本發(fā)明涉及一種使用軟刻芯片技術(shù)改造蛋白質(zhì)結(jié)晶基底的方法，特別是通過軟刻技術(shù)改變結(jié)晶界面粗糙度來提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的執(zhí)行者，其結(jié)構(gòu)是功能研究的前提和基礎(chǔ)，因此，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析對(duì)闡明其生物學(xué)功能具有非常重要的意義。目前，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中，有88％以上的結(jié)構(gòu)都是通過X-射線衍射技術(shù)獲得的，而高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體是通過X-射線衍射技術(shù)獲得結(jié)構(gòu)的前提和基礎(chǔ)。目前，蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選成功率低是制約X-射線衍射技術(shù)發(fā)展的重要瓶頸，因此，如何提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率是亟待解決的重要問題。
形核是蛋白質(zhì)結(jié)晶的第一步，也是最重要的一步。通常只有蛋白質(zhì)溶液濃度達(dá)到過飽和才能逾越形核勢(shì)壘，晶核才能形成，繼而晶體才能生長。而對(duì)于一些比較珍貴的蛋白質(zhì)樣品，濃度很難達(dá)到過飽和，晶核不能形成，直接導(dǎo)致了結(jié)晶成功率低的問題。通過在結(jié)晶體系中直接引入異相核是一種提高結(jié)晶成功率的有效手段，蛋白質(zhì)溶液不需要跨越形核勢(shì)壘，就可以直接在異相核表面堆積，進(jìn)而進(jìn)行晶體生長。對(duì)結(jié)晶板表面進(jìn)行改性處理是一種最為方便和快捷的提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，研究表明直接改變結(jié)晶界面的粗糙度會(huì)顯著影響蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率。文獻(xiàn)“Guo Y Z,Yin D C,Lu Q Q,et al.Enhancement of nucleation during hanging drop protein crystallization using HF Treatment of cover glasses[J].Cryst.Res.Technol,2010,45(2):158-166.”中報(bào)道，使用氫氟酸蝕刻蓋玻片以改變其界面的粗糙度，在懸滴法中使用經(jīng)過處理的蓋玻片可以有效提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率。結(jié)晶界面表面粗糙度的大小對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率影響十分顯著，只有在結(jié)晶界面粗糙度合適的條件下，蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率才能顯著提高。結(jié)晶界面表面粗糙度的改變都是在實(shí)驗(yàn)室通過化學(xué)反應(yīng)的方法得到，如氫氟酸腐蝕等，在該結(jié)晶界面的表面粗糙度很難控制到均一的程度，結(jié)晶是蛋白質(zhì)分子有序堆積的過程，粗糙度均一的結(jié)晶界面會(huì)更加有利于蛋白質(zhì)結(jié)晶，因此，制備具有均一可控表面粗糙度的結(jié)晶板能顯著促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)晶。
微流控技術(shù)由于其具有高通量、集成化、低消耗等優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)微型化結(jié)晶中的應(yīng)用具有重要地位。目前，已應(yīng)用于微量蛋白質(zhì)結(jié)晶與篩選的技術(shù)包括基于聚二甲基硅氧烷(Polydimethyl iloxane，PDMS)材料的微泵微閥技術(shù)等。在微流控芯片制作工藝中，通常采用模塑法中的軟刻技術(shù)，利用PDMS材料制備出微米級(jí)的結(jié)構(gòu)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種使用軟刻芯片改變結(jié)晶基底粗糙度用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，基于表面粗糙度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響，及軟刻技術(shù)可以在PDMS材料表面制作粗糙度可控和均一的基底，以此將該基底應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選，能夠提高結(jié)晶成功率。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟：
第一步，制作PDMS芯片，包括以下步驟：
(1)在PDMS芯片界面上設(shè)計(jì)緊密排列的微柱陣列，每根微柱的直徑為5～300μm，微柱的高度為5～300μm，微柱的間距為5～300μm；或者設(shè)計(jì)一系列有間隔的微柱陣列，陣列中每根微柱的直徑在5～300μm之間，微柱的高度在5～300μm之間，微柱的間距為5～300μm之間，每組陣列中微柱在長1mm～1cm、寬1mm～1cm的區(qū)域內(nèi)緊密排列，每組陣列間的間距為1mm～1cm；
(2)芯片制備，包括以下內(nèi)容：
a)用98％濃硫酸和雙氧水按照3：1的體積比配成洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，用無水乙醇和丙酮分別浸泡1min后再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到基片；
b)將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層；
c)將制備好的基片置于65～95℃烘干；
d)將烘干的基片在光刻機(jī)上曝光45s；
e)用顯影劑對(duì)光刻處理的基片顯影3min，吹干，得到制作PDMS芯片的模板；
(3)芯片制備，包括以下內(nèi)容：
a)用三甲基氯硅烷蒸汽熏模板3min；
b)按照10：1的體積比量取PDMS預(yù)聚物和固化劑，混合均勻；
c)將混合均勻的PDMS預(yù)聚物和固化劑傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；
d)將模板置于80℃環(huán)境中固化，得到刻有微柱陣列的PDMS；
e)將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板表面，備用；
第二步，配置濃度為0.001～1M、pH值在3～10的緩沖液，所述的緩沖液包括所有可以減少溶液體系內(nèi)pH改變，維持體系酸堿度的溶液，用緩沖液來溶解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)在溶液中的終濃度達(dá)到1～100mg/ml，得到蛋白質(zhì)溶液；
第三步，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照(0.01～50)：1的體積比混合，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液體系；
第四步，將蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴加在PDMS表面，在0～60℃下靜置1～720h結(jié)晶。
所述的緩沖液包括但不限于Tris系統(tǒng)、磷酸、碳酸、醋酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸、巴比妥酸、硼酸鹽。
本發(fā)明的有益效果是：通過設(shè)計(jì)PDMS芯片實(shí)現(xiàn)可控和均一粗糙度的結(jié)晶界面，來提高基底表面蛋白質(zhì)形核幾率，從而達(dá)到提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的目的。通過本發(fā)明，可使蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選成功率提高1～5倍。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明，本發(fā)明包括但不僅限于下述實(shí)施例。
本發(fā)明的技術(shù)方案提供一種通過使用軟刻技術(shù)在PDMS表面構(gòu)建可控和均一粗糙度的結(jié)晶表面來篩選蛋白質(zhì)晶體的方法，具體的技術(shù)方案步驟如下：
第一步：PDMS芯片設(shè)計(jì)和制作：(1)PDMS芯片的設(shè)計(jì)：基于一般蛋白質(zhì)分子及其聚合物的直徑，我們?cè)赑DMS芯片界面上設(shè)計(jì)緊密排列的微柱陣列，其中每根微柱的直徑在5～300μm之間，微柱的高度在5～300μm之間，微柱的間距為5～300μm之間；或者設(shè)計(jì)一系列有間隔的微柱陣列，陣列中每根微柱的直徑在5～300μm之間，微柱的高度在5～300μm之間，微柱的間距為5～300μm之間，每組陣列中微柱在長1mm～1cm之間，寬度為1mm～1cm之間的區(qū)域內(nèi)緊密排列，每組陣列間的間距為1mm～1cm；(2)芯片及模板制備：a)準(zhǔn)備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機(jī)上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對(duì)光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預(yù)處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10：1稱取PDMS預(yù)聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機(jī)混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化，得到刻有微柱陣列的PDMS；e)制備覆蓋PDMS的結(jié)晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板表面，備用；
第二步：蛋白質(zhì)溶液的配置：配置濃度為0.001～1M，pH值在3～10的緩沖液(指所有可以減少溶液體系內(nèi)pH改變，維持體系酸堿度的溶液)，用緩沖液來溶解蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)在溶液中的終濃度達(dá)到1～100mg/ml，得到蛋白質(zhì)溶液；
第三步：加入結(jié)晶試劑，制備蛋白質(zhì)結(jié)晶體系：將結(jié)晶試劑(指所有用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的試劑)與蛋白質(zhì)溶液按照(0.01～50)：1體積比混合，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液體系；
第四步：結(jié)晶：將蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴加在PDMS芯片表面，在0～60℃下靜置1～720h結(jié)晶。在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)蛋白質(zhì)晶體的條件數(shù)目。
所述的緩沖液指可以在一定程度上抵消、減輕外界環(huán)境變化例如外加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿等對(duì)溶液酸堿度的影響，從而使溶液的pH值能夠維持相對(duì)穩(wěn)定的溶液。包括但不限于Tris系統(tǒng)、磷酸、碳酸、醋酸、檸檬酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸、巴比妥酸、硼酸鹽。
實(shí)施例1：蛋白酶K結(jié)晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設(shè)計(jì)和制作：(1)PDMS芯片的設(shè)計(jì)：在PDMS芯片界面上設(shè)計(jì)一系列緊密排列的微柱陣列，微柱的直徑在5μm，微柱的高度在10μm，微柱的間距為100μm；(2)芯片及模板制備：a)準(zhǔn)備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機(jī)上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對(duì)光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預(yù)處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預(yù)聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機(jī)混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結(jié)晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板表面，備用；
第二步：將美國Sigma公司的蛋白酶K，按照終濃度為30mg/ml溶于pH為5，0.025M HEPES-Na緩沖液中，得到蛋白質(zhì)溶液；
第三步：本實(shí)施例用Hampton公司的IndexTM試劑盒的96種結(jié)晶試劑篩選蛋白酶K晶體，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為0.01：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
第四步：將整個(gè)結(jié)晶體系置于50℃條件下靜置2h結(jié)晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)蛋白酶K晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到如下結(jié)果：有56種結(jié)晶條件出現(xiàn)了蛋白酶K晶體，結(jié)晶成功率為58.33％。與現(xiàn)有的商業(yè)結(jié)晶板篩選結(jié)晶條件的結(jié)果相比，成功率提高了1.3倍。
實(shí)施例2：溶菌酶蛋白結(jié)晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設(shè)計(jì)和制作：(1)PDMS芯片的設(shè)計(jì)：在PDMS芯片界面上設(shè)計(jì)微柱陣列在長度為1mm和寬度為0.5mm的區(qū)域內(nèi)緊密排列，陣列間的間距為1mm，其中微柱的直徑為50μm，微柱的高度為10μm，微柱的間距為100μm；(2)芯片及模板制備：a)準(zhǔn)備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機(jī)上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對(duì)光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預(yù)處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預(yù)聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機(jī)混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結(jié)晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板表面，備用；
第二步：將日本Seikagaku公司的溶菌酶按照終濃度為10mg/ml溶于pH為4.6，0.1M的醋酸鈉緩沖液中，得到蛋白質(zhì)溶液；
第三步：將氯化鈉溶液與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為0.1：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
第四步：將整個(gè)結(jié)晶體系置于4℃條件下靜置336h結(jié)晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)溶菌酶蛋白晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到如下結(jié)果：有64種結(jié)晶條件出現(xiàn)了溶菌酶蛋白晶體，結(jié)晶成功率為66.67％。與現(xiàn)有的商業(yè)結(jié)晶板篩選結(jié)晶條件的結(jié)果相比，成功率提高了1.7倍。
實(shí)施例3：核糖核酸酶A結(jié)晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設(shè)計(jì)和制作：(1)PDMS芯片的設(shè)計(jì)：在PDMS芯片界面上設(shè)計(jì)一系列微柱陣列，每組微柱陣列在長度為1cm和寬度為1mm的區(qū)域內(nèi)緊密排列，陣列間的間距為1mm，微柱的直徑為30μm，微柱的高度為100μm，微柱的間距為20μm；(2)芯片及模板制備：a)準(zhǔn)備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機(jī)上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對(duì)光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預(yù)處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預(yù)聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機(jī)混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結(jié)晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板表面，備用；
第二步：將美國Sigma公司的核糖核酸酶A，按照終濃度為70mg/ml溶于pH為7，0.05M HEPES-Na緩沖液中，得到蛋白質(zhì)溶液；
第三步：本實(shí)施例用Hampton公司的Crystal Screen和Crystal Screen 2試劑盒的98種結(jié)晶試劑篩選核糖核酸酶A晶體，將結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為1：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
第四步：將整個(gè)結(jié)晶體系置于20℃條件下靜置72h結(jié)晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)核糖核酸酶A晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到如下結(jié)果：有42種結(jié)晶體系出現(xiàn)了核糖核酸酶A晶體，結(jié)晶成功率為43.75％。與現(xiàn)有的商業(yè)結(jié)晶板篩選結(jié)晶條件的結(jié)果相比，成功率提高了4.7倍。
實(shí)施例4：纖維素酶結(jié)晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設(shè)計(jì)和制作：(1)PDMS芯片的設(shè)計(jì)：在PDMS芯片界面上設(shè)計(jì)緊密排列的微柱陣列，微柱的直徑為100μm，微柱的高度為20μm，微柱的間距為50μm；(2)芯片及模板制備：a)準(zhǔn)備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機(jī)上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對(duì)光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預(yù)處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預(yù)聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機(jī)混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結(jié)晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板表面，備用；
第三步：本實(shí)施例用Hampton公司IndexTM試劑盒的96種結(jié)晶試劑篩選纖維素酶晶體，將結(jié)晶試劑與纖維素酶蛋白溶液按照體積比為10：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
第四步：將整個(gè)結(jié)晶體系置于15℃條件下靜置480h結(jié)晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)纖維素酶晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到如下結(jié)果：有18種結(jié)晶體系中出現(xiàn)了纖維素酶晶體，結(jié)晶成功率為18.75％。與現(xiàn)有的商業(yè)結(jié)晶板篩選結(jié)晶條件的結(jié)果相比，成功率提高了1.8倍。
實(shí)施例5：刀豆球蛋白結(jié)晶條件的篩選
第一步：PDMS芯片設(shè)計(jì)和制作：(1)PDMS芯片的設(shè)計(jì)：在PDMS芯片界面上設(shè)計(jì)一系列微柱陣列，每組陣列中，微柱在長度為5mm和寬度為5mm的區(qū)域內(nèi)緊密排列，陣列間距為1cm；微柱的直徑為35μm，微柱的高度為205μm，微柱的間距為100μm，(2)芯片及模板制備：a)準(zhǔn)備基片：用98％濃硫酸：雙氧水按照體積比3：1的比例配成的洗液清洗單拋硅片，清洗后的硅片用超純水沖洗，無水乙醇、丙酮依次浸泡1min后，再用超純水沖洗，200℃烘干硅片上的水分，得到用于光蝕刻的基片；b)鋪片：將陰性光刻膠倒在基片上，用涂膜儀涂布，形成均勻的光刻膠薄層，制備不同厚度的基片用于不同高度微柱的光刻；c)烘片：將制備好的基片置于電熱板上，65～95℃烘干；d)光刻：將烘干的基片在光刻機(jī)上曝光45s；e)顯影：用顯影劑對(duì)光刻處理的基片顯影3min，吹干備用，得到制作PDMS芯片的模板；(3)芯片制備：a)預(yù)處理：用三甲基氯硅烷(TMSCl)蒸汽熏模板3min，使PDMS聚合物更易與模板剝離；b)配制PDMS：按照體積比10:1稱取PDMS預(yù)聚物(A膠)和固化劑(B膠)，用混勻機(jī)混合均勻；c)脫氣：將混合均勻的PDMS混合物傾倒至模板上，抽真空脫氣至其中無氣泡；d)固化：放置于80℃烘箱中加熱，使其固化；e)制備覆蓋PDMS的結(jié)晶板：將固化好的PDMS放置于無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板表面，備用；
第二步：將美國Sigma公司的刀豆球蛋白按照終濃度為2mg/ml溶于pH為6，0.005M HEPES-Na緩沖液中，得到蛋白質(zhì)溶液；
第三步：本實(shí)施例用Hampton公司Crystal Screen和Crystal Screen 2試劑盒的98種結(jié)晶試劑篩選刀豆球蛋白晶體，將結(jié)晶試劑與刀豆球蛋白溶液按照體積比為40：1滴加在PDMS無凹槽密封的蛋白質(zhì)結(jié)晶板，得到蛋白質(zhì)結(jié)晶體系；
第四步：將整個(gè)結(jié)晶體系置于30℃條件下靜置168h結(jié)晶。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)刀豆球蛋白晶體的條件數(shù)目。
經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得到如下結(jié)果：有23種結(jié)晶體系中出現(xiàn)了刀豆球蛋白晶體，結(jié)晶成功率為23.96％。與現(xiàn)有的商業(yè)結(jié)晶板篩選結(jié)晶條件的結(jié)果相比，成功率提高了1.77倍。