本發(fā)明涉及微生物及發(fā)酵領(lǐng)域，具體的涉及一株高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢桿菌篩選方法。

背景技術(shù)：

豆粕因其較高的蛋白含量、平衡的氨基酸配比，被廣泛應(yīng)用于食品與飼料行業(yè)。而生大豆中含有大量的抗?fàn)I養(yǎng)因子，比如胰蛋白酶抑制因子、凝集素、抗原蛋白、植酸以及非淀粉多糖。其中主要的抗原蛋白為大球蛋白和β-伴球蛋白。經(jīng)過(guò)多年的研究及驗(yàn)證，微生物發(fā)酵對(duì)降解豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子以及改善養(yǎng)殖效果作用明顯。近期利用芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵豆粕被引入了亞洲及美國(guó)市場(chǎng)。

發(fā)酵菌株的篩選決定了產(chǎn)品的品質(zhì)及生產(chǎn)效率。由于能夠分泌高效的蛋白酶，芽孢桿菌成為常用的豆粕抗原蛋白降解菌株。目前，對(duì)于芽孢桿菌的篩選常規(guī)的方法為酪素蛋白平板法、纖溶蛋白平板法、脫脂乳平板法。不過(guò)這三種方法的篩選多用于篩選高產(chǎn)蛋白酶的菌株，而非用于篩選特異性降解豆粕抗原蛋白的菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)如何篩選高效降解豆粕抗原蛋白的益生型芽孢桿菌的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢桿菌篩選方法。

一種高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢桿菌篩選方法，包括如下步驟，從腌菜中篩選出的芽孢桿菌，點(diǎn)種于抗原蛋白篩選平板表面，培養(yǎng)24小時(shí)，根據(jù)抗原蛋白篩選平板的水解圈大小及菌株直徑比選擇用于豆粕抗原蛋白降解的菌株；所述的抗原蛋白篩選平板采用雙層培養(yǎng)基鋪板，上層培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，下層培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，其中下層培養(yǎng)基的制備過(guò)程主要采用等電點(diǎn)沉降法，從豆粕浸出液中沉降出抗原蛋白大球蛋白沉淀和β-伴球蛋白，溶于ddH2O得到抗原蛋白水溶液后，加入瓊脂后鋪板。

所述的下層培養(yǎng)基的制備過(guò)程具體如下：稱取5g豆粕，磨碎后過(guò)60目篩加入75mL pH 8.5的 Tris-HCl緩沖液，30~50℃ 200rpm 振蕩1h，9000g離心10~40 min，得到上清和沉淀，取沉淀再浸提一次，合并上清液，向上清液中加入0.01M Na₂SO₃，用2M HCl 調(diào)pH至6.4，4℃沉淀過(guò)夜，于6500 g，4℃，離心10~30 min，得到大球蛋白沉淀，沉淀后的上清液加NaCl至0.25M，調(diào)pH至4.0~6.0，室溫?cái)嚢?0 min； 9000g 4℃，離心30min，離心后的上清液稀釋2倍，調(diào)pH至4.8，6500g, 20min 離心得到β-伴球蛋白沉淀，將大球蛋白沉淀和β-伴球蛋白沉淀溶于ddH2O，調(diào)pH至5.5~6.5，得到抗原蛋白水溶液，加入1.5%（w/v）的瓊脂，115℃ 20min滅菌。

所述的上層培養(yǎng)基配方如下：牛肉膏 0.3%（w/v）， 葡萄糖3%（w/v）， 蛋白胨10%（w/v），NaCl 5%（w/v），加入1.5~1.8%（w/v）瓊脂，115℃滅菌20min。

所述的從腌菜中篩選出的芽孢桿菌的步驟如下：取1g生腌菜樣本，加入15mL 生理鹽水，水浴加熱至65℃，并孵育10min，孵育結(jié)束后，將樣本液體混勻，稀釋10倍，取50μＬ涂布于LB平板上，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，得到芽孢桿菌菌斑。

本發(fā)明的有益效果

相比較傳統(tǒng)的篩選方法酪素蛋白平板法、纖維蛋白平板法、脫脂乳平板法本方法以豆粕抗原蛋白為主要的篩選基質(zhì)。

在篩選基質(zhì)基礎(chǔ)上，相較于單層平板法，采用雙層平板法，能夠更直觀比較菌體分泌蛋白酶的能力及蛋白酶的活力。

通過(guò)比較菌落大小、蛋白層水解圈大小可以從菌株生長(zhǎng)水平、降解能力大小，綜合篩選需要的菌株。

該方法篩選的菌株相較于普通高產(chǎn)蛋白酶菌株，對(duì)豆粕抗原蛋白降解率更高。

附圖說(shuō)明

圖1是抗原蛋白平板篩選結(jié)果圖；

圖2是SDS-PAGE檢測(cè)所篩選菌株的抗原蛋白降解能力比較圖。

具體實(shí)施方式

一種芽孢桿菌篩選的方法：

取1g左右的生腌菜樣本，加入15mL 生理鹽水，水浴加熱至65℃，并孵育10min。孵育結(jié)束后，將樣本液體溫和混勻，稀釋10倍，取50μＬ涂布于LB平板上。37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，可見(jiàn)芽孢桿菌菌斑形成。

一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基平板制作方法：

培養(yǎng)基配方：牛肉膏 0.3%（w/v）， 葡萄糖3%（w/v）， 蛋白胨10%（w/v）， NaCl 5%（w/v），加入1.5~1.8%（w/v）瓊脂，115℃滅菌20mins。

一種抗原蛋白篩選培養(yǎng)基的制備方法：

稱取5g豆粕，磨碎后過(guò)60目篩加入75mL pH 8.5的 Tris-HCl緩沖液，30~50℃ 200rpm 振蕩1h，9000g離心10~40 min。得到上清和沉淀。取沉淀再浸提一次，合并兩次的上清液。向上清液中加入0.01M Na₂SO₃，用2M HCl 調(diào)pH至6.4，4℃沉淀過(guò)夜。于6500 g，4℃，離心10~30 min，得到大球蛋白沉淀。上清液加NaCl至0.25M，調(diào)pH至4.0~6.0，室溫?cái)嚢?0 min； 9000g4℃，離心30min，上清液稀釋2倍，調(diào)pH至4.8， 6500g, 20min 離心得到β-伴球蛋白沉淀。將所有沉淀溶于ddH2O，調(diào)pH至5.5~6.5。得到抗原蛋白水溶液。加入1.5%（w/v）的瓊脂，115℃20min滅菌。

一種抗原蛋白篩選平板的制備方法：

先在9mm滅菌培養(yǎng)皿中加入15mL的抗原蛋白培養(yǎng)基，待冷卻后，每塊篩選平皿加入15mL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，冷卻至凝固，待培養(yǎng)基表面無(wú)明顯水跡后，存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

一種篩選高效降解豆粕抗原蛋白芽孢桿菌的方法：

將從腌菜中篩選出的芽孢桿菌點(diǎn)種于抗原蛋白篩選平板表面，培養(yǎng)24小時(shí)后，若菌株對(duì)抗原蛋白有降解作用，即可見(jiàn)到水解圈。根據(jù)水解圈大小及菌株直徑比可以選擇合適的菌株用于豆粕抗原蛋白降解。

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。

儀器與試劑

9mL玻璃平皿，移液槍，滅菌鍋。試劑：生理鹽水（也可換用0.01M pH7.4的PBS），pH 8.5的 Tris-HCl緩沖液，0.01M Na₂SO₃溶液，2M HCl，雙蒸水，氯化鈉（分析純），營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基。

實(shí)施例1 高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢桿菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3的篩選

取1g左右的生腌菜樣本，加入15mL 生理鹽水，水浴加熱至65℃，并孵育10min。孵育結(jié)束后，將樣本液體溫和混勻，稀釋10倍，取50μＬ涂布于LB平板上。選取芽孢桿菌，經(jīng)三次劃線純化后，于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時(shí)。吸取1uL培養(yǎng)液點(diǎn)種于抗原蛋白篩選平板表面。24小時(shí)后即可得到結(jié)果圖1。

實(shí)施例2 芽孢桿菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3豆粕發(fā)酵驗(yàn)證

將篩選出的菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3分別在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，菌液OD達(dá)到1.0左右，按5%接種量接種入含水量50%的豆粕。37℃發(fā)酵24小時(shí)。以SDS-PAGE及ELISA試劑盒檢測(cè)發(fā)酵豆粕中大球蛋白及β-伴球蛋白含量，驗(yàn)證篩選效果如圖2、表1所示。

根據(jù)以上實(shí)施例1、2得到結(jié)果與討論：

1、高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢桿菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3的篩選

通過(guò)計(jì)算抗原蛋白平板上芽孢桿菌菌落直徑與水解圈直徑的比值，選擇比值大于4的菌株進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)驗(yàn)證。

、芽孢桿菌菌株ZJUAF-1、ZJUAF-2、ZJUAF-3豆粕發(fā)酵驗(yàn)證

由圖2所得，本方法篩選出的菌株發(fā)酵豆粕24小時(shí)后，泳道2、3、4分子量大于40kda的部分蛋白殘留較少，說(shuō)明抗原蛋白降解完全。而泳道1所示的普通商業(yè)菌株發(fā)酵豆粕，其在分子量為100、45部分仍留有蛋白殘留，說(shuō)明對(duì)抗原蛋白的降解不完全。如表1所示經(jīng)ELISA發(fā)酵豆粕樣品，所篩選出的菌株降解β-伴球蛋白及大豆球蛋白能力更強(qiáng)。所篩的菌株2016年8月8日 保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）， 北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1 號(hào)院3 號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)分別為 CGMCC NO:12823、CGMCC NO:12824、CGMCC NO: 12825，分類命名為Bacillus subtilis subsp.subtilis。