本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法、引物及試劑盒。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)隸屬于葡萄球菌屬，菌體球形，是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。金黃色葡萄球菌是人類化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全身感染。同時(shí)其產(chǎn)生的腸毒素可污染食物而致食物中毒，為人類帶來(lái)非常嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。因此，對(duì)于該菌的預(yù)防和檢測(cè)非常重要。

目前，國(guó)際上對(duì)金黃色葡萄球菌的檢測(cè)普遍采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，但檢測(cè)周期較長(zhǎng)，操作相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)效率較低，難以滿足現(xiàn)代社會(huì)對(duì)于食源性致病菌檢測(cè)過(guò)程高通量、高靈敏度、高特異性、快速、便捷的要求。近年來(lái)隨著核酸分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，研究人員陸續(xù)開(kāi)發(fā)出了PCR和熒光PCR技術(shù)的檢測(cè)手段，但是這兩種方法需要專門的檢測(cè)儀器，因此，并不適合廣泛應(yīng)用于基層檢測(cè)部門尤其是企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部進(jìn)行的實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。為確保食品安全，急需快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確的方法來(lái)檢測(cè)食品中的金黃色葡萄球菌。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新型恒溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物(包括上下游外引物F3和B3以及上下游內(nèi)引物FIP和BIP，其中FIP由F1C和F2組成，BIP由B1C和B2組成)，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件保溫約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的反應(yīng)副產(chǎn)物-白色焦磷酸鎂沉淀(見(jiàn)文獻(xiàn)Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T,Watanabe K,Amino N,Hase T.Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,2000Jun 15；28(12):E63)。該技術(shù)具有不需要PCR儀或熒光定量PCR儀、恒溫下即可完成，肉眼即可判斷反應(yīng)結(jié)果，以及靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

引物設(shè)計(jì)是LAMP技術(shù)中最為關(guān)鍵的一步，常規(guī)做法是將某待檢測(cè)生物的公認(rèn)的特異性基因?qū)隠AMP引物設(shè)計(jì)的在線網(wǎng)站(http://primerexplorer.jp/e)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)生成引物組。也就是說(shuō)，用戶首先必須確保該靶基因?yàn)榇郎y(cè)物種的特異序列。以發(fā)明專利CN 101701252 B和CN 101880711 A為例，它們分別針對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的金黃色葡萄球菌的特異基因——nuc基因和clfA基因，采用LAMP技術(shù)進(jìn)行金黃色葡萄球菌檢測(cè)。然而，所謂“公認(rèn)的特異性基因”往往基于滯后的知識(shí)，并未基于不斷增長(zhǎng)的微生物基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的更新，導(dǎo)致基于該靶基因序列獲得的引物在實(shí)際應(yīng)用中不一定能確保其通用性和/或特異性。本發(fā)明用表1展示了現(xiàn)有技術(shù)中存在的通用性不能確保的問(wèn)題。也就是說(shuō)，現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的金黃色葡萄球菌檢測(cè)序列實(shí)際上并非金黃色葡萄球菌所共有，即，有可能漏檢金黃色葡萄球菌的部分菌株。類似的問(wèn)題也存在于特異性的確認(rèn)，即，有可能將非金黃色葡萄球菌錯(cuò)誤地認(rèn)定為金黃色葡萄球菌。因此，行業(yè)內(nèi)亟需一種能夠確保特異性和通用性的金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法，同時(shí)滿足基層檢測(cè)部門對(duì)快速、便捷的需求，能夠方便地在企業(yè)生產(chǎn)線內(nèi)部開(kāi)展實(shí)時(shí)實(shí)地檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服現(xiàn)有LAMP技術(shù)引物設(shè)計(jì)中存在的引物通用性和特異性不足的缺陷，充分利用目前公共數(shù)據(jù)資源中豐富的微生物基因組序列信息以及相應(yīng)的序列分析工具，設(shè)計(jì)用于特異性識(shí)別金黃色葡萄球菌的引物組，并在此基礎(chǔ)上形成高靈敏度、高特異性檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明基于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的微生物基因組數(shù)據(jù)資源(截至2013年8月5日數(shù)據(jù))進(jìn)行金黃色葡萄球菌LAMP引物的設(shè)計(jì)，提供了一種快速恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法、引物組及試劑盒。采用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌，具有高靈敏度和高特異性，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果判定簡(jiǎn)單，操作便捷，成本低的優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明提出一種快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌株的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA；

(2)以所述基因組DNA為模板，以能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列的引物組為引物，在酶反應(yīng)體系下，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)；

(3)通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在金黃色葡萄球菌。

本發(fā)明恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌株的方法，從待測(cè)樣品中提取基因組DNA，以其為模板，以金黃色葡萄球菌特異性擴(kuò)增引物組為引物，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，然后，通過(guò)判斷反應(yīng)結(jié)果是否為陽(yáng)性，確定待測(cè)樣品中是否存在金黃色葡萄球菌。其中，所述酶反應(yīng)體系包括但不限于DNA聚合酶反應(yīng)體系。

本發(fā)明中，所述金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列為GI號(hào)為148266447的金黃色葡萄球菌的720465～720702bp位序列。

本發(fā)明中，所述能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列的引物組為所述基因組(GI號(hào)為148266447)的720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分。其中，所述金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列是指僅為金黃色葡萄球菌基因組所特有的，而其它微生物基因組所不包含的堿基序列。

其中，所述能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異堿基序列的引物組包括但不限于引物組A，或選自與該引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為83％及以上的引物組之任意一組。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQ ID NO：1)；

下游外引物B3_A：5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’(SEQ ID NO：2)；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-CATACCACTTTTGCATCAAGCTTGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQ ID NO：4)。

本發(fā)明中，所述能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異堿基序列的引物組還可以包括與前述各引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為83％及以上的引物組，該引物組包括但不限于以下引物組B：

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GATTGGACAACTGTTCTCC-3’(SEQ ID NO：6)(與引物B3_A 5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’同源性83％)；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GGCATACCACTTTTGCATCAATGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQ ID NO：8)。

本發(fā)明方法中，在一具體實(shí)施方案中，所述恒溫?cái)U(kuò)增的酶反應(yīng)體系為：1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L甜菜堿。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明方法中，所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)棰?0～65℃孵育10～90min，優(yōu)選地為10～60min；②80℃終止反應(yīng)2～20min。本發(fā)明不限制通過(guò)其他適宜反應(yīng)程序來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明檢測(cè)方法。

本發(fā)明方法中，檢測(cè)方法包括但不限于電泳檢測(cè)、濁度檢測(cè)或顯色檢測(cè)等。所述電泳檢測(cè)，優(yōu)選為凝膠電泳檢測(cè)法，可以是瓊脂糖凝膠，也可以是聚丙烯酰胺凝膠。電泳檢測(cè)結(jié)果中，如電泳圖呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測(cè)樣品呈金黃色葡萄球菌陽(yáng)性，含有金黃色葡萄球菌；如電泳圖不呈現(xiàn)特征性階梯狀條帶，則待測(cè)樣品呈金黃色葡萄球菌陰性。所述濁度檢測(cè)，是用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)濁度，檢測(cè)管出現(xiàn)明顯混濁，則待測(cè)樣品呈金黃色葡萄球菌陽(yáng)性，含有金黃色葡萄球菌；如未見(jiàn)混濁，則待測(cè)樣品為金黃色葡萄球菌陰性。也可以經(jīng)離心后肉眼觀察反應(yīng)管底是否有沉淀，若反應(yīng)管底有沉淀，則待測(cè)樣品呈金黃色葡萄球菌陽(yáng)性，含有金黃色葡萄球菌；如反應(yīng)管底沒(méi)有沉淀，則待測(cè)樣品呈金黃色葡萄球菌陰性。

所述顯色檢測(cè)，是在反應(yīng)管中加入顯色劑，包括但不限于鈣黃綠素(50μM)或SYBR Green I(30-50×)，或羥基萘酚藍(lán)(即HNB，120-150μM)。當(dāng)采用鈣黃綠素或SYBR Green I作為顯色劑時(shí)，如反應(yīng)后顏色為橙色，則待測(cè)樣品為金黃色葡萄球菌陰性；如反應(yīng)后顏色為綠色，則待測(cè)樣品為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性，含有金黃色葡萄球菌。當(dāng)采用羥基萘酚藍(lán)作為顯色劑時(shí)，如反應(yīng)后顏色為紫羅蘭色，則待測(cè)樣品為金黃色葡萄球菌陰性；如反應(yīng)后顏色為天藍(lán)色，則待測(cè)樣品為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性。所述顯色檢測(cè)，除了上述通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果外，也可以通過(guò)檢測(cè)儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)或終點(diǎn)檢測(cè)反應(yīng)結(jié)果，通過(guò)合理的設(shè)定陰性反應(yīng)的閾值，當(dāng)待測(cè)樣品反應(yīng)的結(jié)果低于或等于該閾值時(shí)，則待測(cè)樣品為金黃色葡萄球菌陰性；當(dāng)待測(cè)樣品反應(yīng)的結(jié)果大于該閾值時(shí)，則待測(cè)樣品為金黃色葡萄球菌陽(yáng)性。所述檢測(cè)儀器包括但不限于熒光分光光度計(jì)、熒光定量PCR儀、恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀和Genie II等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)等。

所述顯色檢測(cè)中，若采用鈣黃綠素或羥基萘酚藍(lán)作為顯色劑，可以在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前加入，也可以在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)完成之后加入，優(yōu)選地為恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)之前加入，可以有效的減少反應(yīng)污染的可能性。若采用SYBR Green I作為顯色劑，則在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)完成之后加入。若采用鈣黃綠素作為顯色劑，則在酶反應(yīng)體系中加入50μM鈣黃綠素的同時(shí)，加入0.6-1mM[Mn²⁺]，例如，0.6-1mM的MnCl₂。

本發(fā)明還提供了用于恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌株的方法中的引物。所述引物包括能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異堿基序列的引物組，其包括但不限于，所述引物的序列為GI號(hào)為148266447的金黃色葡萄球菌基因組的720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分。

其中，所述能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列的引物組選自以下各引物組之任意一組，或選自與所述各引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為83％及以上的任一引物組。其中，所述引物組包括但不限于以下引物組A。所述與前述引物組序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為83％及以上的引物組包括但不限于以下引物組B。

引物組A：

上游外引物F3_A：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’；

下游外引物B3_A：5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’；

上游內(nèi)引物FIP_A：5’-CATACCACTTTTGCATCAAGCTTGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’；

下游內(nèi)引物BIP_A：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’。

引物組B：

上游外引物F3_B：5’-TGTGGCTTAAGGATCTATGG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游外引物B3_B：5’-GATTGGACAACTGTTCTCC-3’(SEQ ID NO：6)(與引物B3_A 5’-GGACAACTGTTCTCCCTA-3’同源性83％)；

上游內(nèi)引物FIP_B：5’-GGCATACCACTTTTGCATCAATGTTTACTTTGATAGGCCAG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游內(nèi)引物BIP_B：5’-CGTTCAAAGGAAAGGGGCATGACTTTTAGCATAGCTGGTT-3’(SEQ ID NO：8)。

本發(fā)明還提供一種用于上述恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌株方法中的試劑盒，其包括所述能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異堿基序列的引物組。本發(fā)明試劑盒中，所述能擴(kuò)增金黃色葡萄球菌基因組特異性堿基序列的引物組，包括但不限于以基因組(GI號(hào):148266447)的720465～720702bp位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈的一部分作為所述引物序列；所述引物包括但不限于所述引物組A。還包括但不限于以與前述引物序列或其互補(bǔ)鏈序列中單條序列同源性為83％及以上的引物組作為引物；包括但不限于引物組B。

本發(fā)明試劑盒中，還包括Bst DNA聚合酶緩沖液、Bst DNA聚合酶、dNTP溶液、Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)和甜菜堿中的一種或多種。在一具體實(shí)施方案中，本發(fā)明試劑盒酶反應(yīng)體系包含1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液，2-9mmol/L Mg²⁺(MgSO₄或MgCl₂)，1.0-1.6mmol/L dNTP，0.8-2.0μmol/L的FIP和BIP引物，0.15-0.3μmol/L的F3和B3引物，0.16-0.64U/μL Bst DNA聚合酶和0-1.5mol/L的甜菜堿。例如，1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液可以選用1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，包含20mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)，10mmol/L KCl，10mmol/L(NH4)₂SO4，0.1％Triton X-100，2mM MgSO₄。1×Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液中的MgSO₄和酶反應(yīng)體系中的鎂離子Mg²⁺做合并處理。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陽(yáng)性對(duì)照模板。在一具體實(shí)施方案中，所述陽(yáng)性對(duì)照模板包括但不限于金黃色葡萄球菌的全基因組DNA、部分基因組DNA，或包含金黃色葡萄球菌全基因組DNA或部分基因組DNA的載體。

本發(fā)明試劑盒中，還包含陰性對(duì)照模板，所述陰性對(duì)照模板包括但不限于雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含顯色劑，顯色劑包括但不限于鈣黃綠素，SYBR Green I或羥基萘酚藍(lán)。當(dāng)顯色劑為鈣黃綠素時(shí)，試劑盒中還包含[Mn²⁺]，例如，MnCl₂。

本發(fā)明試劑盒中，還包含雙蒸水。

本發(fā)明試劑盒中，還包含核酸抽提試劑。

本發(fā)明還提出了一種載體，所述載體包含選自引物組A、B之任意一組引物。該載體由于包含了具有金黃色葡萄球菌特異性的DNA序列，因此可應(yīng)用于微生物分類學(xué)、比較基因組學(xué)、進(jìn)化等研究領(lǐng)域，以及微生物檢測(cè)等應(yīng)用領(lǐng)域。該載體可以是但不限于質(zhì)粒載體(如pBR322、pUC18、pUC19、pBluescript M13、Ti質(zhì)粒等)、病毒載體(如λ噬菌體等)和人造染色體載體(如細(xì)菌人造染色體BAC、酵母人造染色體YAC等)。例如，包含引物組A之任意一條引物的載體pBR322-A、包含引物組B之任意一條引物的載體pBR322-B等。包含引物組A之任意一條引物的載體λ噬菌體-A、包含引物組B之任意一條引物的載體λ噬菌體-B等。

本發(fā)明還提出了選自引物組A、B之任意一組的引物在恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述試劑盒在恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提出了所述載體在恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明為食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域提供了一種簡(jiǎn)單快速靈敏的檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法、引物/引物組、檢測(cè)試劑/試劑盒，對(duì)我國(guó)的食品安全具有較大意義。本發(fā)明有益效果包括：采用本發(fā)明金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、結(jié)果判定簡(jiǎn)單、操作便捷、成本低等優(yōu)點(diǎn)。與目前常用檢測(cè)方法相比，本發(fā)明采用的恒溫?cái)U(kuò)增法，可以在恒溫條件下進(jìn)行，只需采用簡(jiǎn)單的恒溫裝置，不需要PCR實(shí)驗(yàn)中的昂貴儀器，不需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)等步驟，因而，非常適于廣泛應(yīng)用于社會(huì)各界包括基層食品安全檢測(cè)部門推廣使用，即使在分子生物學(xué)專業(yè)知識(shí)和技能基礎(chǔ)相對(duì)不足的環(huán)境下也可充分應(yīng)用?；诒绢I(lǐng)域常識(shí)可將上述各優(yōu)選條件進(jìn)行任意組合，均屬本發(fā)明保護(hù)范圍。

附圖說(shuō)明

圖1表明本發(fā)明實(shí)施例7金黃色葡萄球菌恒溫檢測(cè)方法的特異性。

圖2表明本發(fā)明實(shí)施例8金黃色葡萄球菌檢測(cè)方法的靈敏度。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書(shū)為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。

實(shí)施例1-6金黃色葡萄球菌恒溫反應(yīng)體系和檢測(cè)方法

按照以下(1)～(3)步驟進(jìn)行檢測(cè)：

(1)基因組DNA的提取

用于檢測(cè)的金黃色葡萄球菌菌種來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)CICC21600(ATCC27217)。取1mL細(xì)菌培養(yǎng)物使用北京天根生物工程公司的細(xì)菌核酸提取試劑盒提取基因組DNA，DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀為1.8，濃度為50.4ng/μL。

(2)以待測(cè)金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，分別采用自配的試劑盒(見(jiàn)表2，表3)，并按照表3中所述條件，配制反應(yīng)體系，以金黃色葡萄球菌特異性擴(kuò)增引物組為引物，進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。實(shí)施例1～6中的引物分別為引物組A，A，A，B，B，B。

(3)按照表3中所述條件，通過(guò)電泳檢測(cè)、濁度檢測(cè)或顯色檢測(cè)，進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果確認(rèn)。

由表3可以看出，本發(fā)明檢測(cè)方法及其所采用的引物組及反應(yīng)體系能夠很好地對(duì)金黃色葡萄球菌特異性片段進(jìn)行擴(kuò)增并得到檢測(cè)結(jié)果。因此，本發(fā)明可以應(yīng)用于檢測(cè)樣本中是否含有金黃色葡萄球菌。

實(shí)施例7金黃色葡萄球菌特異性檢測(cè)

收集非金黃色葡萄球菌28株(表4和圖1中的3～30)，將這些菌株與金黃色葡萄球菌菌株(表4和圖1中的1和2)分別進(jìn)行培養(yǎng)，取1mL菌液，采用試劑盒IA，提取細(xì)菌DNA，并參照實(shí)施例1的反應(yīng)體系和條件，分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增(引物組為A)和加入顯色劑觀察。

其檢測(cè)結(jié)果如表4和圖1所示，圖1中，3～30分別為表皮葡萄球菌、馬紅球菌、蠟樣芽孢桿菌、蕈樣芽孢桿菌、單核增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、伊氏李斯特菌、腸沙門氏菌腸亞種、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、鮑氏志賀氏菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌(含肉毒梭菌A型基因)、致病性大腸埃希氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌、出血性大腸埃希氏菌、阪崎克羅諾桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核耶爾森氏菌、創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌、弗氏弧菌、霍亂弧菌和宋氏志賀氏菌，NTC：陰性對(duì)照，1～2分別為金黃色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌金黃亞種。圖1中，僅有金黃色葡萄球菌菌株擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽(yáng)性結(jié)果，如第1～2號(hào)管所示。而其他非金黃色葡萄球菌菌株及陰性對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物均呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果，如第3～30號(hào)管以及NTC陰性對(duì)照管所示。

由圖1和表4結(jié)果可以看出，本發(fā)明檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法具有良好的金黃色葡萄球菌菌株特異性，即，只有金黃色葡萄球菌菌株擴(kuò)增陽(yáng)性，其他非金黃色葡萄球菌菌株為陰性。

配制檢測(cè)試劑盒，試劑盒中采用的引物為引物組B，按上述特異性檢測(cè)方法，得到同樣的檢測(cè)結(jié)果，即，非金黃色葡萄球菌菌株及陰性對(duì)照擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陰性結(jié)果，金黃色葡萄球菌菌株擴(kuò)增反應(yīng)后的產(chǎn)物為陽(yáng)性結(jié)果。

此外，按照表1中所述方法，分別對(duì)引物組A～B的特異性進(jìn)行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在各條引物最多允許三個(gè)錯(cuò)配的情況下，各引物組最多有一條引物比對(duì)到非金黃色葡萄球菌上，表明各引物組的特異性均較好。

實(shí)施例8靈敏度檢測(cè)

按實(shí)施例2的方法提取細(xì)菌CICC 21600的DNA，采用試劑盒IIB，并按照500pg、50pg、5pg、500fg、50fg DNA梯度加入反應(yīng)體系，其他反應(yīng)條件參照表3實(shí)施例2的方法分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增(引物組為A)和加入顯色劑觀察。如圖2所示，1-5分別為500pg、50pg、5pg、500fg、50fg，NTC：陰性對(duì)照。圖2中500pg、50pg、5pg處理的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為亮綠色，為陽(yáng)性結(jié)果，500fg、50fg處理和陰性對(duì)照的反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)為橙色，為陰性結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果表明，每個(gè)反應(yīng)管中最低含5pg(約相當(dāng)于1500個(gè)細(xì)菌)的DNA時(shí)可被檢出。

按上述檢測(cè)方法，其他步驟及條件同上，用引物組B，每個(gè)反應(yīng)管中低至5pg～500fg的DNA仍可被檢出，檢測(cè)靈敏度較高。

實(shí)施例9通用性檢測(cè)

按照表1中所述方法，分別對(duì)引物組A～B的通用性進(jìn)行理論分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各引物組的引物區(qū)域與數(shù)據(jù)庫(kù)中43株金黃色葡萄球菌中的42株完全匹配，與另一株(GI＝514064966)也僅有一個(gè)錯(cuò)配，理論上可以用于上述43株金黃色葡萄球菌菌株的檢測(cè)，表明各引物組的通用性均較好。

表1金黃色葡萄球菌的現(xiàn)有檢測(cè)方法中引物的通用性和特異性分析

注：a)將專利中引物F3和B3間的序列與金黃色葡萄球菌的43個(gè)全基因組進(jìn)行Bowtie比對(duì)，確定檢測(cè)區(qū)域在GI號(hào)148266447基因組中的位置。b)將檢測(cè)區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源中進(jìn)行Blast比對(duì)，引物區(qū)域完全匹配為通用性好。本表中僅列出了在三個(gè)基因組上進(jìn)行通用性分析的結(jié)果。c)將檢測(cè)區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源中進(jìn)行Blast比對(duì)，引物區(qū)域匹配程度越高，特異性越差；不能同時(shí)比對(duì)到非金黃色葡萄球菌上，表明特異性好。

表2恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌的試劑盒種類及主要組成成分

表3實(shí)施例1-6本發(fā)明恒溫檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法中的反應(yīng)條件及檢測(cè)結(jié)果

表4試驗(yàn)所用菌株及檢測(cè)結(jié)果

注：a)CGMCC：中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，CICC：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CMCC：中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。b)+：陽(yáng)性結(jié)果，-：陰性結(jié)果。