(wěn)定期啟動(dòng)的啟動(dòng)子和由該啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)的自裂解蛋白的基因；所述編碼自裂解蛋白的基因是由所述穩(wěn)定期啟動(dòng)的啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定期啟動(dòng)子包括P_mmgA、P_sigW和P_yqfD，其序列分別如SEQ ID NO.1～3所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述菌體裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分別如SEQ ID NO.4～8所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述載體的出發(fā)載體為pAX01。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種穩(wěn)定期自裂解的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌攜帶所述載體，在細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后會(huì)發(fā)生自降解，從而釋放胞內(nèi)目的產(chǎn)物。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述穩(wěn)定期自裂解的枯草芽孢桿菌的制備方法，是構(gòu)建攜帶穩(wěn)定期啟動(dòng)的啟動(dòng)子和裂解蛋白基因的整合載體，再重組到枯草芽孢桿菌基因組上；所述穩(wěn)定期啟動(dòng)的啟動(dòng)子包括P_mmgA、P_sigW和P_yqfD；編碼所述菌體裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG。在一般培養(yǎng)條件下，菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期以前，該宿主中具有裂解細(xì)胞活性的蛋白不會(huì)表達(dá)。但進(jìn)入穩(wěn)定期后，在穩(wěn)定期啟動(dòng)子的作用下開(kāi)始表達(dá)，從而使細(xì)胞裂解。利用穩(wěn)定期自裂解枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主對(duì)外源基因進(jìn)行質(zhì)粒表達(dá)，驗(yàn)證了該表達(dá)系統(tǒng)的有效性。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定期啟動(dòng)子包括P_mmgA、P_sigW和P_yqfD，其序列分別如SEQ ID NO.1～3所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，編碼所述菌體裂解蛋白的基因是skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG，其序列分別如SEQ ID NO.4～8所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌包括：Bacillus subtilis 168，Bacillus subtilis131.1，Bacillus subtilis AG1839，Bacillus subtilis PY79，Bacillus subtilis BAB-1，Bacillus subtilisXF-1。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述整合載體的出發(fā)載體為pAX01。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法主要包括以下步驟：

1.構(gòu)建攜帶穩(wěn)定期啟動(dòng)子和自裂解蛋白基因的整合質(zhì)粒：以枯草芽孢桿菌基因組為模板，PCR獲得穩(wěn)定期啟動(dòng)子和自裂解蛋白的編碼基因的DNA片段，通過(guò)酶切連接的方式插入到整合載體上，通過(guò)轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的宿主，獲得攜帶穩(wěn)定期啟動(dòng)子和編碼自裂解蛋白的基因的整合質(zhì)粒。

2.穩(wěn)定期自裂解枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主的獲得：將攜帶有穩(wěn)定期啟動(dòng)子和編碼自裂解蛋白基因的整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至不含有整合質(zhì)粒所攜帶抗性基因的宿主枯草芽孢桿菌中，在相應(yīng)的抗性條件下篩選，獲得穩(wěn)定期自裂解枯草芽孢桿菌。

該表達(dá)宿主的有效性的驗(yàn)證是以改造前的枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主為對(duì)照的，通過(guò)與對(duì)照比較基因表達(dá)情況來(lái)驗(yàn)證有效性。

步驟1中攜帶有穩(wěn)定期啟動(dòng)子和裂解基因的整合質(zhì)粒的具體構(gòu)建方法如下：

(1)穩(wěn)定期啟動(dòng)子和自裂解蛋白的編碼基因的DNA片段的獲得：以Bacillus subtilis 168(Bacillus subtilis 168，獲取自美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)Bacillus遺傳保藏中心)基因組模板，PCR擴(kuò)增Bacillus subtilis 168基因組上P_mmgA、P_sigW和P_yqfD三個(gè)穩(wěn)定期啟動(dòng)子DNA片段，以及skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG五個(gè)自裂解蛋白編碼基因的DNA片段。

(2)整合質(zhì)粒的構(gòu)建：將P_mmgA、P_sigW和P_yqfD啟動(dòng)子DNA片段和skfA、sdpC、xpf、lytC和bsrG五個(gè)基因的DNA片段通過(guò)雙酶切后，分別與相同酶切處理過(guò)的pAX01質(zhì)粒進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)入Escherichia coli JM109中，通過(guò)氨芐青霉素平板篩選和質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，分別得到攜帶有穩(wěn)定期啟動(dòng)子和裂解基因的整合質(zhì)粒；具體為攜帶P_mmgA的質(zhì)粒pPMMGA-skfA、pPMMGA-sdpC、pPMMGA-xpf、pPMMGA-lytC和pPMMG-bsrG，攜帶P_sigW的質(zhì)粒pPSIGW-skfA、pPSIGW-sdpC、pPSIGW-xpf、pPSIGW-lytC和pPSIGW-bsrG，和攜帶P_yqfD的質(zhì)粒pPYQFD-skfA、pPYQFD-sdpC、pPYQFD-xpf、pPYQFD-lytC和pPYQFD-bsrG。

步驟2中穩(wěn)定期自裂解枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主的獲得的具體方法如下：

將上述15個(gè)整合質(zhì)粒分別通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌中，通過(guò)在紅霉素平板上篩選，然后通過(guò)PCR的方法進(jìn)行驗(yàn)證，得到15株穩(wěn)定期自裂解枯草芽孢桿菌表達(dá)宿主，分別命名為B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC、B.subtilis YBG。

該表達(dá)宿主有效性的驗(yàn)證，可以選用各種外源基因進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，以熒光蛋白為例，驗(yàn)證方法如下：

(1)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：PCR擴(kuò)增gfp基因片段，連接到pP43質(zhì)粒上，構(gòu)成新的質(zhì)粒pP43-gfp并轉(zhuǎn)入到Bacillus subtilis 168、B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC和B.subtilis YBG中。

(2)篩選含有Bacillus subtilis 168(pP43-gfp)，B.subtilis MSA(pP43-gfp)、B.subtilis MSC(pP43-gfp)、B.subtilis MXF(pP43-gfp)、B.subtilis MLC(pP43-gfp)、B.subtilis MBG(pP43-gfp)、B.subtilis SSA(pP43-gfp)、B.subtilis SSC(pP43-gfp)、B.subtilis SXF(pP43-gfp)、B.subtilis SLC(pP43-gfp)、B.subtilis SBG(pP43-gfp)、B.subtilisYSA(pP43-gfp)、B.subtilisYSC(pP43-gfp)、B.subtilisYXF(pP43-gfp)、B.subtilis YLC(pP43-gfp)和B.subtilis YBG(pP43-gfp)。

(3)酶活比較：將16株菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定菌體濃度和熒光蛋白含量，比較菌體量和酶活熒光大小。B.subtilis MSA(pP43-gfp)、B.subtilis MSC(pP43-gfp)、B.subtilis MXF(pP43-gfp)、B.subtilis MLC(pP43-gfp)、B.subtilis MBG(pP43-gfp)、B.subtilis SSA(pP43-gfp)、B.subtilis SSC(pP43-gfp)、B.subtilis SXF(pP43-gfp)、B.subtilis SLC(pP43-gfp)、B.subtilis SBG(pP43-gfp)、B.subtilisYSA(pP43-gfp)、B.subtilisYSC(pP43-gfp)、B.subtilisYXF(pP43-gfp)、B.subtilis YLC(pP43-gfp)和B.subtilis YBG(pP43-gfp)中菌體在進(jìn)入穩(wěn)定期后裂解加快，且胞外熒光蛋白含量顯著增加，說(shuō)明該表達(dá)宿主有效。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期自裂解的方法，是將所述的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期，使其自裂解。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述枯草芽孢桿菌在蛋白合成和代謝產(chǎn)物生產(chǎn)方面的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括：生產(chǎn)不易分泌至胞外的酶類和代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)不宜使用機(jī)械破碎或溫度敏感的胞內(nèi)蛋白。

有益效果：本發(fā)明首次篩選獲得了枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期啟動(dòng)的啟動(dòng)子P_mmgA、P_sigW和P_yqfD，并將其用于構(gòu)建枯草芽孢桿菌穩(wěn)定期自裂解表達(dá)宿主，可以使枯草芽孢桿菌在進(jìn)入穩(wěn)定期以后，菌體發(fā)生自裂解，從而達(dá)到釋放胞內(nèi)蛋白和代謝產(chǎn)物的目的。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的B.subtilisMSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilisSSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC和B.subtilis YBG枯草芽孢桿菌宿主表達(dá)熒光蛋白基因(gfp)的效果與傳統(tǒng)表達(dá)宿主B.subtilis 168相比，胞外熒光蛋白含量分別提高了89.3％、85.6％、102.3％、120.3％、139.5％、125.7％、132.4％、78.8％、104.6％、98.4％、99.8％、103.6％、123.5％、128.7％、141.5％。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式中涉及的引物序列如表1所示。

表1引物列表

菌株的培養(yǎng)條件：

種子培養(yǎng)基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化鈉。

發(fā)酵培養(yǎng)基(L)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化鈉，。

培養(yǎng)條件：種子培養(yǎng)12h，37℃，220rpm，發(fā)酵培養(yǎng)24h，接種量5％，37℃，220rpm。菌株培養(yǎng)過(guò)程中添加相應(yīng)濃度的抗生素以維持其質(zhì)粒穩(wěn)定性。

熒光強(qiáng)度測(cè)定方法：

將發(fā)酵液離心10min(10000×g，4℃)，吸取上清液200μL用NUNC96孔黑色酶標(biāo)板進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)做4個(gè)復(fù)孔，所用儀器為BioTek Synergy4多功能酶標(biāo)儀，操作軟件為Gen5。熒光強(qiáng)度參數(shù)設(shè)置為，激發(fā)：488/9nm發(fā)射：509/9nm，頂端發(fā)光，氚氣燈，增益為自動(dòng)調(diào)整增益。

實(shí)施例1整合載體構(gòu)建

以Bacillus subtilis 168基因組模板，#1和#2為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增P_mmgA啟動(dòng)子(如SEQID NO.1所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因組模板，#3和#4為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增P_sigW啟動(dòng)子(如SEQ ID NO.2所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因組模板，#5和#6為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增P_yqfD啟動(dòng)子(如SEQ ID NO.3所示)DNA片段；以Bacillussubtilis 168基因組模板，#7和#8為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增Bacillus subtilis 168skfA基因(如SEQ ID NO.4所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因組模板，#9和#10為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增sdpC基因(如SEQ ID NO.5所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因組模板，#11和#12為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增xpf基因(如SEQ ID NO.6所示)DNA片段；以Bacillussubtilis 168基因組模板，#13和#14為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增lytC基因(如SEQ ID NO.7所示)DNA片段；以Bacillus subtilis 168基因組模板，#15和#16為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增bsrG基因(如SEQ ID NO.8所示)DNA片段反應(yīng)條件：預(yù)變性98℃3min；變性98℃10s；延伸68℃30s；共34cycles；后延伸5min。將上述PCR獲得三個(gè)啟動(dòng)子的DNA片段分別通過(guò)BamHI和kpnI雙酶切處理，5個(gè)基因的DNA片段分別用kpnI和XhoI處理，回收后通過(guò)DNA連接酶與BamHI和XhoI酶切處理的pAX01(如SEQ ID NO.25所示)相連。轉(zhuǎn)化至Escherichia coliJM109后，提取質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確，分別命名為pPMMGA-skfA、pPMMGA-sdpC、pPMMGA-xpf、pPMMGA-lytC、pPMMG-bsrG、pPSIGW-skfA、pPSIGW-sdpC、pPSIGW-xpf、pPSIGW-lytC、pPSIGW-bsrG、pPYQFD-skfA、pPYQFD-sdpC、pPYQFD-xpf、pPYQFD-lytC和pPYQFD-bsrG。

實(shí)施例2利用枯草芽孢桿菌對(duì)數(shù)期表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)熒光蛋白

以質(zhì)粒pMD-19T simple-gfp為模板，#17和#18為引物，克隆gfp熒光蛋白基因(如SEQID NO.29所示)，前端添XhoI酶切位點(diǎn)和RBS，后端添加PstI酶切位點(diǎn)。利用XhoI和PstI酶切獲得的PCR產(chǎn)物，連接到相同酶處理過(guò)的pP43(序列如SEQ ID NO.28所示)上，構(gòu)成新的質(zhì)粒pP43-gfp。

將10μL的濃度為100μg/mL的pP43-gfp質(zhì)粒分別加入到500μL的Bacillus subtilis 168、B.subtilis MSA(pP43-gfp)、B.subtilis MSC(pP43-gfp)、B.subtilis MXF(pP43-gfp)、B.subtilisMLC(pP43-gfp)、B.subtilis MBG(pP43-gfp)、B.subtilis SSA(pP43-gfp)、B.subtilis SSC(pP43-gfp)、B.subtilis SXF(pP43-gfp)、B.subtilis SLC(pP43-gfp)、B.subtilis SBG(pP43-gfp)、B.subtilisYSA(pP43-gfp)、B.subtilisYSC(pP43-gfp)、B.subtilisYXF(pP43-gfp)、B.subtilis YLC(pP43-gfp)和B.subtilis YBG(pP43-gfp)的感受態(tài)細(xì)胞中，45℃熱激3min，37℃搖床220rpm后培養(yǎng)1h，涂布于含有卡納抗生素的LB平板上，37℃培養(yǎng)10h，將長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。

將上一步得到的16種菌進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)每2h取樣測(cè)定熒光強(qiáng)度和菌體濃度，結(jié)果現(xiàn)示，B.subtilis MSA、B.subtilis MSC、B.subtilis MXF、B.subtilis MLC、B.subtilis MBG、B.subtilis SSA、B.subtilis SSC、B.subtilis SXF、B.subtilis SLC、B.subtilis SBG、B.subtilisYSA、B.subtilisYSC、B.subtilisYXF、B.subtilis YLC和B.subtilis YBG的發(fā)酵上清的熒光強(qiáng)度在進(jìn)入穩(wěn)定期后明顯增強(qiáng)，且菌體裂解迅速。與對(duì)照B.subtilis 168(pP43-gfp)相比，最終的菌體濃度分別降低了65.2％、63.2％、73.5％、83.2％、76.3％、80.9％、57.8％、73.5％、67.4％、71.9％、68.5％、69.4％、72.6％、75.8％和85.2％，而胞外熒光蛋白含量分別提高了89.3％、85.6％、102.3％、120.3％、139.5％、125.7％、132.4％、78.8％、104.6％、98.4％、99.8％、103.6％、123.5％、128.7％、141.5％。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。