本發(fā)明涉及板栗殼中原花青素的提取工藝優(yōu)化方法及提取方法，屬于天然藥物中有效成分提取技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

板栗在我國有非常廣泛的種植，其產(chǎn)量位居世界第一，達(dá)到全世界板栗產(chǎn)量的60％以上。板栗殼是板栗加工中的廢棄物，隨著近年來板栗種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大和加工技術(shù)的不斷革新，對板栗的需求日益增加，導(dǎo)致大量板栗殼的隨意丟棄，其造成的環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重。因此通過深入研究和開發(fā)板栗殼這一廢棄資源，不但可以使其變廢為寶，還能極大的解決環(huán)境污染問題。

板栗殼中含有原花青素，通過了解得知原花青素具有很多生物學(xué)作用，比如：具有極強(qiáng)的抗氧化性，可以消除超氧陰離子自由基、羥基自由基等一系列自由基；參與磷酸代謝和蛋白質(zhì)磷酸化，防止脂質(zhì)氧化；能夠絡(luò)合金屬離子，在體內(nèi)形成惰性化合物；保護(hù)維生素C，防止其降解，利于維生素C在體內(nèi)的吸收和利用?，F(xiàn)已證實(shí)，原花青素具有抗心肌、調(diào)血脂、抗衰老、改善老年記憶力和保護(hù)皮膚等多種功能。綜上，開發(fā)出一種高效、簡單、低成本的板栗殼原青花素提取工藝具有十分重大的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有從板栗殼提取原青花素工藝中存在的效率不高、純度低等問題，提供一種相應(yīng)的提取工藝優(yōu)化方法及提取方法，本發(fā)明方法通過對不同提取因素的分析對比得出了最佳的提取條件，解決了板栗殼污染環(huán)境和資源浪費(fèi)的問題，并且開發(fā)了板栗的利用價(jià)值。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

板栗殼中原花青素的提取工藝優(yōu)化方法，包括以下步驟：(a)將板栗殼洗凈并干燥，粉碎過篩備用；(b)將板栗殼粉置于乙醇溶液中恒溫水浴振蕩提取，離心得粗提取液，分別考察提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度對粗提取液中原花青素含量的影響；(c)以上述四因素為自變量、原花青素得率為因變量繪制圖形，選出對原花青素提取工藝影響較大的因素和水平；(d)設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以原花青素的得率為指標(biāo)優(yōu)選出最佳的提取工藝。

按照上述方案，步驟(a)中板栗殼洗凈后置于40℃干燥至恒重，粉碎后過40-60目的篩網(wǎng)備用。

按照上述方案，步驟(b)中提取時(shí)間考察范圍為50-130min，提取溫度考察范圍為40-80℃，料液比考察范圍為1g板栗殼粉對應(yīng)10-35mL乙醇溶液，乙醇體積分?jǐn)?shù)考察范圍為40-80％，每考察一個因素時(shí)在對應(yīng)的范圍內(nèi)分散選擇至少4個點(diǎn)進(jìn)行單因素提取實(shí)驗(yàn)。

按照上述方案，步驟(d)所述三因素為提取時(shí)間、提取溫度和乙醇濃度，三水平分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)60％、70％、80％，提取溫度50℃、65℃、80℃，提取時(shí)間60min、90min、120min，通過步驟(c)確定的最佳料液比為1g:15mL，共計(jì)17次試驗(yàn)后進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定板栗殼提取原花青素較優(yōu)工藝參數(shù)為：體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液、提取時(shí)間90min、提取溫度65℃，料液比1g:15mL。

按照上述方案，測定粗提取液中原花青素含量包括首先采用硫酸-香草醛比色法繪制原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線，接著在500nm處用紫外可見分光光度計(jì)測出待測液的吸光度并與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比得出原花青素濃度。

上述方案中，硫酸-香草醛比色法具體為將清液、濃度為30g/L的香草醛-甲醇溶液(將3g香草醛溶于100ml的甲醇中)、體積分?jǐn)?shù)為30％的硫酸-甲醇溶液(將30ml的濃硫酸與70ml的甲醇混溶)按照1:5:5的體積比進(jìn)行混合，在25℃反應(yīng)20min。

本發(fā)明還提供一種板栗殼中原花青素的提取方法，包括以下步驟：首先將板栗殼洗凈并在40℃干燥，粉碎過20-100目篩網(wǎng)備用；接著將板栗殼粉按照1g：15mL的比例與體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液混合，在65℃恒溫水浴振蕩提取90min，離心得粗提取液；最后將粗提取液置于45-55℃減壓濃縮，冷凍干燥即得。

優(yōu)選的，板栗殼粉碎后過40-60目篩網(wǎng)，減壓濃縮溫度為50℃。

本發(fā)明具有以下有益效果：(1)工藝簡單易操作，有利于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，并且所選原料為廢棄物板栗殼，不僅解決了環(huán)境污染問題，而且開發(fā)了板栗的利用價(jià)值；(2)目前從植物中提取原花青素是最經(jīng)濟(jì)最可靠的途徑，本發(fā)明利用乙醇和水組成的混合液對板栗殼進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)原花青素在乙醇-水體系中的溶解度遠(yuǎn)大于在水中的溶解度，并且乙醇相比其他有機(jī)溶劑屬于比較干凈的能源，能夠降低對環(huán)境的污染；(3)干燥方法主要是真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥，不同干燥處理方法對原花青素聚合度有很大影響，本發(fā)明采用冷凍干燥，冷凍干燥樣品聚合度低于其他處理，而低聚合度原花青素抗氧化能力更強(qiáng)，此外冷凍干燥保留產(chǎn)品的生物和化學(xué)結(jié)構(gòu)及其活性的完整性；(4)本發(fā)明研究四個單因素對原花青素提取的影響，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果利用design expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化法，整個實(shí)驗(yàn)體系比較完善且可靠。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1不同乙醇濃度與原花青素得率的關(guān)系圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1不同料液比與原花青素得率的關(guān)系圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1不同提取溫度與原花青素得率的關(guān)系圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1不同提取時(shí)間與原花青素得率的關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

為使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員充分理解本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，以下結(jié)合附圖及具體實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的實(shí)施例僅僅用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明采用乙醇溶劑恒溫水浴振蕩提取板栗殼中的原花青素，分別考察了提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度及料液比四因素對原花青素提取效果影響，以原花青素的得率(mg/g)為指標(biāo)，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果來確定響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三因素三水平，最終優(yōu)選出最佳提取工藝為：體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液、提取時(shí)間90min、提取溫度65℃,料液比1g:15mL，該工藝原花青素得率>3％，純度>55％。本發(fā)明所用的板栗殼來源于河南信陽，其它試劑或原料皆為市售，響應(yīng)曲面法研究采用design expert軟件進(jìn)行。原花青素得率計(jì)算方法為：原花青素濃度乘以濾液稀釋倍數(shù)乘以濾液體積得出原花青素質(zhì)量，再除以板栗殼粉的質(zhì)量即為原花青素得率。

實(shí)施例1

1.板栗殼的預(yù)處理

將板栗殼洗凈并在40℃真空干燥至恒重，用高速粉碎機(jī)粉碎后過20-100目篩網(wǎng)備用。

2.不同乙醇濃度對原花青素提取效果的影響研究

稱取5份板栗殼粉，每份2.5g，分別采用體積分?jǐn)?shù)為40％、50％、60％、70％、80％的乙醇溶液按照料液比1g:15mL在60℃的條件下恒溫水浴振蕩提取95min后抽濾。取1mL濾液用水定容至10mL(濾液稀釋10倍)備用；其他濾液離心得粗提取液，將粗提取液置于45-55℃減壓濃縮，冷凍干燥稱重。

硫酸-香草醛比色法測定原花青素含量：原花青素與硫酸-香草醛發(fā)生顯色反應(yīng)，在紫外可見分光光度計(jì)500nm處有最大吸收峰，硫酸-香草醛比色法具體操作為：取定容后的濾液0.5mL為樣品，量取2.5mL濃度為3％的香草醛溶液(將3g香草醛溶于100ml的甲醇中)，量取2.5mL體積分?jǐn)?shù)為30％的硫酸溶液(將30ml的濃硫酸與70ml的甲醇混溶)，將量好的香草醛溶液和硫酸溶液混合均勻再加入樣品，搖勻，在25℃的條件下恒溫水浴振蕩反應(yīng)20min，500nm處測出原花青素的吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比得出原花青素濃度。

原花青素濃度乘以濾液稀釋倍數(shù)，再乘以濾液體積得出原花青素質(zhì)量，最后除以板栗殼粉的質(zhì)量即為原花青素得率。以原花青素得率為指標(biāo)，比較原花青素得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系，確定最佳乙醇提取劑體積分?jǐn)?shù)，結(jié)果如圖1所示。從圖中可知，隨著乙醇濃度增大，原花青素得率相應(yīng)增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70％時(shí)提取量最高；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70％時(shí)，原花青素得率有所下降。因此，確定提取原花青素最佳乙醇濃度選擇響應(yīng)面參考范圍為60-80％。

3.不同料液比對原花青素提取效果的影響研究

稱取5份板栗殼粉，每份2.5g，分別采用料液比為1g:10mL、1g:15mL、1g:20mL、1g:25mL，體積分?jǐn)?shù)為68％的乙醇溶液在60℃的條件下恒溫水浴振蕩提取95min后抽濾。取1ml濾液用水定容至10ml備用，其他濾液離心得粗提取液，將粗提取液置于45-55℃減壓濃縮，冷凍干燥稱重。

采用同樣的硫酸-香草醛比色法測定濾液中原花青素的含量，以原花青素得率為指標(biāo)，比較原花青素得率與料液比的關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。從圖中可知，原花青素得率隨著液料比的增大而增大，但液料比為1g∶25mL和1g∶20mL與液料比為1g∶15mL相比，原花青素的得率變化不大。為節(jié)省提取溶劑的用量、降低成本，最終選擇1g∶15mL的料液比最為經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

4.不同提取溫度對原花青素提取效果的影響研究

稱取5份板栗殼粉，每份2.5g，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃提取溫度下采用體積分?jǐn)?shù)為68％的乙醇溶液按照料液比為1g：15mL恒溫水浴振蕩提取95min后抽濾。取1ml濾液用水定容至10ml備用，其他濾液離心得粗提取液，將粗提取液置于45-55℃減壓濃縮，冷凍干燥稱重。

采用同樣的硫酸-香草醛比色法測定濾液中原花青素的含量，以原花青素得率為指標(biāo)，比較原花青素得率與溫度的關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。從圖中可知，溫度升高能加快分子的運(yùn)動速率，有利于提取溶劑進(jìn)入板栗殼的內(nèi)部，加快原花青素的溶出；但溫度太高，原花青素不穩(wěn)定，因此提取溫度不宜過高。綜合考慮最佳提取溫度選擇響應(yīng)面參考范圍50-80℃。

5.不同提取時(shí)間對原花青素提取效果的影響研究

稱取6份板栗殼粉，每份2.5g，分別采用體積分?jǐn)?shù)為68％的乙醇溶液按照料液比1g：15mL在60℃下恒溫水浴振蕩提取50min、65min、80min、95min、110min、130min。取1ml濾液用水定容至10ml備用，其他濾液離心得粗提取液，將粗提取液置于45-55℃減壓濃縮，冷凍干燥稱重。

采用同樣的硫酸-香草醛比色法測定濾液中原花青素的含量，以原花青素得率為指標(biāo)，比較原花青素得率與時(shí)間的關(guān)系，如圖4所示。從圖中可知，長時(shí)間加熱提取可能會導(dǎo)致原花青素不穩(wěn)定、得率下降。因此確定的最佳提取時(shí)間選擇響應(yīng)面參考范圍60-120min。

6.響應(yīng)面法優(yōu)化原花青素提取工藝

根據(jù)前四個單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)論可知，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度和提取時(shí)間3個因素每個因素3水平，利用design expert軟件根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，響應(yīng)曲面法研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間對原花青素提取率的影響。響應(yīng)面因素水平如表1。

表1響應(yīng)面因素水平及編碼

采用三因素三水平共17個試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。

表2響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

利用design expert軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的結(jié)果如圖3所示。

表3響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析表

由表3的結(jié)果可知：模型極顯著，失擬項(xiàng)P＝0.0573>0.05，不顯著，模型校正系數(shù)R2＝0.9742，說明該模型可以解釋97.42％的試驗(yàn)，方程的擬合度較高。模型校正系數(shù)RAdj2＝0.9411，說明該模型能解釋94.11％的響應(yīng)值變化；離散系數(shù)CV表示實(shí)驗(yàn)的精確度，CV值越低，實(shí)驗(yàn)的可靠性越高，本實(shí)驗(yàn)的CV＝4.62％，說明實(shí)驗(yàn)操作可信。信噪比為15.112，遠(yuǎn)大于4，說明該模型擬合度和可信度均較高。由此可見，此模型可用于板栗殼原花青素提取條件的分析和預(yù)測。利用design expert軟件，根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，得出最佳提取原花青素工藝為：體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液、提取時(shí)間90min、提取溫度65℃、料液比1g:15mL，采用該工藝原花青素得率>3％，純度＞55％。

實(shí)施例2

一種從板栗殼中提取原花青素的方法，具體步驟如下：首先準(zhǔn)確稱取2.5g板栗殼并洗凈，在40℃真空干燥至恒重，用高速粉碎機(jī)粉碎后過20-100目篩網(wǎng)備用。接著將板栗殼粉按照1g：15mL的比例與體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液混合，在65℃恒溫水浴振蕩提取90min，離心得粗提取液。最后將粗提取液置于45-55℃減壓濃縮，冷凍干燥即得。

實(shí)施例3

一種從板栗殼中提取原花青素的方法，具體步驟如下：首先準(zhǔn)確稱取2.5g板栗殼并洗凈，在40℃真空干燥至恒重，用高速粉碎機(jī)粉碎后過40-60目篩網(wǎng)備用。接著將板栗殼粉按照1g：15mL的比例與體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇溶液混合，在65℃恒溫水浴振蕩提取90min，離心得粗提取液。最后將粗提取液置于50℃減壓濃縮，冷凍干燥即得。