本發(fā)明涉及一種新型熒光染料、合成方法及在硫化氫檢測中的應用。

(二)

背景技術：

熒光探針作為一種有效的、便捷的、快速的工具已經廣泛的應用于小分子檢測、蛋白質質分析、以及藥物分析。目前主要的熒光染料有羅丹明、香豆素、熒光素等化合物。但這些化合物都存在其顯著的缺點：細胞相容性差、合成困難、熒光強度低、難于修飾。因此對于新熒光染料的開發(fā)已經引起越來越多研究者的關注。這里我們基于8-氨基喹啉，利用C-H活性技術開發(fā)出了一種新型熒光染料，該染料具有熒光性能好、易于合成，易于修飾的特點。

硫化氫是一種有臭雞蛋味的小分子氣體，與CO和NO屬于同一類型的氣體，現(xiàn)在被證實為第三個內源性氣體信號分子，主要是通過三種酶產生：胱硫醚β-合酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-MST)，存在人體的不同部位。目前研究的方法主要是開發(fā)新型的活細胞H₂S熒光探針，通過熒光探針檢測，可以在醫(yī)學上有重要的突破，特別是對阿爾滋海默癥、唐氏綜合癥、糖尿病等重大疾病。因此，開發(fā)出靈敏、高選擇性、低背景的測量生物樣本中H₂S的方法對研究H₂S的生物學功能具有重要意義。而疊氮和硫化氫的還原反應已經成為硫化氫檢測的一種重要思路?；谝环N新型、高靈敏、且具有一定抗腫瘤，抗阿爾海默茨病的三氮唑喹啉類熒光染料，我們設計合成了一種新型檢測硫化氫探針，這類探針已經成功的應用于硫化氫濃度檢測和細胞硫化氫檢測。

(三)

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種新型熒光染料及其在硫化氫檢測中的應用。

本發(fā)明采用的技術方案是：

本發(fā)明提供一種式(I)所示新型熒光染料，

式(I)中R₁為C2-C10脂肪烷基、C5-C6雜環(huán)或取代芳基，其中取代基為鹵素、C1-C6烷基或甲氧基，優(yōu)選丁烷、噻吩或取代苯基，所述取代基為氯、甲氧基或乙基，更優(yōu)選氯代苯基；R₂為氫、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共軛烯基，優(yōu)選氫。

更進一步，所述熒光染料為下列之一：

本發(fā)明還提供一種所述熒光染料的制備方法，所述方法為：(1)將式(Ⅱ)所示化合物溶于體積濃度50％N,N-二甲基甲酰胺水溶液中，加入醋酸銅、過硫酸鉀、1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(DBU)、四丁基溴化銨(TBAB)和疊氮化鈉，在20～60℃反應完全，反應液分離純化，獲得式(Ⅲ)所示化合物；所述N,N-二甲基甲酰胺水溶液體積用量以式(Ⅱ)所示化合物物質的量計為10～100ml/mol，優(yōu)選100ml/mol；所述醋酸銅、過硫酸鉀、DBU、TBAB和疊氮化鈉與式(Ⅱ)所示化合物物質的量之比為0.1～5：1～5：1～5：1～5：1～5：1，優(yōu)選0.3-3:1:1:3:1；(2)將式(Ⅲ)所示化合物溶于體積濃度50％有機溶劑水溶液中，加入碘化亞銅和炔基類化合物，在10～60℃(優(yōu)選40-60℃)反應完全，反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過硫酸鎂干燥、過濾、常溫下旋轉蒸除溶劑，即得粗品；將粗品進硅膠柱層析，以體積比為1：3-10的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.3-0.5的洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，獲得式(IV)所示化合物；所述有機溶劑為四氫呋喃或二甲基甲酰胺，所述炔基類化合物為C1～C10烷基，芳環(huán)，C5～C6雜環(huán)炔類化合物，優(yōu)選苯乙炔、4-甲基苯乙炔、4-乙基苯乙炔、4-呋喃苯乙炔、4-甲氧基苯乙炔、己炔或4-氯苯乙炔；所述有機溶劑水溶液體積用量以式(Ⅲ)所示化合物物質的量計為10～100ml/mol，優(yōu)選100ml/mol；所述碘化亞銅和炔基類化合物與式(Ⅲ)所示化合物物質的量之比為0.1～1.5：0.1～3：1，優(yōu)選0.1-1:0.1-1:1；(3)將式(IV)所示化合物用無水乙醇溶解后與試劑混合，在60-120℃(優(yōu)選80℃)反應完全，反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過硫酸鎂干燥、過濾、常溫下旋轉蒸除溶劑，即得粗品；將粗品進硅膠柱層析，以體積比為1：3-10的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.3-0.5的洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，獲得式(I)所示化合物；所述無水乙醇體積用量以式(IV)所示化合物的物質的量計為0.10～6L/mol，優(yōu)選0.67L/mol；所述試劑為氫氧化鉀或1-3mol/L鹽酸水溶液，所述氫氧化鉀與式(IV)所示化合物的物質量比為1～3：1，所述鹽酸水溶液體積用量以式(IV)所示化合物物質的量計為10～60ml/mol；

式(Ⅱ)中，R₂為氫、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共軛烯基，R₃為C2-C13苯基、C2-C10脂肪烷基、C5-C6取代芳基，C5-C6雜環(huán)、氨基酸、叔丁氧羰基，芴甲氧羰基；其中取代基為鹵素、C1-C6烷基或甲氧基；

式(Ⅲ)中R₂和R₃同式(Ⅱ)；

式(IV)中R₁為C2-C10脂肪烷基、C5-C6雜環(huán)或取代芳基，其中取代基為鹵素、C1-C6烷基或甲氧基；R₂和R₃同式(Ⅱ)；

式(I)中R₁、R₂和R₃同式(IV)。

進一步，步驟(1)反應液分離純化方法為：反應結束后，反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過干燥、過濾、蒸干，獲得濃縮物；取濃縮物進行硅膠柱層析，以體積比為1：10的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集R_f值為0.5-0.7的洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，得到式(Ⅲ)所示化合物。

此外，本發(fā)明還提供一種所述熒光染料在制備式(Ⅴ)所示硫化氫探針中的應用；

式(Ⅴ)中R₁為C1-C10脂肪烷基、C5-C6雜環(huán)或取代芳基，其中取代基為鹵素、C1-C6烷基或甲氧基，優(yōu)選對氯苯基；R₂為氫、甲氧基、C1-C10烷基或C2-C6共軛烯基，優(yōu)選氫。

進一步，所述硫化氫探針為：

進一步，所述硫化氫探針按如下方法制備：將式(I)所示熒光染料溶于乙醇，冰浴下加入1-3mol/L鹽酸水溶液和亞硝酸鈉，0～40℃反應2h，接著加入疊氮化鈉，0～40℃繼續(xù)反應完全，反應液純化，得到式(Ⅴ)所示硫化氫探針；所述乙醇體積用量以式(I)所示熒光染料物質的量計為1～6L/mmol，優(yōu)選1L/mmol；所述鹽酸水溶液體積用量以式(I)所示熒光染料物質的量計為0.1～5L/mmol，優(yōu)選0.5L/mmol；所述亞硝酸鈉和疊氮化鈉與式(I)所示熒光染料物質的量之比為2：3：1。

本發(fā)明還提供了一種硫化氫檢測的方法：所述硫化氫濃度為2μmol-5mmol的硫化氫溶液。將待測硫化氫樣品，pH值為7.4的PBS緩沖液中得到硫化氫的100mM樣品溶液，取待測硫化氫樣品1μl，加入含熒光探針溶液，得到反應液，充分混勻，反應液立即加入96孔篩板中，觀測熒光強度變化，測其熒光強度。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明選用的喹啉結構是個雙光子熒光團，利用方法學引入三氮唑具有良好的光穩(wěn)定性以及很大的斯托克位移，且反應速度快。所合成的探針對硫化氫水溶液具有很好的特異性，穿透能力強，對細胞損傷小，能夠檢測細胞內硫化氫的濃度，最低檢測限為2μM，為研究細胞中硫化氫的生理作用提供一種有效的研究工具。

(四)附圖說明

圖1 pH 7.4下加入0μM和100μM硫化氫濃度的熒光探針紫外吸收光譜。

圖2熒光探針在pH為7.4條件下的選擇性檢測圖；熒光探針(10μm)與不同化合物(100μm)反應五分鐘的選擇性實驗；Ex＝360nm；Em＝490nm；1-HPO₄^-、2-H₂PO₄^2-、3-HCO₃^-、4-Cl^-、5-NO₃^-、6-CO₃²⁺、7-N₃、8-SO₄²⁺、9-OAc^-、10-HSO₃^-、11-GSH、12-Cys、13-Hcy、14-NaS。

圖3熒光探針在pH為7.4、不同當量硫化氫中，激發(fā)波長為365nm、488nm處的熒光效果檢測圖。

圖4熒光探針在pH為7.4、不同時間內，激發(fā)波長為365nm、488nm處的熒光效果檢測圖。

圖5為本發(fā)明反應路線圖。

(五)具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

實施例1：制備N-(5-疊氮喹啉-8-氨基)苯酰胺

將0.1mmol N-(喹啉-8氨基)苯酰胺(Ⅱ-1)加入5ml的N,N-二甲基甲酰胺和5ml的去離子水中制成混合液10ml，向其中加入0.3mmol疊氮化鈉，醋酸銅0.03mmol，0.3mmol過硫酸鉀，0.1mmol DBU，0.1mmol TBAB，40℃反應12小時，反應結束后，反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過無水硫酸鎂干燥、過濾、60℃減壓蒸溜除去溶劑，即得所述式(Ⅲ-1)所示化合物粗品。將式(Ⅲ-1)所示化合物粗品進硅膠柱層析，以體積比為1：5的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.5-0.7的洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，得到式(Ⅲ-1)所示的化合物純品22mg。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.56(s,1H),8.93(dd,J＝10.2,5.4Hz,1H),8.84(dd,J＝4.1,1.2Hz,1H),8.39(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),8.07(dd,J＝13.8,6.9Hz,2H),7.62–7.50(m,3H),7.45(dd,J＝8.4,4.1Hz,1H),7.28(dd,J＝7.7,5.3Hz,1H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ165.11,149.08,138.99,134.88,131.84,131.52，131.56,130.32,128.76,127.18,121.50,121.33,116.36,114.84.

實施例2：制備N-(5-疊氮喹啉-8-氨基)苯酰胺

將0.1mmol N-(喹啉-8氨基)苯酰胺(Ⅱ-1)加入5ml的N,N-二甲基甲酰胺和5ml的去離子水中制成混合液10ml，向其中加入0.3mmol疊氮化鈉，醋酸銅0.03mmol，0.1mmol DBU，40℃反應12小時，反應結束后，反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過無水硫酸鎂干燥、過濾、60℃減壓蒸溜除去溶劑，即得所述式(Ⅲ-1)所示化合物粗品。將式(Ⅲ-1)所示化合物粗品進硅膠柱層析，以體積比為1∶5的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.5-0.7的洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，得到式(Ⅲ-1)所示的化合物純品0mg。

實施例3：制備N-(5-疊氮喹啉-8-氨基)苯酰胺

將0.1mmol N-(喹啉-8氨基)苯酰胺(Ⅱ-1)加入5ml的N,N-二甲基甲酰胺和5ml的去離子水中制成混合液10ml，向其中加入0.3mmol疊氮化鈉，醋酸銅0.03mmol，0.3mmol過硫酸鉀，0.1mmol DBU，0.1mmol TBAB，40℃反應12小時，反應結束后，反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過無水硫酸鎂干燥、過濾、60℃減壓蒸溜除去溶劑，即得所述式(Ⅲ-1)所示化合物粗品。將式(Ⅲ-1)所示化合物粗品進硅膠柱層析，以體積比為1：5的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.5-0.7洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，得到式(Ⅲ-1)所示的化合物純品22mg。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.56(s,1H),8.93(dd,J＝10.2,5.4Hz,1H),8.84(dd,J＝4.1,1.2Hz,1H),8.39(dd,J＝8.4,1.2Hz,1H),8.07(dd,J＝13.8,6.9Hz,2H),7.62–7.50(m,3H),7.45(dd,J＝8.4,4.1Hz,1H),7.28(dd,J＝7.7,5.3Hz,1H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ165.11,149.08,138.99,134.88,131.84,131.52，131.56,130.32,128.76,127.18,121.50,121.33,116.36,114.84.

實施例4：N-(5-(4-苯基-1、2、3-三氮唑基)-喹啉-8-氨基)苯酰胺

將0.1mmol實施例1制備的式(Ⅲ-1)所示化合物，溶于5ml四氫呋喃和5ml去離子水中制成混合液10ml，向其中加入0.1mmol的苯乙炔、0.1mmol納米碘化亞銅(粒徑100nm)，常溫(25℃)下反應12小時，向反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過無水硫酸鎂干燥、過濾、60℃減壓蒸溜除去溶劑，即得所述式(IV-1)所示化合物粗品，式(IV-1)所示化合物粗品進行硅膠柱層析，以體積比為1∶4的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.3-0.5的洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，得到式(IV-1)所示化合物純品32mg。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ10.90(s,1H),9.10(d,J＝8.3Hz,1H),8.98(dd,J＝4.2,1.5Hz,1H),8.65(d,J＝5.3Hz,1H),8.34(m,2H),8.15(m,2H),7.87(m,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.78(d,J＝8.3Hz,1H),7.66(m,4H),7.31(m,J＝7.5,4.8,1.0Hz,1H).¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ165.67,149.94,149.64,149.29,148.62,138.55,137.09,136.53,134.68,132.27，132.19,128.95,127.40,124.52，124.49,123.69,123.24，123.20,120.53,115.24。

實施例5 5-(4-苯基-1,2,3-三氮唑)喹啉-8-氨基

將實施例1制備的化合物(III-1)0.1mmol溶于5ml四氫呋喃和5ml水的混合溶液中，向其中加入0.01mmol的苯乙炔，和0.01mmol的納米碘化亞銅，常溫反應12小時，向反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過無水硫酸鎂干燥、過濾、60℃減壓蒸溜除去溶劑，即得所述式(IV-1)所示化合物粗品，式(IV-1)所示化合物粗品進行硅膠柱層析，以體積比為1：4的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.3-0.5的洗脫液，收集得到的洗脫液經減壓除去溶劑，干燥，得到(IV-1)所示化合物15mg。

將所得15mg化合物(IV-1)溶于10ml乙醇中，加入10mg氫氧化鉀，在80℃的條件下反應過夜，向反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過無水硫酸鎂干燥、過濾、60℃減壓蒸溜除去溶劑，即得所述式(I-1)所示化合物粗品，式(I-1)所示化合物粗品進行硅膠柱層析，以體積比為1∶4的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.3-0.5的洗脫液，得到式(I-1)所示化合物9mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ9.02(s,1H),8.85(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.01–7.99(m,2H),7.90(d,J＝8.6Hz,1H),7.86(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.59(m,J＝6.5,5.2,3.2Hz,5H),7.53(d,J＝8.6Hz,1H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),6.52(s,2H).

實施例6 5-(4-甲基苯基-1,2,3-三氮唑)喹啉-8-氨基

將實施例5中苯乙炔改為0.01mol的4-甲基苯乙炔，其它操作同實施例5，得到式(IV-2)所示化合物15mg。

將式(IV-2)所示化合物按實施例5所述方法，制備得到式(I-2)所示化合物17mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.92(s,1H),8.85(dd,J＝3.9,1.3Hz,1H),7.86(m,J＝12.4,4.7Hz,3H),7.58(dd,J＝8.4,4.0Hz,2H),7.31(d,J＝7.9Hz,2H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),6.51(s,2H),2.36(s,3H)¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ147.74,147.19,146.40,137.33,136.16,130.64,129.46,127.79,125.59,125.26,124.13,123.74,123.05,106.40,20.85.

實施例7 5-(4-呋喃-1,2,3-三氮唑)喹啉-8-氨基

將實施例5中苯乙炔改為0.01mol的4-呋喃乙炔，其它操作同實施例5，得到式(IV-3)所示化合物15mg。

將式(IV-3)所示化合物按實施例5所述方法，制備得到式(I-3)所示化合物15mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.85(dd,J＝4.1,1.5Hz,1H),8.83(s,1H),7.96(dd,J＝2.9,1.1Hz,1H),7.84(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),7.71(dd,J＝5.0,2.9Hz,1H),7.62(dd,J＝5.0,1.1Hz,1H),7.60–7.55(m,2H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),6.51(s,2H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ147.75,147.21,142.91,136.15,131.83,130.57，127.20,125.88,125.59,124.12,123.91,123.06,121.09,119.67,106.40.

實施例8 5-(4-乙基苯基-1,2,3-三氮唑)喹啉-8-氨基

將實施例5中苯乙炔改為0.01mol的4-乙基苯乙炔其它操作同實施例5，得到式(IV-4)所示化合物15mg。

將式(IV-4)所示化合物按實施例5所述方法，制備得到式(I-4)所示化合物21mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.92(s,1H),8.85(dd,J＝4.0,1.3Hz,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,2H),7.85(dd,J＝8.6,1.3Hz,1H),7.58(dd,J＝8.4,4.4Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H),6.96(d,J＝8.2Hz,1H),6.51(s,2H),2.66(q,J＝7.6Hz,2H),1.22(d,J＝7.6Hz,3H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ148.25,147.68,146.92,144.18,136.66,131.12,128.77,128.53,126.08,125.85,124.61,124.27,123.55,120.30,106.91,28.43,15.97.

實施例9 5-(4-甲氧基苯基-1,2,3-三氮唑)喹啉-8-氨基

將實施例5中苯乙炔改為0.01mol的4-甲氧基苯乙炔其它操作同實施例5，得到式(IV-5)所示化合物15mg。

將式(IV-5)所示化合物按實施例5所述方法，制備得到式(I-5)所示化合物21mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.86(s,1H),8.85(dd,J＝5.5,1.2Hz,1H),7.90(d,J＝8.7Hz,2H),7.85(dd,J＝8.6,1.5Hz,1H),7.60–7.55(m,2H),7.06(dd,J＝8.9,2.4Hz,3H),6.97(d,J＝8.2Hz,1H),6.50(s,2H),3.82(s,3H).

實施例10、5-(4丁基-1,2,3-三氮唑)喹啉-8-氨基

將實施例5中苯乙炔改為0.01mol的己炔，其它操作同實施例5，得到式(IV-6)所示化合物15mg。

將式(IV-6)所示化合物按實施例5所述方法，制備得到式(I-6)所示化合物15mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.83(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.21(s,1H),7.72(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.56(dd,J＝8.6,4.1Hz,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,1H),6.93(d,J＝8.2Hz,1H),6.44(s,2H),2.76–2.73(m,2H),1.71–1.66(m,2H),1.41(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H),0.97–0.93(m,3H).¹³C NMR(126MHz,DMSO)δ147.66,146.93,140.10,136.17,130.56,125.42,124.56,124.19,122.93,120.12,106.43,31.04,24.69,21.73,13.70.

實施例11 5-(對氯苯基-1,2,3-三氮唑)喹啉-8-氨基

將實施例5中苯乙炔改為0.01mol的4-氯苯乙炔，其它操作同實施例5，得到式(IV-7)所示化合物15mg。

將式(IV-7)所示化合物按實施例5所述方法，制備得到式(I-7)所示化合物15mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.98(s,1H),8.85(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),7.98(dd,J＝5.1,3.3Hz,2H),7.85(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.59(m,J＝4.1,2.2Hz,2H),7.51(dd,J＝10.6,4.9Hz,2H),7.41–7.37(m,1H),6.97(d,J＝8.2Hz,1H),6.51(s,2H).

實施例12 N-8-疊氮基-5-(4-(4-對氯苯基)--1,2,3-三氮唑)喹啉

將實施例11制備的化合物(I-7)0.01mmol溶于10mL乙醇，冰浴下加入2mol/L的鹽酸5mL、0.02mmol亞硝酸鈉，0℃反應兩小時，接著加入0.03mmol疊氮化鈉，25℃反應過夜，向反應液中加入飽和NaCl水溶液，用二氯甲烷萃取，取有機層經過無水硫酸鎂干燥、過濾、60℃減壓蒸溜除去溶劑，即得所述式(V-1)所示化合物粗品，式(Ⅴ-1)所示化合物粗品進行硅膠柱層析，以體積比為1∶4的乙酸乙酯和石油醚的溶液為流動相，TLC跟蹤收集Rf值為0.3-0.5的洗脫液，干燥，得到所述(Ⅴ-1)化合物12mg。

¹H NMR(500MHz,DMSO)δ8.98(s,1H),8.85(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),7.98(dd,J＝5.1,3.3Hz,2H),7.85(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H),7.59(m,J＝4.1,2.2Hz,2H),7.51(dd,J＝10.6,4.9Hz,2H),7.41–7.37(m,1H),6.97(d,J＝8.2Hz,1H),

實施例13:化合物熒光特性

準確稱取熒光染料(實施例5-11所述化合物(Ⅰ-1)-(Ⅰ-7))，用二甲基亞砜配制成濃度為10mM的熒光染料母液，用移液槍吸取1μL分別加入到999μL不同溶液中(N,N-二甲基甲酰胺、二氯亞砜、乙醇、水)，37℃搖床上充分混勻10分鐘后，測定不同溶液的紫外吸收光譜，以及發(fā)射波長。結果見表1。所述染料有一個很好的溶劑致變性和溶劑相容性。

表1化合物熒光特性

實施例14：探針(Ⅴ-1)在pH為7.4條件下加入0μM和100μM硫化氫濃度的紫外吸收光譜測定

準確稱取實施例12制備的探針(Ⅴ-1)，用二甲基亞砜配制成濃度為10mM的探針母液，用移液槍吸取1μL加入到998μL磷酸緩沖液(pH7.4)和二甲基亞砜的混合溶液中(7:3，v/v)，分別加入1μL、10μM硫化氫水溶液，使反應體系中硫化氫濃度為100μM，37℃下反應5分鐘后，測定兩個混合液的紫外吸收光譜，結果見圖1。所述探針與硫化氫反應后在365nm出現(xiàn)很強的吸收峰，表明探針具有很好地靈敏性。

實施例15：探針(Ⅴ-1)在pH為7.4條件下的選擇性實驗

準確稱取實施例12制備的探針(Ⅴ-1)，用二甲基亞砜配制成濃度為10mM的探針母液，用移液槍吸取1μL加入到998μL磷酸緩沖液(pH7.4)和二甲基亞砜的混合溶液中(7:3，v/v)，分別加入1μL硫化氫水溶液和其他對照結構(磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉、氯化鈉、硝酸鈉、碳酸氫鈉、疊氮化鈉、醋酸鈉、硫酸氫鈉、谷胱甘肽、半胱氨酸、同型半胱氨酸)，使反應體系中硫化氫濃度和對照濃度為100μM，探針濃度為10μM，37℃下反應5分鐘后，測定其熒光值。激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為488nm，熒光強度見圖2，該探針對于硫化氫檢測有很好的專一性。

實施例16：探針(Ⅴ-1)在pH為7.4激發(fā)波長為365nm條件下加

入不同當量硫化氫濃度下的熒光效果檢測

準確稱取實施例12制備的探針(Ⅴ-1)，用二甲基亞砜配制成濃度為10mM的探針母液，用移液槍吸取1μL加入到998μL磷酸緩沖液(pH7.4)和二甲基亞砜的混合溶液中(7:3，v/v)，分別加入1μL不同濃度硫化氫水溶液(最終硫化氫在反應體系中的濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM)，37℃下反應5分鐘后，測定其熒光值。激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為488nm，熒光強度見圖3。所述探針檢測硫化氫濃度呈良好線性相關。

實施例17：探針(Ⅴ-1)在pH為7.4激發(fā)波長為365nm條件下不同時間熒光強度。

準確稱取實施例12制備的探針(Ⅴ-1)，用二甲基亞砜配制成濃度為10mM的探針母液，用移液槍吸取1μL加入到998μL磷酸緩沖液(pH7.4)和二甲基亞砜的混合溶液中(7:3，v/v)，加入1μL硫化氫水溶液(反應體系中硫化氫濃度為100μM)，分別測定不同時間段(0-50min)的熒光強度，激發(fā)波長為365nm，發(fā)射波長為488nm，熒光強度見圖4。所述探針與硫化氫反應速度很快。