本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其是涉及一種靶向性超順磁性納米探針的制備方法和應用方法。

背景技術：

磁性納米粒子是一種具有磁響應性的納米材料，利用其良好的生物相容性、特異性和磁各異相性等優(yōu)點，通過表面修飾可以制備出功能多樣化的磁性納米探針，因而可以廣泛應用于生物分離和醫(yī)學檢測等領域，而現(xiàn)如今，其在磁成像、磁熱療、細菌分離、藥物遞送等方向均取得顯著的成果。廣泛開展磁性納米材料在生物醫(yī)學和臨床檢測等方面的研發(fā)和應用已經(jīng)成為當前的研究熱點。

傳統(tǒng)的靶向性磁性納米探針常常以水熱法、物理氣相沉積法等制備的磁性納米粒子作為載體，制備過程雖簡單、成本較低，但所得到的磁性納米粒子往往粒徑分布不均一、水溶性較差、極易團聚，使后期表面修飾帶來一定的困難；另外，傳統(tǒng)的磁性納米粒子往往直徑在50～200nm之間，屬于鐵磁性或亞鐵磁性納米粒子，對外加磁場反應過強，捕獲有目的細胞后用于收集時，可由于外加強磁場的作用出現(xiàn)細胞變形、甚至破碎等問題，大大的影響了目的細胞的分選率和靈敏度，為后期的醫(yī)學應用造成困難。

隨著科學技術的發(fā)展和臨床的實際應用，人們對磁性納米材料的要求越來越高，目前使用的磁性納米粒子已經(jīng)不能滿足人們的需要。主要原因是其制備工藝和表面修飾效果不理想，主要表現(xiàn)為：顆粒較大、分散性差、磁各異相性弱、粒徑分布不均一、表面修飾不穩(wěn)定等問題，使其在后期生物檢測與分離等應用中出現(xiàn)靈敏度不高、靶向性不好等結(jié)果，為后期的動物實驗和臨床應用帶來眾多困擾。

該發(fā)明中我們通過高溫熱分解法在油相中制備粒徑約15nm的四氧化三鐵納米顆粒，并通過雙親性聚合物實現(xiàn)磁性納米粒子的水相轉(zhuǎn)化，再在EDC/NHS的偶聯(lián)作用下共價偶聯(lián)靶分子，從而研制出一種新型的具有靶向性的超順磁性納米探針。利用該探針捕獲目的細胞，使其能在外加磁場作用下獲得血液中目的細胞的特異性分離。該探針與以往使用的探針相比，具有粒徑分布均一、穩(wěn)定性高、不易團聚、pH值及高鹽耐受力強、T2弛豫率高等優(yōu)點，可以靈敏的捕獲并分離出目的分子。

技術實現(xiàn)要素：

為了改善磁性納米探針在生物醫(yī)療中的應用，充分發(fā)揮其特性，本發(fā)明公開了一種可以高效分離目的細胞的超順磁性納米探針的制備方法。具體為：一種靶向性超順磁性納米探針的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、通過高溫熱分解法在油相中制備粒徑10-20nm的四氧化三鐵納米顆粒；

步驟二、雙親性聚合物的合成；

步驟三、通過步驟二得到的雙親性聚合物實現(xiàn)步驟一得到的四氧化三鐵納米顆粒的水相轉(zhuǎn)化，得到水溶性超順磁性納米粒子；

步驟四、在EDC/NHS的偶聯(lián)作用下使得步驟三得到的水溶性超順磁性納米粒子共價偶聯(lián)靶分子，得到靶向性超順磁性納米探針。

(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(簡稱EDC)；N-羥基硫代琥珀酰亞胺(簡稱NHS)。EDC/NHS表示EDC和NHS。進一步地，步驟四中EDC和NHS的摩爾比是1:3。

進一步地，步驟一中制備四氧化三鐵納米顆粒的反應物包括鐵前驅(qū)體、十六烷二醇、油胺、油酸和反應溶劑；反應溶劑包括二苯醚、二芐醚、十八烯和二辛醚中的一種或者多種。

進一步地，步驟一中鐵前驅(qū)體、十六烷二醇、油胺、油酸的摩爾比是(1～3):(3～10):(2～8):(2～8)；反應溶劑的用量是1～3mmol的鐵前驅(qū)體對應10～20mL的反應溶劑。

進一步地，鐵前驅(qū)體包括氯化亞鐵、乙酰丙酮鐵、氯化鐵和氧化鐵中的一種或者多種。

進一步地，步驟一具體為：按比例取鐵前驅(qū)體、十六烷二醇、油胺、油酸及反應溶劑混合，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物加熱至200℃，并保溫2～4h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保溫1～3h，之后停止保溫使其反應終止，得到產(chǎn)物一；將產(chǎn)物一冷卻后加入無水乙醇，離心，取沉淀，得到產(chǎn)物二；將產(chǎn)物二重懸于氯仿中，加入用無水乙醇再次離心，取沉淀，得到反應種子；將反應種子分散于氯仿中保存；

再次按比例取鐵前驅(qū)體、十六烷二醇、油胺、油酸及反應溶劑混合，并加入反應種子，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物加熱至200℃，并保溫2～4h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保溫1～3h，之后停止保溫使其反應終止，得到產(chǎn)物三；將產(chǎn)物三冷卻后加入無水乙醇洗滌，離心，取沉淀，得到四氧化三鐵納米顆粒，并將其分散于氯仿中保存。

進一步地，反應種子與反應溶劑的用量關系是：10～20mL的反應溶劑對應于20～60mg反應種子。

進一步地，20～60mg反應種子分散在2mL氯仿中。

進一步地，步驟一中的加熱均采用加熱套加熱。

進一步地，步驟二中雙親性聚合物的合成具體是：

取聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和十二胺，并加入四氫呋喃溶液，超聲20～60s后，加熱至60～70℃，保溫并持續(xù)攪拌2～6h，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉一半溶劑，再繼續(xù)加熱攪拌過夜，次日，將剩余溶液蒸發(fā)掉后，所得淡黃色固體，即雙親性聚合物，將雙親性聚合物溶解在氯仿中；聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和十二胺的摩爾比是(10～30):(5～25)；四氫呋喃溶液與聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)的用量關系是10～30mmol聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)對應于50～200mL四氫呋喃溶液。該淡黃色固體是一種雙親性聚合物。發(fā)明人將該淡黃色固體命名為雙親性聚合物PMA。

進一步地，步驟三具體為：將步驟一得到的四氧化三鐵納米顆粒與步驟二得到的雙親性聚合物按照比表面積1:(100～600)混合，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所有溶劑全部揮發(fā)，所剩黑色固體重新溶解在SBB 12緩沖溶液中，并利用超濾管離心濃縮至2～5mL的蒸餾水或者去離子水中，然后用超速離心機離心去上清從而去除多余聚合物，得到水溶性超順磁性納米粒子，將水溶性超順磁性納米粒子溶解在蒸餾水或者去離子水中備用。SBB 12緩沖溶液即50mM硼酸溶液利用NaOH調(diào)至pH值為12。

進一步地，步驟四具體為：將步驟三得到的水溶性超順磁性納米粒子與靶分子按照摩爾比1:(10～20)混合后，加入EDC/NHS溶液進行共價偶聯(lián)，混合物于室溫反應過夜，次日利用超濾管離心去除混合物中的EDC和未偶聯(lián)的靶分子，所得產(chǎn)物即為靶向性超順磁性納米探針。

進一步地，靶分子包括核酸、抗體、葉酸、多肽中的一種或者多種。

本發(fā)明還提供一種如上所述的靶向性超順磁性納米探針的制備方法獲得的靶向性超順磁性納米探針的應用方法。該應用方法是取靶向性超順磁性納米探針與含有目的細胞的血液混合孵育10～30min，然后加入到含有磁珠的分選柱中，含有磁珠的分選柱位于外加磁場中；向含有磁珠的分選柱中加入生理鹽水，捕獲有目的細胞的靶向性超順磁性納米探針吸附在含有磁珠的分選柱中，而未被捕獲的細胞則隨著生理鹽水流出；去掉外加磁場后，捕獲有目的細胞的靶向性超順磁性納米探針隨著加入的生理鹽水從含有磁珠的分選柱中洗脫下來，達到分離目的細胞的作用。

進一步地，目的細胞包括癌細胞、白細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和干細胞中的一種或者多種。

本發(fā)明中所制備的磁性納米粒子(即步驟一中的四氧化三鐵納米顆粒)直徑約15nm，屬于超順磁性納米材料，其分散在氯仿中，稱為單分散的超順磁性納米粒子。當存在有外加磁場的作用下，穩(wěn)定存在于水相中的磁性納米粒子可以被牽引到磁場方向；而當去掉外加磁場后，納米粒子可再次穩(wěn)定存在于水相溶液中。因此，由該超順磁性納米材料制備的磁性納米探針(即靶向性超順磁性納米探針)，在捕獲有目的細胞后，通過分選柱和外加磁場的作用，可以有效的吸附于分選柱中，而去除掉外加磁場后，隨著緩沖液的流動使得目的產(chǎn)物穩(wěn)定存在于溶液中。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下特點：

1.制得的單分散的超順磁性納米粒子，粒徑分布均勻(～15nm)、穩(wěn)定性好、T2弛豫率高(約250mM^-1s^-1)。

2.雙親性聚合物包被的超順磁性納米粒子，即本發(fā)明中的水溶性超順磁性納米粒子在去離子水中可室溫保存一年，在pH5.0～12情況下均可穩(wěn)定保存兩個月以上，而在100mM的NaCl溶液下可穩(wěn)定保存一個月以上。因此，水溶性超順磁性納米粒子可以適應較大范圍的pH值變化和耐鹽度高，在復雜的血液等體系中也能保持較高的穩(wěn)定性。

3.靶向性超順磁性納米探針中的納米材料表面本身含有大量羧基，使得穩(wěn)定性更好，同時大量羧基可以偶聯(lián)很多葉酸，保證了單個粒子上的葉酸含量較高，使得靶向性好，細胞捕獲率提高。因此，本發(fā)明所涉及的靶向性超順磁性納米探針的穩(wěn)定性好、靶向性好、細胞捕獲率高。

4.在外加磁場作用下，捕獲有目的細胞的靶向性超順磁性納米探針可牢固的吸附于分選柱中；而除去外加磁場后，又容易被洗脫。

附圖說明

圖1是單分散的超順磁性納米粒子的透射電鏡圖片。

圖2是單分散的超順磁性納米粒子的高分辨透射電鏡圖片。

圖3是靶向性超順磁性納米探針的瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4是單分散的靶向性超順磁性納米探針的磁滯曲線。

圖5是靶向性超順磁性納米探針捕獲與分離目的細胞的流程圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖與具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。

實施例1

(1)為制得單分散的超順磁性納米粒子，秤取2mmol的氯化鐵、10mmol的十六烷二醇、6mmol的油胺、6mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度2h，之后將加熱套移開使其反應終止。將所得黑色液體(即產(chǎn)物一)冷卻至室溫后加入10～30mL的無水乙醇并離心沉淀(離心條件：2000rpm，10min)，所得黑色沉淀(即產(chǎn)物二)重懸于氯仿中，利用無水乙醇再次離心沉淀后，所得樣品分散于氯仿中保存。

利用該樣品(即所得單分散的超順磁性納米粒子)作為反應種子，根據(jù)種子生長法可獲得較大尺寸的超順磁性納米粒子。具體步驟為：秤取2mmol的氯化鐵、10mmol的十六烷二醇、8mmol的油胺、8mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，并加入上述所得的60mg分散于2mL氯仿中的反應種子，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度1h，之后將加熱套移開使其反應終止，得到產(chǎn)物三。將產(chǎn)物三冷卻至室溫后按照上述步驟清洗，并分散在氯仿中，得到直徑約15nm的四氧化三鐵納米顆粒，也稱為超順磁性納米粒子。

圖1為制備所得超順磁性納米粒子的透射電鏡圖，由圖中可知，納米粒子分散性好，粒徑均一，且直徑約15nm。圖2為單個超順磁性粒子的高分辨透射電鏡圖。

(2)雙親性聚合物PMA的合成步驟具體如下：稱取30mmol聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和25mmol十二胺于250mL的圓底燒瓶中，加入50mL四氫呋喃溶液，超聲60s后，加熱至65℃并持續(xù)攪拌3h，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉一半溶劑，再繼續(xù)加熱攪拌過夜，次日，將剩余溶液蒸發(fā)掉后，所得淡黃色固體，即雙親性聚合物PMA。將雙親性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即為0.5M的雙親性聚合物PMA。

(3)將步驟(1)所得單分散的超順磁性納米粒子與步驟(2)所得的雙親性聚合物按照比表面積1:600混合于100mL的圓底燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶內(nèi)所有溶劑全部揮發(fā)，所剩黑色固體重新溶解在20mL的SBB 12緩沖溶液中，并利用超濾管離心濃縮至5mL的蒸餾水中(離心條件：4000rpm，10min)，然后利用超速離心機(20,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超順磁性納米粒子，將水溶性超順磁性納米粒子溶解在蒸餾水中備用。水溶性超順磁性納米粒子是包被了雙親性聚合物的超順磁性納米粒子。

(4)將步驟(3)所得的水溶性超順磁性納米粒子與抗體按照摩爾比1:20混合后，加入0.5mL的EDC/NHS溶液(摩爾比1:3)進行共價偶聯(lián)，混合物于室溫反應過夜，次日利用超濾管去除混合物中的EDC和未偶聯(lián)的抗體(離心條件：3000rpm，20min)，所得產(chǎn)物即為具有靶向性超順磁性納米探針。隨后將其放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

圖3為靶向性超順磁性納米探針的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，左邊條帶為常用標準對照Au NPs(4nm)；中間條帶為水溶性超順磁性納米粒子，即包被后的超順磁性納米粒子；右邊條帶為靶向性超順磁性納米探針，即共價偶聯(lián)靶分子后的超順磁性納米探針。從該圖中可以看出，納米粒子經(jīng)過靶分子修飾后體積變大，瓊脂糖凝膠中運動緩慢，由此可知，靶分子成功修飾于磁性納米材料表面。

圖4為靶向性超順磁性納米探針的磁滯回歸曲線?？v坐標為磁化強度(M)，橫坐標為磁場強度(H)。從圖中可知，在室溫下，該探針在交變磁場中未出現(xiàn)磁滯現(xiàn)象，且飽和磁化強度為70emu/g，說明制備的探針為超順磁性納米探針。

(5)取5mL步驟(4)制得的探針與5mL含有胃癌細胞的血液混合孵育30min，將混合液緩慢加入到固定有外加磁場的含有磁珠的分選柱中(進樣速度：1mL/min)，捕獲有胃癌細胞的靶向性超順磁性納米探針便吸附在分選柱中，而未被捕獲的其他細胞則隨著加入的生理鹽水緩慢流出(流速：10mL/min)；磁性吸附于分選柱中的捕獲有胃癌細胞的靶向性超順磁性納米探針，在去掉外加磁場后，可隨著生理鹽水流出，從而收集到捕獲有胃癌細胞的靶向性超順磁性納米探針，達到分離、分選目的細胞的目的。

圖5為靶向性超順磁性納米探針捕獲與分離目的細胞的流程圖。由圖中所示，當探針捕獲目的細胞后，在外加磁場作用下，可被帶有磁珠的分選柱吸附在柱內(nèi)，從而使其達到目的細胞與其他細胞的分離；當去掉外加磁場后，加入的生理鹽水可以清洗并收集吸附的目的細胞，達到實驗目的。

實施例2

(1)為制得單分散的超順磁性納米粒子，秤取1mmol的乙酰丙酮鐵、5mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的二芐醚混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱3h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度1h，之后將加熱套移開使其反應終止。將所得黑色液體(即產(chǎn)物一)冷卻至室溫后加入10mL的無水乙醇并離心沉淀(離心條件：2000rpm，10min)，所得黑色沉淀(即產(chǎn)物二)重懸于氯仿中，利用無水乙醇再次離心沉淀后，所得樣品分散于氯仿中保存。

利用該樣品(即所得單分散的超順磁性納米粒子)作為反應種子，根據(jù)種子生長法可獲得較大尺寸的超順磁性納米粒子。具體步驟為：秤取1mmol的乙酰丙酮鐵、5mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的二芐醚混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，并加入上述所得的20mg分散于2mL氯仿中的反應種子，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度1h，之后將加熱套移開使其反應終止，得到產(chǎn)物三。將產(chǎn)物三冷卻至室溫后按照上述步驟清洗，并分散在氯仿中，得到直徑約15nm的四氧化三鐵納米顆粒，也稱為超順磁性納米粒子。

(2)雙親性聚合物PMA的合成步驟具體如下：稱取10mmol聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和5mmol十二胺于250mL的圓底燒瓶中，加入50mL四氫呋喃溶液，超聲30s后，加熱至60℃并持續(xù)攪拌6h，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉一半溶劑，再繼續(xù)加熱攪拌過夜，次日，將剩余溶液蒸發(fā)掉后，所得淡黃色固體，即雙親性聚合物PMA。將雙親性聚合物PMA溶解在20mL的氯仿中，即為0.1M的雙親性聚合物PMA。

(3)將步驟(1)所得單分散的超順磁性納米粒子與步驟(2)所得的雙親性聚合物按照比表面積1:100混合于100mL的圓底燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶內(nèi)所有溶劑全部揮發(fā)，所剩黑色固體重新溶解在20mL的SBB 12緩沖溶液中，并利用超濾管離心濃縮至5mL的蒸餾水中(離心條件：3000rpm，10min)，然后利用超速離心機(20,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超順磁性納米粒子，將水溶性超順磁性納米粒子溶解在蒸餾水中備用。水溶性超順磁性納米粒子是包被了聚合物的超順磁性納米粒子。

(4)將步驟(3)所得聚合物包被的水溶性超順磁性納米粒子與多肽分子按照摩爾比1:10混合后，加入1mL的EDC/NHS溶液(摩爾比1:3)進行共價偶聯(lián)，混合物于室溫反應過夜，次日利用超濾管去除混合物中的EDC和未偶聯(lián)的多肽分子(離心條件：3000rpm，20min)，所得產(chǎn)物即為具有靶向性超順磁性納米探針。隨后將其放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)取3mL步驟(4)制得的探針與3mL含有CIK細胞的血液混合孵育15min，將混合液緩慢加入到固定有外加磁場的含有磁珠的分選柱中(進樣速度：1mL/min)，捕獲有CIK細胞的靶向性超順磁性納米探針便吸附在分選柱中，而未被捕獲的其他細胞則隨著加入的生理鹽水緩慢流出(流速：1mL/min)；磁性吸附于分選柱中的捕獲有目的細胞的靶向性超順磁性納米探針，在去掉外加磁場后，可隨著生理鹽水流出，從而收集到捕獲有目的細胞的靶向性超順磁性納米探針，達到分離、分選目的細胞的目的。

實施例3

(1)為制得單分散的超順磁性納米粒子，秤取2mmol的氧化鐵、8mmol的十六烷二醇、2mmol的油胺、2mmol的油酸及15mL的二苯醚混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度2h，之后將加熱套移開使其反應終止。將所得黑色液體(即產(chǎn)物一)冷卻至室溫后加入30mL的無水乙醇并離心沉淀(離心條件：4000rpm,10min)，所得黑色沉淀(即產(chǎn)物二)重懸于氯仿中，利用無水乙醇再次離心沉淀后，所得樣品分散于氯仿中保存。

利用該樣品(即所得單分散的超順磁性納米粒子)作為反應種子，根據(jù)種子生長法可獲得較大尺寸的超順磁性納米粒子。具體步驟為：秤取2mmol的鐵前驅(qū)體、8mmol的十六烷二醇、2mmol的油胺、2mmol的油酸及15mL的反應溶劑混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，并加入上述所得的20mg分散于2mL氯仿中的反應種子，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度2h，之后將加熱套移開使其反應終止，得到產(chǎn)物三。將產(chǎn)物三冷卻至室溫后按照上述步驟清洗，并分散在氯仿中，得到直徑約15nm的四氧化三鐵納米顆粒，也稱為超順磁性納米粒子。

(2)雙親性聚合物PMA的合成步驟具體如下：稱取20mmol聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和20mmol十二胺于250mL的圓底燒瓶中，加入200mL四氫呋喃溶液，超聲60s后，加熱至70℃并持續(xù)攪拌3h，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉一半溶劑，再繼續(xù)加熱攪拌過夜，次日，將剩余溶液蒸發(fā)掉后，所得淡黃色固體，即雙親性聚合物PMA。將雙親性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即為0.4M的雙親性聚合物PMA。

(3)將步驟(1)所得單分散的超順磁性納米粒子與步驟(2)所得的雙親性聚合物按照比表面積1:600混合于100mL的圓底燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶內(nèi)所有溶劑全部揮發(fā)，所剩黑色固體重新溶解在20mL的SBB 12緩沖溶液中，并利用超濾管離心濃縮至5mL的蒸餾水中(離心條件：3000rpm，10min)，然后利用超速離心機(20,000rpm，0.5h)去除多余的聚合物，得到水溶性超順磁性納米粒子，將水溶性超順磁性納米粒子溶解在蒸餾水中備用。水溶性超順磁性納米粒子是包被了聚合物的超順磁性納米粒子。

(4)將步驟(3)所得聚合物包被的水溶性超順磁性納米粒子與葉酸按照摩爾比1:10混合后，加入2mL的EDC/NHS溶液(摩爾比1:3)進行共價偶聯(lián)，混合物于室溫反應過夜，次日利用超濾管去除混合物中的EDC和未偶聯(lián)的葉酸分子(離心條件：2000rpm，10min)，所得產(chǎn)物即為具有靶向性超順磁性納米探針。隨后將其放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)取3mL步驟(4)制得的探針與3mL含有肺癌細胞的血液混合孵育20min，將混合液緩慢加入到固定有外加磁場的含有磁珠的分選柱中(進樣速度：5mL/min)，捕獲有肺癌細胞的靶向性超順磁性納米探針便吸附在分選柱中，而未被捕獲的其他細胞則隨著加入的生理鹽水緩慢流出(流速：5mL/min)；磁性吸附于分選柱中的捕獲有肺癌細胞的靶向性超順磁性納米探針，在去掉外加磁場后，可隨著生理鹽水流出，從而收集到捕獲有肺癌細胞的靶向性超順磁性納米探針，達到分離、分選目的細胞的目的。

實施例4

(1)為制得單分散的超順磁性納米粒子，秤取1mmol的氯化亞鐵、6mmol的十六烷二醇、6mmol的油胺、6mmol的油酸及20mL的二辛醚混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度2h，之后將加熱套移開使其反應終止。將所得黑色液體(即產(chǎn)物一)冷卻至室溫后加入25mL的無水乙醇并離心沉淀(離心條件：3000rpm，10min)，所得黑色沉淀(即產(chǎn)物二)重懸于氯仿中，利用無水乙醇再次離心沉淀后，所得樣品分散于氯仿中保存。

利用該樣品(即所得單分散的超順磁性納米粒子)作為反應種子，根據(jù)種子生長法可獲得較大尺寸的超順磁性納米粒子。具體步驟為：秤取2mmol的氯化亞鐵、6mmol的十六烷二醇、6mmol的油胺、6mmol的油酸及20mL的二辛醚混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，并加入上述所得的40mg分散于2mL氯仿中的反應種子，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度1h，之后將加熱套移開使其反應終止，得到產(chǎn)物三。將產(chǎn)物三冷卻至室溫后按照上述步驟清洗，并分散在氯仿中，得到直徑約15nm的四氧化三鐵納米顆粒，也稱為超順磁性納米粒子。

(2)雙親性聚合物PMA的合成步驟具體如下：稱取20mmol聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和10mmol十二胺于250mL的圓底燒瓶中，加入100mL四氫呋喃溶液，超聲60s后，加熱至65℃并持續(xù)攪拌2h，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉一半溶劑，再繼續(xù)加熱攪拌過夜，次日，將剩余溶液蒸發(fā)掉后，所得淡黃色固體，即雙親性聚合物PMA。將雙親性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即為0.2M的雙親性聚合物PMA。

(3)將步驟(1)所得單分散的超順磁性納米粒子與步驟(2)所得的雙親性聚合物按照比表面積1:100混合于100mL的圓底燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶內(nèi)所有溶劑全部揮發(fā)，所剩黑色固體重新溶解在20mL的SBB 12緩沖溶液中，并利用超濾管離心濃縮至5mL的蒸餾水中(離心條件：3000rpm，10min)，然后利用超速離心機(10,000rpm，0.5h)去除多余的聚合物，得到水溶性超順磁性納米粒子，將水溶性超順磁性納米粒子溶解在蒸餾水中備用。水溶性超順磁性納米粒子是包被了聚合物的超順磁性納米粒子。

(4)將步驟(3)所得聚合物包被的水溶性超順磁性納米粒子與microRNA按照摩爾比1:10混合后，加入2mL的EDC/NHS溶液(摩爾比1:3)進行共價偶聯(lián)，混合物于室溫反應過夜，次日利用超濾管去除混合物中的EDC和未偶聯(lián)的microRNA分子(離心條件：1000rpm，15min)，所得產(chǎn)物即為具有靶向性超順磁性納米探針。隨后將其放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)取2mL步驟(4)制得的探針與2mL含有胃癌細胞的血液混合孵育10min，將混合液緩慢加入到固定有外加磁場的含有磁珠的分選柱中(進樣速度：2mL/min)，捕獲有胃癌細胞的靶向性超順磁性納米探針便吸附在分選柱中，而未被捕獲的其他細胞則隨著加入的生理鹽水緩慢流出(流速：2mL/min)；磁性吸附于分選柱中的捕獲有胃癌細胞的靶向性超順磁性納米探針，在去掉外加磁場后，可隨著生理鹽水流出，從而收集到捕獲有胃癌細胞的靶向性超順磁性納米探針，達到分離、分選目的細胞的目的。

實施例5

(1)為制得單分散的超順磁性納米粒子，秤取3mmol的乙酰丙酮鐵、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度1h，之后將加熱套移開使其反應終止。將所得黑色液體(即產(chǎn)物一)冷卻至室溫后加入20mL的無水乙醇并離心沉淀(離心條件：3000rpm,10min)，所得黑色沉淀(即產(chǎn)物二)重懸于氯仿中，利用無水乙醇再次離心沉淀后，所得樣品分散于氯仿中保存。

利用該樣品(即所得單分散的超順磁性納米粒子)作為反應種子，根據(jù)種子生長法可獲得較大尺寸的超順磁性納米粒子。具體步驟為：秤取3mmol的乙酰丙酮鐵、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及20mL的十八烯混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，并加入上述所得的30mg分散于2mL氯仿中的反應種子，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度2h，之后將加熱套移開使其反應終止，得到產(chǎn)物三。將產(chǎn)物三冷卻至室溫后按照上述步驟清洗，并分散在氯仿中，得到直徑約15nm的四氧化三鐵納米顆粒，也稱為超順磁性納米粒子。

(2)雙親性聚合物PMA的合成步驟具體如下：稱取20mmol聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和5mmol十二胺于250mL的圓底燒瓶中，加入50mL四氫呋喃溶液，超聲40s后，加熱至65℃并持續(xù)攪拌4h，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉一半溶劑，再繼續(xù)加熱攪拌過夜，次日，將剩余溶液蒸發(fā)掉后，所得淡黃色固體，即雙親性聚合物PMA。將雙親性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即為0.2M的雙親性聚合物PMA。

(3)將步驟(1)所得單分散的超順磁性納米粒子與步驟(2)所得的雙親性聚合物按照比表面積1:500混合于100mL的圓底燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶內(nèi)所有溶劑全部揮發(fā)，所剩黑色固體重新溶解在20mL的SBB 12緩沖溶液中，并利用超濾管離心濃縮至3mL的蒸餾水中(離心條件:1000rpm，10min)，然后利用超速離心機(15,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超順磁性納米粒子，將水溶性超順磁性納米粒子溶解在蒸餾水中備用。水溶性超順磁性納米粒子是包被了聚合物的超順磁性納米粒子。

(4)將步驟(3)所得聚合物包被的水溶性超順磁性納米粒子與抗體按照摩爾比1:15混合后，加入1mL的EDC/NHS溶液(摩爾比1:3)進行共價偶聯(lián)，混合物于室溫反應過夜，次日利用超濾管去除混合物中的EDC和未偶聯(lián)的抗體(離心條件：2000rpm，20min)，所得產(chǎn)物即為具有靶向性超順磁性納米探針。隨后將其放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)取4mL步驟(4)制得的探針與4mL含有淋巴細胞的血液混合孵育15min，將混合液緩慢加入到固定有外加磁場的含有磁珠的分選柱中(進樣速度：2mL/min)，捕獲有淋巴細胞的靶向性超順磁性納米探針便吸附在分選柱中，而未被捕獲的其他細胞則隨著加入的生理鹽水緩慢流出(流速：6mL/min)；磁性吸附于分選柱中的捕獲有淋巴細胞的靶向性超順磁性納米探針，在去掉外加磁場后，可隨著生理鹽水流出，從而收集到捕獲有淋巴細胞的靶向性超順磁性納米探針，達到分離、分選目的細胞的目的。

實施例6

(1)為制得單分散的超順磁性納米粒子，秤取2.5mmol的氯化鐵、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的二芐醚混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱3h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度3h，之后將加熱套移開使其反應終止。將所得黑色液體(即產(chǎn)物一)冷卻至室溫后加入30mL的無水乙醇并離心沉淀(離心條件：3000rpm,10min)，所得黑色沉淀(即產(chǎn)物二)重懸于氯仿中，利用無水乙醇再次離心沉淀后，所得樣品分散于氯仿中保存。

利用該樣品(即所得單分散的超順磁性納米粒子)作為反應種子，根據(jù)種子生長法可獲得較大尺寸的超順磁性納米粒子。具體步驟為：秤取2.5mmol的鐵前驅(qū)體、10mmol的十六烷二醇、4mmol的油胺、4mmol的油酸及10mL的反應溶劑混合于100mL的三頸圓底燒瓶中，并加入上述所得的30mg分散于2mL氯仿中的反應種子，在氮氣保護和磁力攪拌作用下，混合物利用加熱套升溫至200℃，并在該溫度持續(xù)加熱2h，之后繼續(xù)加熱直至沸騰并保持該溫度1h，之后將加熱套移開使其反應終止，得到產(chǎn)物三。將產(chǎn)物三冷卻至室溫后按照上述步驟清洗，并分散在氯仿中，得到直徑約15nm的四氧化三鐵納米顆粒，也稱為超順磁性納米粒子。

(2)雙親性聚合物PMA的合成步驟具體如下：稱取10mmol聚(異丁烯-alt-馬來酸酐)和20mmol十二胺于250mL的圓底燒瓶中，加入100mL四氫呋喃溶液，超聲30s后，加熱至65℃并持續(xù)攪拌2h，然后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮發(fā)掉一半溶劑，再繼續(xù)加熱攪拌過夜，次日，將剩余溶液蒸發(fā)掉后，所得淡黃色固體，即雙親性聚合物PMA。將雙親性聚合物PMA溶解在40mL的氯仿中，即為0.1M的雙親性聚合物PMA。

(3)將步驟(1)所得單分散的超順磁性納米粒子與步驟(2)所得的雙親性聚合物按照比表面積1:300混合于100mL的圓底燒瓶中，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將燒瓶內(nèi)所有溶劑全部揮發(fā)，所剩黑色固體重新溶解在15mL的SBB 12緩沖溶液中，并利用超濾管離心濃縮至5mL的蒸餾水中(離心條件:3000rpm,10min)，然后利用超速離心機(15,000rpm，1h)去除多余的聚合物，得到水溶性超順磁性納米粒子，將水溶性超順磁性納米粒子溶解在蒸餾水中備用。水溶性超順磁性納米粒子是包被了聚合物的超順磁性納米粒子。

(4)將步驟(3)所得聚合物包被的水溶性超順磁性納米粒子與多肽分子按照摩爾比1:10混合后，加入2mL的EDC/NHS溶液(摩爾比1:3)進行共價偶聯(lián)，混合物于室溫反應過夜，次日利用超濾管去除混合物中的EDC和未偶聯(lián)的多肽分子(離心條件：2000rpm,20min)，所得產(chǎn)物即為具有靶向性超順磁性納米探針。隨后將其放置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

(5)取2mL步驟(4)制得的探針與2mL含有干細胞的血液混合孵育20min，將混合液緩慢加入到固定有外加磁場的含有磁珠的分選柱中(進樣速度：1mL/min)，捕獲有干細胞的靶向性超順磁性納米探針便吸附在分選柱中，而未被捕獲的其他細胞則隨著加入的生理鹽水緩慢流出(流速：10mL/min)；磁性吸附于分選柱中的捕獲有干細胞的靶向性超順磁性納米探針，在去掉外加磁場后，可隨著生理鹽水流出，從而收集到捕獲有干細胞的的靶向性超順磁性納米探針，達到分離、分選目的細胞的目的。

實施例1-6所制備的水溶性超順磁性納米粒子在去離子水中可室溫保存一年，在pH5.0～12情況下均可穩(wěn)定保存兩個月以上，而在100mM的NaCl溶液下可穩(wěn)定保存一個月以上。實施例1-6所得單分散的超順磁性納米粒子的T2弛豫率約250mM^-1s^-1。

實施例2-6所制備的單分散的超順磁性納米粒子和靶向性超順磁性納米探針在性能上分別與實施例1制備的單分散的超順磁性納米粒子和靶向性超順磁性納米探針類似，其圖片結(jié)果也類似于圖1-4的顯示結(jié)構(gòu)，未免過多贅述，沒有逐一示出。實施例2-6所制備的靶向性超順磁性納米探針捕獲與分離目的細胞的流程圖，如圖5所示。

以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。