本發(fā)明涉及病毒免疫領(lǐng)域，具體地，涉及具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

免疫佐劑又稱非特異性免疫增生劑。本身不具抗原性，但同抗原一起或預(yù)先注射到機體內(nèi)能增強免疫原性(見抗原)或改變免疫反應(yīng)類型。

免疫佐劑種類很多，目前尚無統(tǒng)一的分類方法，常用的佐劑可分為4類：無機佐劑，如氫氧化鋁，明礬等；有機佐劑，微生物及其產(chǎn)物如分枝桿菌(結(jié)核桿菌、卡介苗)、短小桿菌、百日咳桿菌、內(nèi)毒素、細(xì)菌提取物(胞壁酰二肽)等；合成佐劑，如人工合成的雙鏈多聚核苷酸(雙鏈多聚腺苷酸、尿苷酸)、左旋咪唑、異丙肌苷等；油劑，如費氏佐劑、花生油乳化佐劑、礦物油、植物油等。

佐劑的作用包括：(1)增加抗原的表面積，并改變抗原的活性基團(tuán)構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性；(2)佐劑與抗原混合能延長抗原在局部組織的存留時間，減低抗原的分解速度，使抗原緩慢釋放至淋巴系統(tǒng)中，持續(xù)刺激機體產(chǎn)生高滴度的抗體；(3)佐劑可以直接或間接激活免疫活性細(xì)胞并使之增生，從而增強了體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫功能；(4)良好的佐劑應(yīng)具有無毒性或副作用低的特點。

黏膜是機體防御外來入侵的第一道天然屏障，在機體的免疫中擔(dān)當(dāng)著重要任務(wù)。黏膜系統(tǒng)包括消化道系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等表面覆蓋的黏膜系統(tǒng)。許多傳染性疾病感染是主要發(fā)生在粘膜系統(tǒng)或是從粘膜表面開始入侵的。因此很多情況下，通過疫苗來誘導(dǎo)粘膜系統(tǒng)的保護(hù)性抗體是這些疾病的防治所必需的。然而，通過粘膜途徑給予可溶性抗原存在兩個問題：在粗糙的粘膜環(huán)境中如何保持抗原的完整性、如何增強抗原的免疫原性。因此需要專門的呈遞系統(tǒng)和佐劑。目前研究的比較多的佐劑有：CT/LT、內(nèi)源性分子(細(xì)胞因子、趨化因子等)、CpG、皂角苷等。細(xì)菌毒素及其衍生物作為粘膜佐劑——霍亂毒素和大腸桿菌不耐熱腸毒素霍亂毒素(Choleratoxin，CT)是由革蘭氏陰性細(xì)菌——霍亂弧菌(Vibriocholerae)分泌的一種蛋白，它是亞洲霍亂疾病中引起嚴(yán)重腹瀉的化學(xué)物質(zhì)。而大腸桿菌不耐熱腸毒素(LT)是由腸道毒素型E coli(ETEC)產(chǎn)生的。它們是目前研究得最多的粘膜免疫佐劑。

CT、LT及其衍生物的粘膜佐劑活性研究CT和LT都是很強的粘膜佐劑，當(dāng)它們和抗原連結(jié)在一起或者和抗原簡單混合后經(jīng)口或鼻內(nèi)免疫，能誘導(dǎo)有效的黏膜及系統(tǒng)免疫應(yīng)答。這種毒素蛋白的佐劑作用最早是由Clements等證明的，研究指出LT可以增加聯(lián)合免疫的抗原(OvA)的血清抗體反應(yīng)，增加幅度是比單獨用OVA及PBS對照組分別高30、90倍。研究發(fā)現(xiàn)，CT和LT能影響粘膜免疫反應(yīng)過程中的許多步驟。可能對這些步驟的影響各自或者協(xié)同的使CT和LT擁有了強大的佐劑活性。CT和LT產(chǎn)生的影響有：a.影響腸內(nèi)上皮細(xì)胞的通透性，使共同免疫的抗原能夠更好的被細(xì)胞所吸收；b.能夠促進(jìn)抗原被各種細(xì)胞吸收；c.促進(jìn)B細(xì)胞分化，使IgA的形成增加；d.復(fù)合物的刺激對T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生能起到刺激或者抑制的作用。但是由于CT和LT的毒性太強了，并不能直接用于人身上。因此，近年來有許多研究都嘗試把這些蛋白的佐劑作用和它們的毒性作用分開，希望能研究出沒有毒性的CT和LT作為人類粘膜免疫的佐劑。

CT是細(xì)菌蛋白毒素AB5家族的成員，具有兩個亞單位，CTA和CTB。5個CTB和1個CTA非共價結(jié)合成圓桶狀五聚體，能夠高親和力地與細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合，具有優(yōu)良的免疫原性。通常認(rèn)為CTA具有毒性，因而開發(fā)應(yīng)用較少，本發(fā)明建立CTA的部分氨基酸結(jié)合金黃色葡萄球菌的局部氨基酸的人工蛋白，具備無毒和良好免疫原性的CTA佐劑來源。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種生物學(xué)活性高的具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白及其應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個方面提供了一種具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白，具有：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列經(jīng)缺失、插入或替換所獲得的具有相同功能的氨基酸序列。

本發(fā)明的第二個方面是提供編碼所述具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的基因。優(yōu)選的，所述基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明的第三個方面是提供了所述具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的表達(dá)載體。優(yōu)選的，所述原核表達(dá)載體是將SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列與pET30a載體進(jìn)行連接所獲得的。

本發(fā)明的第四個方面是提供含有所述的具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白、其編碼基因或原核表達(dá)載體的宿主細(xì)胞?？蛇x的，所述宿主細(xì)胞可以為BL21(de3)大腸桿菌株。

本發(fā)明的第五個方面提供所述具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的純化方法，將經(jīng)過DNA分析和蛋白結(jié)構(gòu)分析確認(rèn)的蛋白序列對應(yīng)的DNA序列進(jìn)行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位點，以商品化質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建表達(dá)載體，所述蛋白序列如SEQ ID NO.1所示，所述DNA序列如SEQ ID NO.2所示，通過親和層析純化和蛋白復(fù)性，得到具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白。

本發(fā)明的具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的氨基酸序列中，其中來自霍亂弧菌毒素A亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其與金黃色葡萄球菌氨基酸序列通過GGGSGGGSGGGS連接；來自金黃色葡萄球菌的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中，有重復(fù)的兩個SEQ ID NO.4所示金黃色葡萄球菌的氨基酸序列，重復(fù)序列以GGGS進(jìn)行連接。

含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的生物制品屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的檢測試劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

含有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的疫苗佐劑屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白在制備疫苗佐劑或疫苗中的用途。

本發(fā)明提供了核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白在制備疫苗佐劑或疫苗中的用途。

本發(fā)明提供的上述具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白免疫原性好，特異性強，能夠有效通過粘膜進(jìn)入生物機體，并能使機體產(chǎn)生中和抗體，可作為免疫佐劑用于生物制品的制備，市場價值顯著。

附圖說明

圖1為本發(fā)明具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的Western Blot分析。

圖2為具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白與細(xì)胞表面的神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結(jié)合活性，從左到右依次是BSA，水，煮過的本發(fā)明蛋白，本發(fā)明蛋白。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

實施例1具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白蛋白的制備和純化

將經(jīng)過DNA分析和蛋白結(jié)構(gòu)分析確認(rèn)的蛋白序列對應(yīng)的DNA序列(SEQ ID NO.2所示)進(jìn)行合成，并引入Nde I和Xho I酶切位點，以商品化pET30a質(zhì)粒為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建pCTA，該表達(dá)載體表達(dá)的蛋白帶HIS標(biāo)簽于蛋白C端，有利于后期親和層析純化。

(一)大腸桿菌BL21DE3感受態(tài)細(xì)胞的制備

1.從37℃過夜培養(yǎng)的新鮮平皿中挑單個菌落，接種于3ml無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃240rpm振蕩培養(yǎng)4～5小時。

2.取上述培養(yǎng)物0.8ml加到200ml無抗生素的LB培養(yǎng)基中(置于1L三角瓶中)，37℃240rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.45左右。

3.將菌體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50ml的離心管中，冰浴上放置1.5小時。

4. 4℃環(huán)境下3000rpm離心10分鐘，棄去上清，回收細(xì)胞，將管倒置1分鐘以使殘留的培養(yǎng)液流盡。

5.以10ml用冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體沉淀，冰浴10分鐘。

6. 4℃環(huán)境下3000rpm離心10分鐘，棄去上清，將管倒置1分鐘以使殘留的CaCl2溶液流盡。

7.菌體沉淀用4ml 0.1mol/L CaCl2溶液重懸。

8.用冷卻的無菌吸頭向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入0.6ml滅過菌的甘油，輕柔混勻后分裝至無菌1.5ml離心管中，保存于－70℃超低溫冰箱。

(二)具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21DE3表達(dá)菌株

1.將50ng pCTA加入到100ul感受態(tài)細(xì)胞懸液中，輕輕混勻后在冰上放置30分鐘。

2. 42℃水浴90秒。

3.快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1～2分鐘。

4.向離心管中加入800ul不含任何抗生素的LB液體培養(yǎng)基，之后在37℃搖床上緩慢振蕩便于細(xì)菌復(fù)蘇。

5. 45分鐘后取適當(dāng)體積的菌液涂布到含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，用玻璃棒輕輕涂勻。

6.將平板置于室溫直至液體被完全吸收。

7.倒置平板，37℃培養(yǎng)12～16小時后可見到單菌落出現(xiàn)。

(三)具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的小量表達(dá)

1.用毛細(xì)管從轉(zhuǎn)化后37℃過夜培養(yǎng)的平皿上挑取單個菌落接種到1.5ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃240rpm振蕩培養(yǎng)4～5小時。

2.待菌液OD值達(dá)到約0.5時，每管留取菌液樣品100ul暫存于4℃，試管中加入終濃度1.0mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)1～2小時。

3.取1ml誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，10000rpm離心1分鐘，倒掉上清，用100ul去離子水重懸菌體沉淀后加入等量2×加樣緩沖液(0.1mol/L Tris·Cl，0.2mol/L 2–巰基乙醇，4﹪SDS，0.2﹪溴酚藍(lán)，20﹪甘油)，混勻。

4.于沸水中加熱3～5分鐘，取20ul樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用恒定電流40mA。

SDS－PAGE凝膠的配制過程如下：

4.1下層分離膠配方(15﹪)

4.2在分離膠上方輕輕加入一層異丙醇，分離膠凝固后棄除異丙醇并倒入濃縮膠

4.3上層濃縮膠配方(5﹪)

4.4最后插上梳子，等待濃縮膠凝固。

5.電泳約50分鐘后指示劑溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，此時停止電泳，小心地將凝膠從玻璃板上剝離，之后用0.25﹪考馬斯亮藍(lán)R250溶液(溶于甲醇︰去離子水︰冰乙酸＝4.5︰4.5︰1的混合液中)進(jìn)行染色。

6.染色30分鐘后倒掉染色液，清水稍微沖洗，加入脫色液脫色，脫色液配方為甲醇︰去離子水︰冰乙酸＝4.5︰4.5︰1。

7.脫色30～50分鐘可以觀察結(jié)果，挑選表達(dá)量高的克隆(得到BL21DE3CTA)準(zhǔn)備用留取的菌液樣品活化后進(jìn)行大量表達(dá)。

(四)具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的大量表達(dá)

1.將小量表達(dá)效果較好，表達(dá)量很高的菌株重新活化，接種于3ml含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃240rpm振蕩培養(yǎng)約3小時。

2.取上述活化的菌液300ul再次接種到300ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃240rpm振蕩培養(yǎng)過夜。

3.等比例加入預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃240rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右時，加入終濃度為0.8mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4～5小時。

4.收集菌液，4000rpm離心10分鐘，倒掉上清。

5.管底沉淀用50ml普通裂解液(0.05﹪Triton-X100，10mmol/L Tris·Cl，pH8.0)重懸，反復(fù)吹打直至混勻。

6.準(zhǔn)備冰浴，對重懸起的細(xì)菌沉淀進(jìn)行超聲波破碎(200W，超聲20秒，間歇20秒，作用20次)。

7. 4℃12000rpm離心10分鐘，分開上清和沉淀，保存于-20℃并分別進(jìn)行SDS-PAGE分析。

(五)具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的純化

具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的表達(dá)產(chǎn)物為包涵體，按一下方法純化：

(1)菌體用PBS或生理鹽水洗滌，用溶解液(Tris-base 50mM，EDTA 0.5mM，NaCl 50mM，甘油5％，DTT 5mM)重懸菌體，超聲波破碎至清亮；

(2)然后4℃，10000rpm離心10min，棄上清；

(3)用PBS或生理鹽水洗滌沉淀2-3次；

(4)往沉淀中加19.7mL溶解液及0.3mL 20％的SKL(十二烷基肌氨酸鈉)貯存液，劇烈攪動，使其緩慢溶解，室溫靜置30min至2h；

(5)4℃，10000rpm離心10min，取上清；

(6)加20％PEG 4000至終濃度為0.2％，加50mM的氧化型谷胱甘肽至終濃度為lmM，加100mM的還原型谷胱甘肽至終濃度為2mM，靜置30min至2h(亦可4℃復(fù)性過夜)；

(7)以PBS(pH 8.0)或TE(pH 8.0)4℃透析，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

純化后的蛋白進(jìn)行測序，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。其中來自霍亂弧菌毒素A亞基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其與金黃色葡萄球菌氨基酸序列通過GGGSGGGSGGGS連接；來自金黃色葡萄球菌的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在SEQ ID NO.1的氨基酸序列中，有重復(fù)的兩個SEQ ID NO.4所示金黃色葡萄球菌的氨基酸序列，重復(fù)序列以GGGS進(jìn)行連接。

(六)具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的Western blotting分析

將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白和對照進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，以兔抗CT血清作為第一抗體，以辣根過氧化物酶(HI沖)偶聯(lián)的羊抗兔IgG作為第二抗體，進(jìn)行Western blotting分析，一抗和二抗分別以1：1000和l：2000用封閉液(溶解于TBST溶液的5％脫脂奶粉)稀釋。結(jié)果見圖1,箭頭所指為能夠被兔抗識別的蛋白，確認(rèn)本發(fā)明融合蛋白的成功表達(dá)。

實施例2具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白蛋白的細(xì)胞膜靶向性

具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合活性分析，證明具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白具有良好的細(xì)胞膜靶向性。

用濃度為3ug/mL神經(jīng)節(jié)苷脂包被聚乙烯塑料板，同時以蒸餾水，其他融合蛋白和BSA作為對照，分別重復(fù)3孔，4℃包被過夜后棄包被物，用封閉液(溶解于PBS溶液的1％BSA)37℃封閉1h，棄盡包被物，PBS沖洗3次，加入純化的重組CTA(約50ng)，同時以1％BSA作為陰性對照，37℃孵育lh，PBS洗3次，加入兔抗CT血清(1：4000溶解于封閉液中)，37℃孵育lh，PBS洗滌3次，每次扣干，加入HRP標(biāo)記二抗(1：2000)，37℃孵育lh，PBS洗滌3次，每次扣干，然后加TMB底物顯色30min后加入終止液，測定450nm下吸光值。結(jié)果見圖2。

實施例3具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白的免疫效果

具有霍亂弧菌毒素A亞基和金黃色葡萄球菌特點的人工蛋白與埃博拉表面糖蛋白(GP)的動物滴鼻免疫方案，驗證在本發(fā)明蛋白的輔助下，可以通過滴鼻免疫的方式產(chǎn)生高滴度GP抗原特異性的中和抗體。

抗原佐劑配伍以及免疫劑量和程序如下：

1實驗材料石蟹猴：4雌2雄共6只

本發(fā)明蛋白(純度高于95％)

GP抗原(純度高于95％)

2免疫步驟

將石蟹猴隨機分組，保證每組內(nèi)為2雌1雄，分別編號為A1，A2，A3；B1，B2，B3。A組為實驗組，B組為對照組。

對A組實驗動物施以本發(fā)明蛋白+GP(1：1/m：m)混合液體滴鼻實驗，劑量為200ul，蛋白總量為0.1mg。對B組實驗動物施以本發(fā)明蛋白+PBS相同劑量的免疫。免疫時間分別為第1天，第15天。

對實驗動物每天進(jìn)行觀察，記錄。每周對猴子采血一次，分別為第一天(免疫前)，第8天。第14天(二次免疫前)，第21天。采血量為2ml，分別裝在2只采血管內(nèi)。

3中和抗體評價

獲得的猴子血清56℃滅活30分鐘，中和實驗步驟如下：

1.細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)Vero細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞數(shù)量足夠時，用0.25﹪胰酶消化所有細(xì)胞，接種到96孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，使用含有10﹪胎牛血清和1﹪抗生素的DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，保持每孔接種細(xì)胞數(shù)目約5～8×10³個，接種細(xì)胞時按照下述方法進(jìn)行計數(shù)：

吸取20ul細(xì)胞懸液，立即將細(xì)胞懸液移到血細(xì)胞計數(shù)板小室的邊緣，擠出細(xì)胞懸液，利用毛細(xì)作用使之充滿計數(shù)板和蓋玻片間的空隙，小室內(nèi)液體的體積以剛好流到計數(shù)板凹槽的邊緣為準(zhǔn)

細(xì)胞懸液的密度＝角上四個大方格的細(xì)胞數(shù)目之和×10⁴/4

2.培養(yǎng)兩天后細(xì)胞生長至96孔板底部的80﹪，移去細(xì)胞培養(yǎng)液，之后加入200ul無血清的生長培養(yǎng)基洗細(xì)胞面三次，倍比稀釋第21天采集的猴子血清，分別1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1024稀釋倍數(shù)進(jìn)行微量中和試驗，用第一天采集的血清作為對照組。

3.取500ul各個稀釋度的猴子血清與攻擊用的埃博拉病毒液(6.5TCID50/ml)等量混合后中和1小時，將混合液接種到十孔Vero指示細(xì)胞，每孔100ul，同時做正常細(xì)胞空白對照，4小時后棄去病毒血清混合液并更換成含有5﹪胎牛血清的DMEM作為維持培養(yǎng)液，培養(yǎng)三天后通過顯微鏡觀察呈現(xiàn)細(xì)胞病變的孔數(shù)和未病變的孔數(shù)。

表1第21天血清的體外中和實驗○未病變●病變

結(jié)果表明第21天的猴子血清含有中和抗體，提示本發(fā)明蛋白可用于粘膜佐劑。

以上結(jié)合附圖詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。