本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地是涉及G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白。

背景技術(shù)：

G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPCR)是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，這類受體的共同點(diǎn)是每個(gè)受體結(jié)構(gòu)都包含七個(gè)α螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w分割為膜外N端(N-terminus)，膜內(nèi)C端(C-terminus)，3個(gè)膜外環(huán)(Loop)和3個(gè)膜內(nèi)環(huán)，受體的膜外部分常有糖基化修飾位點(diǎn)，其肽鏈的C端和連接第5和第6個(gè)跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)上共同構(gòu)成G蛋白(鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體已超過(guò)800個(gè)，這些G蛋白偶聯(lián)受體可以被劃分為六個(gè)類型，分別為:A類(或第一類)(視紫紅質(zhì)樣受體)；B類(或第二類)(分泌素受體家族)；C類(或第三類)(代謝型谷氨酸受體)；D類(或第四類)(真菌交配信息素受體)；E類(或第五類)(環(huán)腺苷酸受體)；F類(或第六類)(Frizzled/Smoothened家族)[Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.63(6):1256-1272,2003；and Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.67(5):1414-1425,2005]。分屬其中的G蛋白偶聯(lián)受體的基因序列之間沒(méi)有同源關(guān)系。

不同的G蛋白偶聯(lián)受體通過(guò)和相應(yīng)的G蛋白(G protein)偶聯(lián)可以對(duì)細(xì)胞外的多種刺激信號(hào)作出反應(yīng)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)傳遞、味覺(jué)、嗅覺(jué)、視覺(jué)及細(xì)胞的新陳代謝、分化、增殖、分泌等一系列生理效應(yīng)。

與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的疾病為數(shù)眾多，并且大約40％的現(xiàn)代藥物都以G蛋白偶聯(lián)受體作為靶點(diǎn)，上千種已上市藥物中接近一半是針對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體靶標(biāo)，作用于G蛋白偶聯(lián)受體的藥物對(duì)疼痛、認(rèn)知障礙、高血壓、胃潰瘍、鼻炎、哮喘等各類疾病均有良好的治療作用。

由于G蛋白偶聯(lián)受體在體內(nèi)具有重要的生理功能，對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)和功能研究一直是一個(gè)很重要的研究熱點(diǎn)。

然而，天然的G蛋白偶聯(lián)受體在體外并不穩(wěn)定，很難得到高純度的穩(wěn)定的天然G蛋白偶聯(lián)受體，近年來(lái)，有多個(gè)研究小組報(bào)道了不同的方法用于解決G蛋白偶聯(lián)受體的穩(wěn)定性，包括①.在G蛋白偶聯(lián)受體的膜內(nèi)環(huán)區(qū)3(ICL3)和N-末端插入大腸桿菌T4溶菌酶,這種技術(shù)先后成功應(yīng)用于腺苷A2a受體，CXCR4受體，b2腎上腺素能受體，D3多巴胺受體，S1P1受體等多個(gè)受體的研究中，通過(guò)用T4溶菌酶改造后，這些受體都能夠被很好地表達(dá)，得到了較高產(chǎn)率的蛋白，并最終得到了高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)[Rasmussen,S.G.F.et.al.Crystal structure of the human beta2adrenergic G-protein-coupled receptor,Nature 450:383-387,2007；Wu B.et.al.Structures of the CXCR4chemokine GPCR with small-molecule and cyclic peptide antagonists Science 330:1066-1071,2010.Chien,E.Y.et.al.Structure of the human dopamine D3receptor in complex with a D2/D3selective antagonist,Science 330:1091-1095,2010.Xu,F et.al.Structure of an agonist-bound human A2A adenosine receptor,Science 332:322-327,2011.and Hanson,M.A.et.al.Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor Science 335:851-855,2012.Zou,Y.et.al.N-terminal T4lysozyme fusion facilitates crystallization of a G protein coupled receptor Plos One 7:e46039-e460392012]；②.在G蛋白偶聯(lián)受體的膜內(nèi)環(huán)區(qū)3(ICL3)或N-末端插入細(xì)菌BriL蛋白，這種技術(shù)在腺苷A2a受體，nociceptin/orphanin FQ受體，5HT1b,5HT2b和SMO受體的結(jié)晶研究中獲得了成功[Liu,W.et.al.Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions,Science 337:232-236,2012.Thompson,A.A.et.al.Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic Nature 485:395-399,2012.Wang,C.et.al.Structural Basis for Molecular Recognition at Serotonin Receptors Science2013.Wang,C.Structure of the human smoothened 7TM receptor in complex with an antitumor agent Nature 2013]；③.通過(guò)對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行突變篩選，找到不影響結(jié)構(gòu)和功能但又能增加穩(wěn)定性的一些突變，從而在表達(dá)過(guò)程中得到穩(wěn)定的G蛋白偶聯(lián)受體,這個(gè)方法在腺苷A2a受體，b1腎上腺素能受體的研究中均獲得了成功，實(shí)現(xiàn)了受體蛋白的高表達(dá)，拿到了高純度的受體蛋白，并最終獲得了受體蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)[Lebon,G.et.al.Agonist-bound adenosine A2A receptor structures reveal common features of GPCR activation.Nature474:521,2011.Warne,A.et.al.Structure of a beta1-adrenergic G-protein-coupled receptor Nature 454:486,2008.]。④.利用抗體穩(wěn)定G蛋白偶聯(lián)受體構(gòu)象，利用這個(gè)技術(shù)斯坦福大學(xué)的Brain實(shí)驗(yàn)室成功得到了b2腎上腺素能受體的高分辨晶體結(jié)構(gòu)[Bokoch,M.P.Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor Nature 463:108-112,2010]。

由上可知，采用插入其它蛋白的方法來(lái)增加G蛋白偶聯(lián)受體的穩(wěn)定性的研究目前都集中在應(yīng)用原核蛋白和受體進(jìn)行融合表達(dá)，而沒(méi)有人研究來(lái)源于真核細(xì)胞蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體的融合表達(dá)。實(shí)際上，G蛋白偶聯(lián)受體基本都存在于真核生物中，因此，如果能夠找到一些來(lái)源于真核生物的蛋白來(lái)穩(wěn)定G蛋白偶聯(lián)受體或許對(duì)于G蛋白偶聯(lián)受體的某些功能研究具有一些額外的幫助。

另外，目前所廣泛應(yīng)用的融合表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體的思路是嘗試使用不同的融合蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體融合，最后篩選得到一個(gè)能夠較好表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體的蛋白，目前常用的幾種融合蛋白如Bril和T4L蛋白等能較好的解決一些G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)，但對(duì)有些G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)則幫助不大，需要探索新的融合蛋白。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了幾種新型的融合蛋白，可以被應(yīng)用于G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)，從而，為G蛋白偶聯(lián)受體的融合表達(dá)提供了更多的選擇和嘗試的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種來(lái)源于真核細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，即：APC、RGS16和DNJ蛋白片段及其成功的應(yīng)用于和G蛋白偶聯(lián)受體的融合表達(dá)。

本發(fā)明提供的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于：來(lái)源于真核生物，具體為APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白、RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白、DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白中的一種。

其中，APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID NO.4所示。

RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白,其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID NO.5所示。

DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90％的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID NO.6所示。

在本發(fā)明中，為了提高G蛋白偶聯(lián)受體穩(wěn)定性，通過(guò)對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行改造，在其N-末端，C-末端或膜內(nèi)環(huán)區(qū)3插入APC,RGS16和DNJ等蛋白片段片段構(gòu)建融合蛋白，從而解決了G蛋白偶聯(lián)受體穩(wěn)定性的問(wèn)題。

針對(duì)本發(fā)明主要涉及的三種蛋白片段，在本發(fā)明中，采用腺苷A2a蛋白與所述APC蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.10所示。

采用腺苷A2a蛋白與RGS16蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.11所示。

還采用腺苷A2a蛋白與DNJ蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.12所示。

其中，上述如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列可被應(yīng)用于A2a腺苷蛋白的表達(dá)。

上述如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的基因序列可被構(gòu)建到表達(dá)載體pFastBac1、PcDNA3.1、PET21b中進(jìn)行A2a腺苷蛋白的表達(dá)。

值得指出的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含APC,RGS16和DNJ等蛋白片段的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)質(zhì)粒，這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等，所構(gòu)建的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)基因序列可以有效地連接到不同表達(dá)載體的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。

另外，上述構(gòu)建好的質(zhì)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到細(xì)胞，如可以用Bac-to-Bac技術(shù)把含融合表達(dá)基因的PFastBac載體轉(zhuǎn)化到SF9細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的培養(yǎng)和病毒的收集和傳代等方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)。

此外，本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白既可以在昆蟲細(xì)胞如SF9、SF21、HiFive中表達(dá)，還可以在酵母中和哺乳動(dòng)物細(xì)胞如:293,CHO等細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，具有廣泛的應(yīng)用范圍。

發(fā)明的作用與效果

本發(fā)明提供了三種來(lái)源于真核生物的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白(即、APC,RGS16和DNJ蛋白片段)，并進(jìn)一步的提供這些真核生物蛋白的氨基酸序列和基因編碼序列等信息。

另外，本發(fā)明提供上述新型G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白在A2a腺苷受體的應(yīng)用，即、把上述APC,RGS16和DNJ等蛋白片段插入到G蛋白偶聯(lián)受體的不同區(qū)域(N-末端，C-末端或者膜內(nèi)環(huán)區(qū)3)構(gòu)建融合蛋白，并提供這些融合白的氨基酸序列和基因編碼序列等信息。

本發(fā)明通過(guò)把這些新型融合表達(dá)蛋白與G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行融合表達(dá)，從而達(dá)到增加G蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)產(chǎn)率及G蛋白偶聯(lián)受體的體外穩(wěn)定性。

此外，本發(fā)明所涉及的新型G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白可廣泛應(yīng)用于G蛋白偶聯(lián)受體的研究。在本發(fā)明中，構(gòu)建了一個(gè)A2a腺苷受體融合表達(dá)質(zhì)粒并提供了該融合表達(dá)質(zhì)粒在昆蟲SF9細(xì)胞中表達(dá)的方法。

附圖說(shuō)明

附圖1a為A2a-APC融合蛋白純化后的電泳檢測(cè)圖；

附圖1b為A2a-RGS16融合蛋白純化后的電泳檢測(cè)圖；

附圖1c為A2a-DNJ融合蛋白純化后的電泳檢測(cè)圖；

附圖2a為A2a-APC融合蛋白在底物Adenosine存在時(shí)的熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果；

附圖2b為A2a-RGS16融合蛋白在底物Adenosine存在時(shí)的熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果；

附圖2c為融合蛋白在底物Adenosine存在時(shí)的熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果；

附圖3a為A2a-APC融合蛋白的UPLC檢測(cè)圖譜；

附圖3b為A2a-RGS16融合蛋白的UPLC檢測(cè)圖譜；

附圖3c為A2a-DNJ融合蛋白的UPLC檢測(cè)圖譜。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：融合蛋白的基因合成

化學(xué)合成

(1)、APC蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸模板如SEQ ID NO.4所示。

(5’TCCACCGGCTACCTGGAGGAGCTGGAGAAGGAGCGCTCCCTGCTGCTGGCCGACCTGGACAAGGAGGAGAAGGAGAAGGACTGGTACTACGCCCAGCTGCAGAACCTGACCAAGCGCATCGACTCCCTGCCCCTGACCGAGAACTTCTCCCTGCAGACCGACATGACCCGCCGCCAGCTGGAGTACGAGGCCCGCCAGATCCGCGTGGCCATGGAGGAGCAGCTGGGCACCTGCCAGGACATGGAGAAGCGCGCCCAGCGCCGCATCGCCCGCATCCAGCAGATCGAGAAGGACATCCTGCGCATCCGCCAG3’)，

正向引物為:(5’TTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGTCCACCGGCTACCTGGAGG 3’)，

反向引物為：(5’CAGTGTGGACCGTGCCCGCTCCTGGCGGATGCGCAGGATGT 3’)，

用PCR反應(yīng)獲得APC蛋白片段基因。

參考人類基因密碼子，化學(xué)合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA 3’)，

正向引物(5’TATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGCGC CCATCATGGGCTCCTCGGT 3’)，

反向引物(5’CCTCCAGGTAGCCGGTGGACAGCTGTCGTCGCGCCG 3’)，

用PCR反應(yīng)獲得基因A2a(2-208)。

正向引物(5’GAGCGGGCACGGTCCACACT 3’)，

反向引物(5’TTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT 3’)，

用PCR反應(yīng)獲得基因A2a(219-316)。

A2a(2-208)-APC-A2a(219-316)參照以上原理進(jìn)行基因合成，正向引物引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點(diǎn)XhoI和終止密碼子。(2)、RGS16蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸模板如SEQ ID NO.5所示。

(5’AACTTCTCCGAGGACGTGCTGGGCTGGCGCGAGTCCTTCGACCTGCTGCTGTCCTCCAAGAACGGCGTGGCCGCCTTCCACGCCTTCCTGAAGACCGAGTTCTCCGAGGAGAACCTGGAGTTCTGGCTGGCCTGCGAGGAGTTCAAGAAGATCCGCTCCGCCACCAAGCTGGCCTCCCGCGCCCACCAGATCTTCGAGGAGTTCATCTGCTCCGAGGCCCCCAAGGAGGTGAACATCGACCACGAGACCCACGAGCTGACCCGCATGAACCTGCAGACCGCCACCGCCACCTGCTTCGACGCCGCCCAGGGCAAGACCCGCACCCTGATGGAGAAGGACTCCTACCCCCGCTTCCTGAAGTCCCCCGCCTACCGCGACCTGGCCGCCCAGGCCTCCGCCGCCTCC3’)，

正向引物為:(5’GAGAACCTGTACTTCCAATCCAACTTCTCCGAGGACGTGCT3’)，

反向引物為：(5’ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGGAGGCGGCGGAGGCCTG3’)，

用PCR反應(yīng)獲得RGS16蛋白片段基因。

參考人類基因密碼子，化學(xué)合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA 3’)，

正向引物(5’CCCATCATGGGCTCCTCGGT3’)，

反向引物(5’TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGA TGTGCCTT 3’)，

用PCR反應(yīng)獲得基因A2a(2-316)。

RGS16(54-188)-A2a(2-316)參照以上原理進(jìn)行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點(diǎn)XhoI和終止密碼子。(3)、DNJ蛋白片段其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸模板如SEQ ID NO.6所示。

(5’GGCTACTACGACGTGCTGGGCGTGAAGCCCGACGCCTCCGACAACGAGCTGAAGAAGGCCTACCGCAAGATGGCCCTGAAGTTCCACCCCGACAAGAACCCCGACGGCGCCGAGCAGTTCAAGCAGATCTCCCAGGCCTACGAGGTGCTGTCCGACGAGAAGAAGCGCCAGATCTACGACCAGGGCGGC3’)，

正向引物為:(5’GAGAACCTGTACTTCCAATCCGGCTACTACGACGTGCTGG3’)，

反向引物為：(5’ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGCCGCCCTGGTCGTAGATC3’)，

用PCR反應(yīng)獲得DNJ蛋白基因。

參考人類基因密碼子，化學(xué)合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA 3’)，

正向引物(5’CCCATCATGGGCTCCTCGGT3’)，

反向引物(5’TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT 3’)，

用PCR反應(yīng)獲得基因A2a(2-316)。

DNJ(6-68)-A2a(2-316)參照以上原理進(jìn)行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點(diǎn)XhoI和終止密碼子。

其中，PCR反應(yīng)條件為：在50μL反應(yīng)體系中(PCR Buffer,1.5mM MgSO4,200μM dNTPs)加入擴(kuò)增引物各0.2μM。充分混勻后開(kāi)始PCR循環(huán):94℃變性5分鐘，94℃變性30秒，55℃退火30秒，68℃延伸2分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán),最后在68℃保溫10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收后用于克隆。

實(shí)施例2：本發(fā)明融合蛋白質(zhì)粒構(gòu)建

將實(shí)施例1中獲得的PCR片段與經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切的載體pFastBac1(購(gòu)自Invitrogen)進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞的10％，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物，冰浴30分鐘，將管放入42℃水浴，定時(shí)60秒熱休克，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴120秒，使細(xì)胞冷卻，每管加入400μl LB培養(yǎng)基,37℃緩搖60分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因,低速離心2分鐘，去上清，留約100μl培養(yǎng)基在離心管內(nèi)，重懸菌體，用玻璃鋪菌器將菌液在瓊脂板上鋪勻。將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。涂板后挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定。

實(shí)施例3：本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)

將實(shí)施例2中獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10Bac E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，體積不應(yīng)該超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞的5％，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物。冰浴30分鐘；將管放入42℃水浴，定時(shí)90秒熱休克；快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴120秒，使細(xì)胞冷卻；每管加入800ulLB培養(yǎng)基，37℃，緩搖4小時(shí)，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素標(biāo)記基因；用玻璃鋪菌器將30ul菌液在抗性瓊脂板上鋪勻；將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，30-48小時(shí)后可出現(xiàn)藍(lán)白斑菌落；挑取陽(yáng)性白斑單菌落接入5ml抗性LB，緩搖12-16h，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示桿粒重組正確。將重組桿粒經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞中，4-5天后收取細(xì)胞上清液作為第一代桿狀病毒。用第一代桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞72小時(shí)后，獲得第二代病毒，用于組合多肽的表達(dá)；使用第二代病毒1:100體積比感染密度為2x10^6/ml的昆蟲細(xì)胞sf9，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，離心收細(xì)胞，PBS洗一遍細(xì)胞。

實(shí)施例4：融合蛋白純化

用200ml預(yù)冷的裂解液(10mM HEPES pH7.5,10mM MgCl₂,20mMKCl)重懸1L細(xì)胞到200ml中，用勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿，勻漿后用超速離心機(jī)離心45分鐘，去掉上清，重復(fù)洗滌步驟3次,再用高鹽溶液重復(fù)洗滌步驟三次，提取好的細(xì)胞膜用加甘油的裂解液溶解并用液氮進(jìn)行速凍，儲(chǔ)存在-80C冰箱。在冰上融化解凍細(xì)胞膜，并入茶堿和碘乙酰胺分別至終濃度為4mM，2mg/ml，在冰上放置30分鐘后按照每升細(xì)胞膜加入100ml溶膜緩沖液比例加入溶膜緩沖液，并繼續(xù)在冰上放置3小時(shí)溶膜，用超速離心機(jī)在160,000g離心力下離心40分鐘，棄掉沉淀，上清與1ml用平衡緩沖液平衡好的Talon IMAC resin一起孵育過(guò)夜，次日，棄上清，加入適量平衡緩沖液重懸填料，將填料轉(zhuǎn)移到自流柱里。依次用沖洗緩沖液1(25mMHepes pH7.5；800mMNaCl；10％glycerol；0.05％DDM；0.001％CHS；4mM theophylline)洗10個(gè)柱體積，沖洗緩沖液2(25mMHepes pH7.5；800mMNaCl；10％glycerol；4mM theophylline；0.05％DDM；0.001％CHS；25mM Imid；10mM MgCl₂；8mM ATP)洗10個(gè)柱體積，沖洗緩沖液3(25mMHepes pH7.5；800mMNaCl；10％glycerol；4mM theophylline；0.05％DDM；0.001％CHS；10mM MgCl2；10mM ATP)洗5個(gè)柱體積，然后用5個(gè)柱體積的洗脫緩(緩沖液1加入300mM咪唑)沖液洗脫目的蛋白，純化后得到的目的蛋白保存在-80℃，圖1為三種融合蛋白的電泳檢測(cè)結(jié)果。

從得率來(lái)看，經(jīng)純化后3種膜蛋白的得率都超過(guò)1mg/L細(xì)胞，具有較高的產(chǎn)率。

實(shí)施例5：融合蛋白熱穩(wěn)定性測(cè)試

打開(kāi)Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)，預(yù)熱30分鐘，吸取130ul蛋白溶液，加入0.13ul的CPM熒光染料，充分混勻，將混勻好的樣品，加入到石英比色皿，放入樣品架。啟動(dòng)Cary Eclipse軟件組中的Thermal程序，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)(387nm)，光柵縫隙為2.5nm；吸收波長(zhǎng)(463nm)，光柵縫隙為5nm，從20℃至90℃每分鐘上升1℃，運(yùn)行程序，導(dǎo)出測(cè)量數(shù)據(jù)，用軟件進(jìn)行Sigmanoid擬合，計(jì)算樣品的Tm值。

按照上述步驟方法，分別檢測(cè)了三種融合蛋白在和A2a腺苷受體相結(jié)合之后的熱穩(wěn)定性值，其結(jié)果如圖2所示。

由圖可知，A2a-APC融合蛋白，其Tm值為50.8℃；A2a-RGS16融合蛋白，其Tm值為55.6℃；A2a-DNJ融合蛋白，其Tm值為52℃。

3個(gè)融合蛋白和A2a腺苷受體相結(jié)合以后的熱穩(wěn)定性值都超過(guò)了50℃，說(shuō)明三種蛋白都具有較好的熱穩(wěn)定性。

實(shí)施例6：融合蛋白均一性檢測(cè)

采用Waters公司的Acquity H-Class Bio UPLC系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)所用柱子為Sepax SEC250分子篩柱，上樣前先用平衡緩沖液(25mM HEPES,500mM NaCl,2％glycerol,0.05DDM,0.01％CHS,pH 7.5)洗柱子至基線沒(méi)有太大變化止，然后將待檢測(cè)的樣品加入專用的96孔板中上樣，積分處理采用儀器自帶的軟件。

按照上述方法對(duì)三種融合蛋白分別進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，三種融合蛋白均一性都很好，能夠檢測(cè)到融合蛋白單體峰，且單體占蛋白樣品的大部分。