本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種Taq Plus聚合酶試劑盒及其使用方法。

背景技術(shù)：

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是體外合成雙鏈DNA的一種方法，技術(shù)基本原理是根據(jù)DNA雙螺旋模型所建立的細(xì)胞復(fù)制的機(jī)制，以及雙鏈DNA在體外復(fù)制的特點(diǎn)設(shè)計(jì)的。以DNA為模板，以小片段的DNA為引物，在DNA聚合酶的催化下將dNTPs合成為DNA新鏈。因此DNA聚合酶是實(shí)現(xiàn)DNA復(fù)制的關(guān)鍵。因此Taq DNA聚合酶廣泛應(yīng)用于PCR技術(shù)中，但是Taq DNA聚合酶缺乏校正功能，在PCR鏈的延伸反應(yīng)中常因?yàn)榘l(fā)生錯(cuò)配或因?yàn)镈NA模板高GC含量而終止,不能識(shí)別和切除不配對(duì)的DNA生長(zhǎng)鏈末端的核苷酸使延伸反應(yīng)繼續(xù)。擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度很難超過(guò)6kb,限制了PCR技術(shù)更為廣泛的應(yīng)用。人們又從古細(xì)菌分離出一種具有高保真性能的DNA聚合酶，其3’-5’外切酶校正活性能識(shí)別錯(cuò)誤摻入延伸鏈中的堿基，并將其切下，利用DNA聚合酶活性添加為與模板互補(bǔ)的堿基，從而保證了新擴(kuò)增鏈與模板的高度一致性。但是高保真聚合酶對(duì)引物和樣品的結(jié)構(gòu)、純度和濃度要求比較高，反應(yīng)靈敏度較低，擴(kuò)增效率較低，限制了Pfu DNA聚合酶的使用和推廣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種Taq Plus聚合酶試劑盒及其使用方法，具體技術(shù)方案如下：

一種Taq Plus聚合酶試劑盒，包括方盒，泡沫墊以及試劑瓶，其中，所述方盒內(nèi)置所述泡沫墊；所述泡沫墊上開(kāi)設(shè)有四個(gè)孔；所述試劑瓶分別為1號(hào)試劑瓶、2號(hào)試劑瓶、3號(hào)試劑瓶、4號(hào)試劑瓶，放置于所述四個(gè)孔內(nèi)；所述1號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放Taq Plus聚合酶，所述2號(hào)試劑瓶和3號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放緩沖液，所述4號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放增強(qiáng)劑溶液。

進(jìn)一步地，所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶為PCR反應(yīng)體系的復(fù)合酶，酶活比為1:1-4:3。

進(jìn)一步地，所述復(fù)合酶有5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切酶活性。

進(jìn)一步地，所述增強(qiáng)劑溶液為Enhancer溶液，所述所述2號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HP緩沖液，所述3號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HF緩沖液。

進(jìn)一步地，所述方盒為塑料方盒，所述試劑瓶均為透明試劑瓶。

進(jìn)一步地，所述四個(gè)試劑瓶具有瓶蓋，所述瓶蓋的顏色均不相同，且其上均設(shè)有圓形標(biāo)識(shí)。

進(jìn)一步地，所述塑料方盒的內(nèi)尺寸為150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，所述泡沫板尺寸為150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)。

上述Taq Plus聚合酶試劑盒的使用方法，包含如下步驟：

(1)準(zhǔn)備試劑盒復(fù)合酶；

(2)準(zhǔn)備試劑盒反應(yīng)液；

(3)設(shè)置長(zhǎng)片段擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系；

(4)設(shè)置復(fù)雜模板擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系；

(4)設(shè)置PCR反應(yīng)條件；

(5)1％瓊脂糖凝膠電泳。

進(jìn)一步地，包含如下步驟：

(1)準(zhǔn)備試劑盒復(fù)合酶：Taq DNA聚合酶(5U/μl)和高保真聚合酶(5U/μl)，酶活比為1:1-4:3；

(2)準(zhǔn)備試劑盒反應(yīng)液：10×HP緩沖液，10×HF溶液；

(3)長(zhǎng)片段擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：模板2μl，10×HP緩沖液5μl，dNTPs 1μL，復(fù)合酶1μL，上游、下游引物各2μL，加ddH2O至50μl；

(4)復(fù)雜模板擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：模板2μl，10×HF緩沖液5μl，dNTPs 1μL，復(fù)合酶1μL，上游、下游引物各2μL，加ddH2O至50μl；

(4)PCR反應(yīng)條件：92℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)92℃變性15s，58℃復(fù)性15s，68℃延伸2min，最后68℃延伸3min；

(5)1％瓊脂糖凝膠電泳。

進(jìn)一步地，步驟(2)中同時(shí)準(zhǔn)備Enhancer溶液，步驟(3)和(4)中，還根據(jù)需要加入Enhancer溶液，步驟(3)和(4)中，引物對(duì)包含上引物和下引物。

與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒操作簡(jiǎn)單，減少操作過(guò)程中污染的產(chǎn)生，同時(shí)試劑盒內(nèi)使用的試劑瓶都是透明的，瓶蓋的顏色都不一樣，瓶蓋上有圓形標(biāo)識(shí)，縮短了挑選試劑的時(shí)間，使用方便。具體來(lái)說(shuō)：

1、本發(fā)明獨(dú)創(chuàng)的復(fù)合酶使PCR具有擴(kuò)增長(zhǎng)度增加(簡(jiǎn)單模板可有效擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)45kb，對(duì)復(fù)雜模板也可達(dá)20kb)、且保真度好。

2、與單一的高保真聚合酶比較，具有擴(kuò)增速度快，反應(yīng)靈敏性和產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)

3、本試劑盒操作簡(jiǎn)單，減少操作過(guò)程中污染的產(chǎn)生。

4、試劑盒內(nèi)使用的試劑瓶都是透明的，瓶蓋的顏色都不一樣，瓶蓋上有圓形標(biāo)識(shí)，縮短了挑選試劑的時(shí)間，使用方便。

附圖說(shuō)明

圖1為T(mén)aq Plus聚合酶試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖

圖2為檢測(cè)條帶圖

具體實(shí)施方式

下面根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本發(fā)明多種實(shí)施方式中的一種優(yōu)選實(shí)施例。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，參見(jiàn)圖1，一種Taq Plus聚合酶試劑盒及其應(yīng)用，包括塑料方盒，所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶為PCR反應(yīng)體系的復(fù)合酶，酶活比為1:1-4:3。所述塑料方盒內(nèi)置大小合適的泡沫墊(5)，所述泡沫墊有四個(gè)孔，所述孔內(nèi)放置四個(gè)試劑瓶，分別為1號(hào)試劑瓶(1)、2號(hào)試劑瓶(2)、3號(hào)試劑瓶(3)、4號(hào)試劑瓶(4)，所述1號(hào)試劑瓶(1)內(nèi)盛放Taq Plus聚合酶，所述2號(hào)試劑瓶(2)內(nèi)盛放10×HP緩沖液，所述3號(hào)試劑瓶(3)內(nèi)盛放10×HF溶液，所述4號(hào)試劑瓶(4)內(nèi)盛放Enhancer溶液。

所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶為PCR反應(yīng)體系的復(fù)合酶，酶活比為1:1-4:3，所述2號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HP緩沖液，所述3號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HF緩沖液，所述增強(qiáng)劑溶液為Enhancer溶液，所述泡沫板尺寸為150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述塑料方盒的內(nèi)尺寸為150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述試劑盒內(nèi)使用的試劑瓶都是透明的，瓶蓋的顏色都不一樣，并且瓶蓋上有圓形標(biāo)識(shí)。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以采用如下方案：一種Taq Plus聚合酶試劑盒，其復(fù)合酶有5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切酶活性。與Taq DNA聚合酶相比，具有擴(kuò)增長(zhǎng)度增加(簡(jiǎn)單模板可有效擴(kuò)增長(zhǎng)達(dá)45kb，對(duì)復(fù)雜模板也可達(dá)20kb)、且保真度好；與單一的高保真聚合酶比較，具有擴(kuò)增速度快，反應(yīng)靈敏性和產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì)，解決現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。

一種Taq Plus聚合酶試劑盒及其應(yīng)用，包括塑料方盒，所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶為PCR反應(yīng)體系的復(fù)合酶，酶活比為1:1-4:3。所述塑料方盒內(nèi)置大小合適的泡沫墊，所述泡沫墊有四個(gè)孔，所述孔內(nèi)放置四個(gè)試劑瓶，分別為1號(hào)試劑瓶、2號(hào)試劑瓶、3號(hào)試劑瓶、4號(hào)試劑瓶，所述1號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放Taq DNA聚合酶，所述2號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HP緩沖液，所述3號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HF溶液，所述4號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放Enhancer溶液。

所述Taq Plus聚合酶是以Taq DNA聚合酶和高保真聚合酶為PCR反應(yīng)體系的復(fù)合酶，酶活比為1:1-4:3，所述2號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HP緩沖液，所述3號(hào)試劑瓶?jī)?nèi)盛放10×HF緩沖液，所述增強(qiáng)劑溶液為Enhancer溶液，所述塑料方盒的內(nèi)尺寸為150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述泡沫板尺寸為150mm(L)*30mm(W)*40mm(H)，但是不限于此，所述試劑盒內(nèi)使用的試劑瓶都是透明的，瓶蓋的顏色都不一樣，并且瓶蓋上有圓形標(biāo)識(shí)。本發(fā)明方法包含如下步驟：

(1)復(fù)合酶：Taq DNA聚合酶(5U/μl)和高保真聚合酶(5U/μl)，酶活比為1:1-4:3。

(2)反應(yīng)液：10×HP緩沖液，10×HF溶液，Enhancer溶液。

(3)長(zhǎng)片段擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：模板2μl，10×HP緩沖液5μl，dNTPs 1μL，復(fù)合酶1μL，上游、下游引物各2μL，Enhancer溶液5μl(根據(jù)個(gè)人需要加入)，加ddH2O至50μl。

(4)復(fù)雜模板擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系：模板2μl，10×HF緩沖液5μl，dNTPs 1μL，復(fù)合酶1μL，上游、下游引物各2μL，Enhancer溶液2.5μl(根據(jù)個(gè)人需要加入)，加ddH2O至50μl。

(4)PCR反應(yīng)條件：92℃預(yù)變性2min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)92℃變性15s，58℃復(fù)性15s，68℃延伸2min，最后68℃延伸3min。

(5)1％瓊脂糖凝膠電泳

本發(fā)明中，(3)、(4)步驟中引物對(duì)包含上引物和下引物，根據(jù)本試劑盒的具體應(yīng)用可進(jìn)行單獨(dú)設(shè)計(jì)合成。

下述實(shí)施案例中所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施案例：各種大片段復(fù)雜模板的擴(kuò)增。

1、PCR體系

*Optional

2、PCR條件

X*：predicted product length in kb.

3、1％瓊脂糖凝膠電泳：檢測(cè)條帶。

上面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)直接應(yīng)用于其它場(chǎng)合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。