本發(fā)明涉及一種從苜蓿中提取冰結(jié)構(gòu)蛋白的方法。

背景技術(shù)：

冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice structuring proteins,ISPs)，又稱為不凍蛋白、抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)，是一類由某些魚(yú)類、昆蟲(chóng)、植物、真菌和細(xì)菌為抵抗外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的多肽，具有阻止冰晶形成、修飾冰晶形態(tài)及抑制重結(jié)晶的能力，它具有一定的熱滯活性，即能夠以非依數(shù)性形式降低溶液的冰點(diǎn)，但對(duì)熔點(diǎn)的影響較小，從而使溶液的冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間出現(xiàn)差值。冰結(jié)構(gòu)蛋白特有的性質(zhì)保證生物在低溫條件下得以生存，具有與冰進(jìn)行特異性結(jié)合的能力。2006年，我國(guó)衛(wèi)生部公布冰結(jié)構(gòu)蛋白可作為新型食品添加劑應(yīng)用于冷藏食品中。

由于提取ISPs原料有限，大多從冷水魚(yú)中提取，提取工藝復(fù)雜等因素，造成其成本較高、價(jià)格昂貴，沒(méi)有在冷凍食品中及醫(yī)學(xué)上普遍應(yīng)用，對(duì)ISPs的發(fā)展造成了限制。如何制造出提取工藝簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉的ISPs是ISPs產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的主要任務(wù)。植物ISPs的結(jié)構(gòu)與功能較為復(fù)雜，具有低熱滯性(大多約0.1～0.5℃)和高重結(jié)晶抑制活性(高出魚(yú)類和昆蟲(chóng)ISPs約10～100倍)的特點(diǎn)，少量的植物ISPs就有較高的重晶抑制活性。

多年生苜?？箖瞿芰?qiáng)，蛋白含量高。苜蓿(Medicago sativa)，俗稱金花菜、三葉草，浙滬地區(qū)稱為草頭或草紫。苜蓿為豆科苜蓿屬多年生草本植物。根系發(fā)達(dá)，莖葉豐富，分枝能力強(qiáng)，具有產(chǎn)量高，抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。株高30-70cm?？购詷O強(qiáng)，經(jīng)過(guò)冬季極端低溫(-45℃以下)仍可以有90％以上的返青率，具有極強(qiáng)的抗凍能力。苜蓿的粗蛋白質(zhì)含量一般為15％-22％，其蛋白質(zhì)濃縮物——葉蛋白被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)為是一種具有高開(kāi)發(fā)價(jià)值的新型蛋白質(zhì)資源。目前，苜蓿蛋白的開(kāi)發(fā)、研究、利用正在成為各領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。采用抗凍性強(qiáng)、價(jià)格低廉的苜蓿作為原料，其抗凍蛋白質(zhì)組分含量豐富，具有極大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用潛力，具備工業(yè)化分離提取的原料優(yōu)勢(shì)。

文獻(xiàn)中只提及過(guò)用輔助碎冰從女貞葉提取冰結(jié)構(gòu)蛋白的方法，但是該方法存在不確定性和缺點(diǎn)，工藝復(fù)雜，且原材料需要進(jìn)行冷誘導(dǎo)，冷誘導(dǎo)的原理為：冰結(jié)構(gòu)蛋白在一些生物體內(nèi)積累和消除有季節(jié)性變化，一般在夏季消失，秋季出現(xiàn)，經(jīng)過(guò)冷馴化后冬季達(dá)到最高峰，沒(méi)有對(duì)碎冰使用量進(jìn)行嚴(yán)格的控制，進(jìn)而不能嚴(yán)格控制提取率或得率以及質(zhì)量；女貞葉的蛋白產(chǎn)物都要經(jīng)過(guò)低溫誘導(dǎo)才能表達(dá)、合成和積累。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中冰結(jié)構(gòu)蛋白提取原料有限，提取工藝復(fù)雜，成本較高、提取得到的冰結(jié)構(gòu)蛋白不能在冷凍食品與醫(yī)學(xué)上廣泛應(yīng)用的問(wèn)題，提出了一種從苜蓿中提取冰結(jié)構(gòu)蛋白的方法。

本發(fā)明從苜蓿中提取冰結(jié)構(gòu)蛋白的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、苜蓿干草處理

取苜蓿干草，并除掉苜蓿干草中的雜質(zhì)與灰塵，棄去草莖，保留苜蓿干草葉，粉碎后過(guò)80目篩備用；所述苜蓿干草的含水率為1.3％；

二、冰球的制備

在硅膠冰格的每個(gè)冰孔位置放置直徑為1cm的玻璃球，向冰孔注蒸餾水，然后置于-18℃的冰箱中冷凍，得到直徑為2cm的冰球；

所述硅膠冰格為耐溫為-40℃的硅膠冰格，硅膠冰格為板狀，長(zhǎng)為24cm，寬為7.3cm，板上設(shè)置有10×2個(gè)球形冰孔，每個(gè)冰孔的內(nèi)徑為2cm；

三、上清液制備

按料液比為1g:(5～30mL)將步驟一制備的苜蓿草粉與磷酸鹽緩沖溶液混合得到混合液，將得到的混合液置于室溫下，進(jìn)行攪拌提取0.5～3.0h，然后將提取后的混合液置于離心機(jī)中，在離心機(jī)中離心14～16min得到上清液；

所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為10～70mmol/L；所述攪拌提取時(shí)采用磁力攪拌器，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為800～1000r/min；所述離心時(shí)離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為8000～10000r/min；

四、將步驟二制備的冰球加入上清液中至最上層冰球的上表面與上清液液面相平，然后置于-18℃冰箱中，提取2～5min，此時(shí)冰球吸附ISPs達(dá)到飽和，濾出冰球，冰球融化后得到冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，濾出冰球后得到剩余的上清液；

五、冰結(jié)構(gòu)蛋白ISPs的復(fù)提

向剩余的上清液中加入步驟二制備的冰球，重復(fù)步驟四2～4次，收集每次提取得到的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，即完成。

本發(fā)明具備以下有益效果：

一、本發(fā)明方法中所冰球的直徑是2cm，圓形表面提高了接觸面積，提高了ISPs吸附量冰球內(nèi)凍結(jié)著一個(gè)直徑是1cm的玻璃球，當(dāng)冰球融化后，溶液體積減小，而ISPs的吸附量不變，增加了ISPs的濃度，還可以減少冰球的體積，節(jié)約成本及操作時(shí)間；

二、現(xiàn)有技術(shù)中ISPs一般采用提取、硫酸銨沉淀、離子交換色譜分離過(guò)程、凝膠過(guò)濾色譜分離過(guò)程和高效液相色譜的分離過(guò)程等五個(gè)步驟，方法繁瑣，非抗凍活性組分較多，雜質(zhì)多質(zhì)量差，尤其是硫酸銨沉淀，給后續(xù)的分離純化帶來(lái)很大困難；而本發(fā)明根據(jù)冰結(jié)構(gòu)蛋白與冰結(jié)合的特異性和不可逆性，將前二個(gè)步驟簡(jiǎn)化為冰提，粗分離出來(lái)的為具有抗凍組分的冰結(jié)構(gòu)蛋白，方法簡(jiǎn)便，且本發(fā)明提取得到的ISPs純度高、雜質(zhì)少，并避免了后續(xù)分離純化，可直接進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定其分子量；

三、本發(fā)明使用苜蓿干草提取冰結(jié)構(gòu)蛋白，不需冷誘導(dǎo)，苜蓿草原料來(lái)源廣，方便易得，成本低，并且提取工藝簡(jiǎn)單可以在在冷凍食品中普遍應(yīng)用；

四、本發(fā)明采用磷酸緩沖液結(jié)合冰提法，通過(guò)嚴(yán)格料液比、磷酸緩沖液的pH、磷酸緩沖液的濃度和冰球添加量，能夠準(zhǔn)確控制并提高ISPs的提取率，適宜規(guī)模化生產(chǎn)；

五、本發(fā)明冰結(jié)構(gòu)蛋白的提取率為2.15％～4.26％。

具體實(shí)施方式：

本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意合理組合。

具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式從苜蓿中提取冰結(jié)構(gòu)蛋白的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、苜蓿干草處理

取苜蓿干草，并除掉苜蓿干草中的雜質(zhì)與灰塵，棄去草莖，保留苜蓿干草葉，粉碎后過(guò)80目篩備用；

二、冰球的制備

在硅膠冰格的每個(gè)冰孔位置放置直徑為1cm的玻璃球，向冰孔注蒸餾水，然后置于-18℃的冰箱中冷凍，得到直徑為2cm的冰球；

三、上清液制備

按料液比為1g:(5～30mL)將步驟一制備的苜蓿草粉與磷酸鹽緩沖溶液混合得到混合液，將得到的混合液置于室溫下，進(jìn)行攪拌提取0.5～3.0h，然后將提取后的混合液置于離心機(jī)中，在離心機(jī)中離心14～16min得到上清液；

四、將步驟二制備的冰球加入上清液中至最上層冰球的上表面與上清液液面相平，然后置于-18℃冰箱中，提取2～5min，此時(shí)冰球吸附ISPs達(dá)到飽和，濾出冰球，冰球融化后得到冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，濾出冰球后得到剩余的上清液；

五、冰結(jié)構(gòu)蛋白的復(fù)提

向剩余的上清液中加入步驟二制備的冰球，重復(fù)步驟四2～4次，收集每次提取得到的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，即完成。

本實(shí)施方式具備以下有益效果：

一、本實(shí)施方式方法中所冰球的直徑是2cm，圓形表面提高了接觸面積，提高了ISPs吸附量冰球內(nèi)凍結(jié)著一個(gè)直徑是1cm的玻璃球，當(dāng)冰球融化后，溶液體積減小，而ISPs的吸附量不變，增加了ISPs的濃度，還可以減少冰球的體積，節(jié)約成本及操作時(shí)間；

二、現(xiàn)有技術(shù)中ISPs一般采用粗提取、硫酸銨沉淀、離子交換色譜分離過(guò)程、凝膠過(guò)濾色譜分離過(guò)程和高效液相色譜的分離過(guò)程等五個(gè)步驟，方法繁瑣，非抗凍活性組分較多，雜質(zhì)多質(zhì)量差，尤其是硫酸銨沉淀，給后續(xù)的分離純化帶來(lái)很大困難；而本實(shí)施方式根據(jù)冰結(jié)構(gòu)蛋白與冰結(jié)合的特異性和不可逆性，將前二個(gè)步驟簡(jiǎn)化為冰提，粗分離出來(lái)的為具有抗凍組分的冰結(jié)構(gòu)蛋白，方法簡(jiǎn)便，且本實(shí)施方式提取得到的ISPs純度高、雜質(zhì)少，并避免了后續(xù)分離純化，可直接進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定其分子量；

三、本實(shí)施方式使用苜蓿干草提取冰結(jié)構(gòu)蛋白，不需冷誘導(dǎo)，苜蓿草原料來(lái)源廣，方便易得，成本低，并且提取工藝簡(jiǎn)單可以在在冷凍食品中普遍應(yīng)用；

四、本實(shí)施方式采用磷酸緩沖液結(jié)合冰提法，通過(guò)嚴(yán)格料液比、磷酸緩沖液的pH、磷酸緩沖液的濃度和冰球添加量，能夠準(zhǔn)確控制并提高ISPs的提取率，適宜規(guī)?；a(chǎn)；

五、本實(shí)施方式冰結(jié)構(gòu)蛋白的提取率為2.15％～4.26％。

具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟一所述苜蓿干草的含水率為1.3％。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。

具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是：步驟二所述硅膠冰格為耐溫為-40℃的硅膠冰格，硅膠冰格為板狀，長(zhǎng)為24cm，寬為7.3cm，板上設(shè)置有10×2個(gè)球形冰孔，每個(gè)冰孔的內(nèi)徑為2cm。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一或二相同。

具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟三所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為6.0～8.5，磷酸根濃度為10～70mmol/L。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一至三之一相同。

具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟三步驟三所述攪拌提取時(shí)采用磁力攪拌器，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為800～1000r/min。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一至四之一相同。

具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟三所述離心時(shí)離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為8000～10000r/min。其他步驟和參數(shù)與具體實(shí)施方式一至五之一相同。

為驗(yàn)證本發(fā)明的有益效果，進(jìn)行以下試驗(yàn)：

實(shí)施例1

本實(shí)施例從苜蓿中提取冰結(jié)構(gòu)蛋白的方法按以下步驟進(jìn)行：

一、苜蓿干草處理

取苜蓿干草，并除掉苜蓿干草中的雜質(zhì)與灰塵，棄去草莖，保留苜蓿干草葉，粉碎后過(guò)80目篩備用；所述苜蓿干草的含水率為1.3％；

二、冰球的制備

在硅膠冰格的每個(gè)冰孔位置放置直徑為1cm的玻璃球，向冰孔注水，然后置于-18℃的冰箱中冷凍，得到直徑為2cm的冰球；

所述硅膠冰格為耐溫為-40℃的硅膠冰格，硅膠冰格為板狀，長(zhǎng)為24cm，寬為7.3cm，板上設(shè)置有10×2個(gè)球形冰孔，每個(gè)冰孔的內(nèi)徑為2cm；

三、上清液制備

按料液比為1g:20mL將步驟一制備的苜蓿草粉與磷酸鹽緩沖溶液混合得到混合液，將得到的混合液置于室溫下，進(jìn)行攪拌提取2h，然后將提取后的混合液置于離心機(jī)中，在離心機(jī)中離心15min得到上清液；取1mL上清液用蒸餾水稀釋100倍后加入考馬斯亮藍(lán)測(cè)其吸光值(考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量)；

所述攪拌提取時(shí)采用磁力攪拌器，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為1000r/min；所述離心時(shí)離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為8000r/min；所述磷酸鹽緩沖溶液的pH為7.99，磷酸根濃度為61.06mmol/L；

四、將步驟二制備的冰球加入上清液中至最上層冰球的上表面與上清液液面相平，然后置于-18℃冰箱中，提取2min，此時(shí)冰球吸附ISPs達(dá)到飽和，濾出冰球，冰球融化后得到冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，濾出冰球后得到剩余的上清液；

五、冰結(jié)構(gòu)蛋白的復(fù)提

向剩余的上清液中加入步驟二制備的冰球，重復(fù)步驟四2次，收集每次提取得到的冰結(jié)構(gòu)蛋白溶液，即完成。

本實(shí)施例具備以下有益效果：

一、本實(shí)施例方法中所冰球的直徑是2cm，圓形表面提高了接觸面積，提高了ISPs吸附量冰球內(nèi)凍結(jié)著一個(gè)直徑是1cm的玻璃球，當(dāng)冰球融化后，溶液體積減小，而ISPs的吸附量不變，增加了ISPs的濃度，還可以減少冰球的體積，節(jié)約成本及操作時(shí)間；

二、現(xiàn)有技術(shù)中ISPs一般采用粗提取、硫酸銨沉淀、離子交換色譜分離過(guò)程、凝膠過(guò)濾色譜分離過(guò)程和高效液相色譜的分離過(guò)程等五個(gè)步驟，方法繁瑣，非抗凍活性組分較多，雜質(zhì)多質(zhì)量差，尤其是硫酸銨沉淀，給后續(xù)的分離純化帶來(lái)很大困難；而本實(shí)施例根據(jù)冰結(jié)構(gòu)蛋白與冰結(jié)合的特異性和不可逆性，將前二個(gè)步驟簡(jiǎn)化為冰提，粗分離出來(lái)的為具有抗凍組分的冰結(jié)構(gòu)蛋白，方法簡(jiǎn)便，且本發(fā)明提取得到的ISPs純度高、雜質(zhì)少，并避免了后續(xù)分離純化，可直接進(jìn)行SDS-PAGE測(cè)定其分子量；

三、本實(shí)施例使用苜蓿干草提取冰結(jié)構(gòu)蛋白，不需冷誘導(dǎo)，苜蓿草原料來(lái)源廣，方便易得，成本低，并且提取工藝簡(jiǎn)單可以在在冷凍食品中普遍應(yīng)用；

四、本實(shí)施例采用磷酸緩沖液結(jié)合冰提法，通過(guò)嚴(yán)格料液比、磷酸緩沖液的pH、磷酸緩沖液的濃度和冰球添加量，能夠準(zhǔn)確控制并提高ISPs的提取率，適宜規(guī)?；a(chǎn)；

五、采用差示掃描量熱法分析本實(shí)施例制備的苜蓿ISPs的熱滯活性(THA)，同時(shí)采用差示掃描量熱法分析標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)的熱滯活性(THA)作為對(duì)比，BSA的熱滯活性為0.00℃～0.01℃，幾乎無(wú)熱滯活性，而本實(shí)施例制備的苜蓿ISPs的熱滯活性(THA)分別為0.52～0.54，說(shuō)明本實(shí)施例制備的苜蓿ISPs的抗凍活性明顯強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)，且雜質(zhì)較少、純度較高；

六、對(duì)本實(shí)施例制備的苜蓿ISPs進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果如表1所示，苜蓿ISPs含有17種氨基酸，氨基酸總量為12.52％，通過(guò)計(jì)算可得知親水性氨基酸與疏水性氨基酸的比例為7:4，說(shuō)明苜蓿ISPs親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，苜蓿ISPs具有較強(qiáng)的親水性，與水分子親和力較強(qiáng)，進(jìn)而說(shuō)明本實(shí)施例方法的合理性，并且通過(guò)檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明本實(shí)施例制備的ISPs可直接用于冰結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸組成成分檢測(cè)。

七、對(duì)本實(shí)施例制備的苜蓿ISPs進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為，苜蓿ISPs的相對(duì)分子量約為52KD，主條帶清晰，在30KD到35KD處也有條帶，但不是很明顯；由此可以說(shuō)明，本實(shí)施例制備的苜蓿ISPs可直接用于分子量的檢測(cè)。

八、本實(shí)施例方法冰結(jié)構(gòu)蛋白的提取率可達(dá)到4.26％，提取率為：最終得到的冰結(jié)構(gòu)蛋白的質(zhì)量占原料中含有的多種蛋白質(zhì)的總質(zhì)量的百分比；

表1