本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于II型糖尿病易感基因檢測的SNP分型試劑盒及其使用方法。

背景技術：

非傳染性疾病(non-communicable diseases，NCD)是當前世界上最主要的死亡原因，主要包括糖尿病(diabetes mellitus，DM)、腫瘤、心血管疾病等。每年全球所發(fā)生的死亡中，有63％是由NCD所導致的。糖尿病是當前威脅全球人類健康的最重要的NCD之一，是以高血糖為主要特征，伴有脂肪、蛋白質代謝紊亂等的一組慢性內分泌代謝疾病，具有遺傳易感性。

近30年來，我國糖尿病患病率顯著增加。目前，我國糖尿病患者高達1.14億，占全球的1/3，意味著全球每3個糖尿病患者中就有1個來自中國。糖尿病不是單一疾病，是由遺傳及環(huán)境因素在內的多種因素共同作用的結果。II型糖尿病(T2DM)是成人發(fā)病型糖尿病，多在35～40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90％以上。II型糖尿病有更強的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質性。目前認為發(fā)病原因是胰島素抵抗(主要表現(xiàn)為高胰島素血癥；葡萄糖利用率降低)和胰島素分泌不足的合并存在，其表現(xiàn)是不均一的，有的以胰島素抵抗為主伴有胰島素分泌不足，有的則是以胰島素分泌不足伴有胰島素抵抗。近年來的研究表明，遺傳因素在II型糖尿病的發(fā)生中起重要作用，其發(fā)病機制呈家族聚集性，約60％的患者有家族遺傳史。但糖尿病易感基因的遺傳很復雜，它并不簡單的遵循孟德爾顯性和隱形遺傳法則，而是呈復雜遺傳模式，即多個基因變異與環(huán)境因素的影響共同決定疾病的易感性。目前，全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)已鑒定出69個II型糖尿病的易感基因(Nature Genetics，2014)，這些基因分別在胰島β細胞生長、發(fā)育及功能維持，以及外周胰島素抵抗等方面扮演重要角色。

隨著單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)技術的快速發(fā)展，以SNP作為遺傳圖譜用于疾病易感基因的定位成為目前的研究趨勢。ARMS技術的原理是在DNA序列一端的突變處設計兩個引物，突變位點位于引物的3’末端，一個相應于正常等位基因序列引物，一個相應于突變基因序列引物，再在DNA另一端設計一個共用引物，從而用PCR對突變基因進行檢測。目前，用于II型糖尿病易感基因檢測的方法主要集中于探針法、熒光定量PCR法、高分辨率溶解曲線(HRM)以及測序法等，上述方法雖然在某種程度上能完成對SNP的檢測，但存在一些不足，主要表現(xiàn)為檢測過程繁瑣，檢測所用時間長，試劑昂貴等，從而不利于在生產中推廣應用。例如，中國專利申請?zhí)枴?01510428933.5”、“可用于檢測與II型糖尿病相關的PTPN1基因啟動子區(qū)甲基化程度的試劑盒及其應用”，具體涉及焦磷酸測序技術，該方法雖只需一次PCR擴增，但測序步驟繁瑣、耗時長，不利于批量檢測。ARMS-PCR是一種在PCR基礎上發(fā)展起來用于檢測DNA中各種點突變的新方法。ARMS-PCR和熒光凝膠電泳技術的結合具有諸多的檢測優(yōu)勢，例如：檢測位點數(shù)量多、靈敏度高、經濟高效、耗時短和通量高等。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述技術問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于II型糖尿病易感基因檢測的SNP分型試劑盒，該試劑盒具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、成本低、通量高可實現(xiàn)批量檢測等諸多優(yōu)點，該試劑盒不僅可以快速檢測出待測者的II型糖尿病的易感基因型，同時檢測結果還可以用于II型糖尿病的輔助診斷和預防。

本發(fā)明的技術方案如下：

一種用于II型糖尿病易感基因檢測的SNP分型試劑盒，包括6個易感基因的7個SNP位點的引物；所述6個易感基因的7個SNP位點分別為：

TCF7L2基因的RS7903146位點；

SLC6A20基因的RS13062383位點；

GCKR基因的RS780094位點和RS3817588位點；

觀察脂聯(lián)素基因的RS2241766位點；

GRK5基因的RS10886471位點；

RASGRP1基因的RS7403531位點。

優(yōu)選地，所述引物是分為兩組進行標記的。

優(yōu)選地，所述6個易感基因的7個SNP位點的引物序列分別為：

RS10886471，正向引物SEQ ID NO.1-2，反向共用引物，SEQ ID NO.3；

RS13062383，正向引物SEQ ID NO.4-5，反向共用引物，SEQ ID NO.6；

RS780094，正向引物SEQ ID NO.7-8，反向共用引物，SEQ ID NO.9；

RS7903146，正向引物SEQ ID NO.10-11，反向共用引物，SEQ ID NO.12；

RS3817588，正向引物SEQ ID NO.13-14，反向共用引物，SEQ ID NO.15；

RS2241766，正向引物SEQ ID NO.16-17，反向共用引物，SEQ ID NO.18；

RS7403531，正向引物SEQ ID NO.19-20，反向共用引物，SEQ ID NO.21。

優(yōu)選地，所述反向共用引物均有熒光標記；所述反向共用引物的熒光標記分組包括兩組，分別為第一組RS10886471、RS13062383、RS780094、RS7903146；第二組RS3817588、RS2241766和RS7403531。

優(yōu)選地，所述反向共用引物的熒光標記包括FAM色標記、HEX色標記、ROX色標記、TAMRA色標記中的任意兩種；且每組之間的熒光標記不同。

優(yōu)選地，所述引物在擴增體系中的終濃度分別為：

一種用于II型糖尿病易感基因檢測的SNP分型試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

步驟A，從生物檢材中提取基因組DNA，提取方法包括磁珠法、Chelex-100法，提取后的DNA溶液經定量后稀釋；

步驟B，SNP位點的PCR擴增：首先配制PCR反應液，依次加入Reaction Mix、熱啟動Taq聚合酶、復合引物、水和DNA模板，然后采用三步擴增法對其進行PCR擴增；

步驟C，擴增產物的毛細管電泳檢測，根據(jù)檢測結果確定各SNP位點的基因型。

所述PCR擴增的執(zhí)行程序包括：a、預變性、95℃ 3min；b、熱循環(huán)、94℃15s，60℃ 30s；共30個循環(huán)；c、終延伸、60℃ 15min；d、維持、4℃。

所述生物檢材包括血液、毛發(fā)、唾液、脫落細胞。

所述SNP分型試劑盒可用于輔助評價待檢測人員患II型糖尿病的風險，并用于II型糖尿病的輔助診斷和預防。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明建立了一種新型的利用熒光標記引物特異性擴增結合毛細管電泳技術的II型糖尿病易感基因檢測的分型方法，通過一次實驗即可同時檢測RS10886471、RS13062383、RS780094、RS7903146、RS3817588、RS2241766和RS7403531等7個II型糖尿病相關的SNP位點，并同時得到分型結果，而其他相關的發(fā)明或產品只能檢測出其中一個或兩個位點；該方法操作簡單、準確性強、靈敏度高，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；應用本發(fā)明的試劑盒對待測者的II型糖尿病易感基因進行檢測，最快可在兩個小時內得出實驗結果，亦可進行批量檢測，為待測人群患II型糖尿病的風險進行評估，并用于II型糖尿病的輔助診斷和預防；本發(fā)明首次將ARMS-PCR技術和熒光凝膠電泳技術相結合運用于II型糖尿病易感基因的檢測中，并可單管同時檢測多個II型糖尿病的熱點易感基因位點，檢測結果即是易感基因的分型結果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的基因分型標準物的電泳圖；

圖2是本發(fā)明的多態(tài)性位點對應引物設計示意圖；

圖3a是本發(fā)明RS780094位點標記引物更改前的電泳圖；

圖3b是本發(fā)明RS780094位點標記引物缺失實驗的電泳圖；

圖3c是本發(fā)明RS780094位點標記引物更改后的電泳圖；

圖4a是本發(fā)明患者1和患者2的檢測結果的電泳圖；

圖4b是本發(fā)明患者3和患者4的檢測結果的電泳圖；

圖4c是本發(fā)明患者5的檢測結果的電泳圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。

如圖所示，本發(fā)明公開一種用于II型糖尿病易感基因檢測的SNP分型試劑盒，包括6個易感基因的7個SNP位點的引物；所述6個易感基因的7個SNP位點分別為：

TCF7L2基因的RS7903146位點；

SLC6A20基因的RS13062383位點；

GCKR基因的RS780094位點和RS3817588位點；

觀察脂聯(lián)素基因的RS2241766位點；

GRK5基因的RS10886471位點；

RASGRP1基因的RS7403531位點。

優(yōu)選地，所述引物是分為兩組進行標記的。

優(yōu)選地，所述6個易感基因的7個SNP位點的引物序列分別為：

RS10886471，正向引物SEQ ID NO.1-2，反向共用引物，SEQ ID NO.3；

RS13062383，正向引物SEQ ID NO.4-5，反向共用引物，SEQ ID NO.6；

RS780094，正向引物SEQ ID NO.7-8，反向共用引物，SEQ ID NO.9；

RS7903146，正向引物SEQ ID NO.10-11，反向共用引物，SEQ ID NO.12；

RS3817588，正向引物SEQ ID NO.13-14，反向共用引物，SEQ ID NO.15；

RS2241766，正向引物SEQ ID NO.16-17，反向共用引物，SEQ ID NO.18；

RS7403531，正向引物SEQ ID NO.19-20，反向共用引物，SEQ ID NO.21。

優(yōu)選地，所述反向共用引物均有熒光標記；所述反向共用引物的熒光標記分組包括兩組，分別為第一組RS10886471、RS13062383、RS780094、RS7903146；第二組RS3817588、RS2241766和RS7403531。

優(yōu)選地，所述反向共用引物的熒光標記包括FAM色標記、HEX色標記、ROX色標記、TAMRA色標記中的任意兩種；且每組之間的熒光標記不同。

優(yōu)選地，所述引物在擴增體系中的終濃度分別為：

一種用于II型糖尿病易感基因檢測的SNP分型試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

步驟A，從生物檢材中提取基因組DNA，提取方法包括磁珠法、Chelex-100法，提取后的DNA溶液經定量后稀釋；

步驟B，SNP位點的PCR擴增：首先配制PCR反應液，依次加入Reaction Mix、熱啟動Taq聚合酶、復合引物、水和DNA模板，然后采用三步擴增法對其進行PCR擴增；

步驟C，擴增產物的毛細管電泳檢測，根據(jù)檢測結果確定各SNP位點的基因型。

所述PCR擴增的執(zhí)行程序包括：a、預變性、95℃ 3min；b、熱循環(huán)、94℃15s，60℃ 30s；共30個循環(huán)；c、終延伸、60℃ 15min；d、維持、4℃。

所述生物檢材包括血液、毛發(fā)、唾液、脫落細胞。

所述SNP分型試劑盒可用于輔助評價待檢測人員患II型糖尿病的風險，并用于II型糖尿病的輔助診斷和預防。

實施例1：

本發(fā)明SNP位點的篩選、引物的設計、濃度的優(yōu)化以及反應體系的建立

1、引物的設計及篩選

1.1SNP序列的下載

本發(fā)明所述的7個SNP位點的基因序列均下載自NCBI genebank，具體的序列信息見下表(表1)。其中RS10886471位點的等位基因C為野生型，等位基因T為突變型(易感型)；RS13062382位點的等位基因G為野生型，等位基因A為突變型(易感型)；RS780094位點的等位基因A為野生型，等位基因G為突變型(易感型)；RS7903146位點的等位基因C為野生型，等位基因T為突變型(易感型)；RS3817588位點的等位基因A為野生型，G為突變型(易感型)；RS2241766位點的等位基因A為野生型，等位基因C為突變型(易感型)；RS7403531位點的等位基因C為野生型，等位基因T為突變型(易感型)。

表1 SNP序列信息

1.2引物設計

本發(fā)明利用OLIGO6.0軟件進行引物設計，每個SNP位點共設計三條引物，PCR產物大小在100-210bp之間，其中一條共用引物的5′端用相應的熒光素進行標記，另外兩條非標記引物的3′端對突變堿基序列特異識別，而其中一條非標記的5′端再加3～5個核苷酸(通常為att或者tata，表2中引物序列5′端的小寫字母)用于指示等位基因。由于兩條非標記引物長度不同導致擴增產物長度不同，電泳遷移率不同，最終達到檢測的目的。

本發(fā)明引物設計的原理如圖2所示，除遵循普通引物設計的一般原則外，為增加兩條非標記引物的特異性，在距離引物3′端2～5個堿基處人為地引入錯配堿基(引物序列中近3′端的帶下劃線小寫字母)，引入錯配的原則為：若3′端為弱錯配(A-C，G-T)，則引入強錯配(A-G，C-T)；若3′端為中錯配(A-A，G-G，C-C，T-T)，則引入中錯配；若3′端為強錯配，則引入弱錯配。

本發(fā)明所用引物均按此規(guī)則進行設計，但本發(fā)明經過多次試驗反復摸索發(fā)現(xiàn)：當3′端為弱錯配時，人為引入強錯配堿基會因引物特異性過強而得不到擴增結果，另外，人為引入錯配堿基距離3′端的位置不同引物的特異性也不同，所以人為引入錯配堿基的類型和位置要視具體情況、經過多次試驗驗證才行。最后，為了后續(xù)引物濃度的優(yōu)化，在此設計的引物Tm值均在58～62℃之間。

1.3引物篩選

本發(fā)明的所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，篩選引物所用的模板均為經子淵司法鑒定所醫(yī)學檢驗部測序成功并確定基因型的個體。引物篩選的具體方法如下：

(1)引物的單基因座擴增

將合成好的每對引物(一條標記引物和兩條非標記引物)稀釋成1μM進行擴增試驗，觀察有無非特異性擴增峰，以及擴增效率如何。若有非特異性擴增峰則進行缺失排查實驗，找出產生非特異性擴增峰的引物并更改。

(2)引物的單色復合擴增

將確定好的同一色標記的單基因座引物組成復合引物進行擴增實驗，觀察有無非特異性擴增峰，以及引物混合后擴增效率如何。若有非特異性擴增峰則進行缺失排查實驗，找出產生非特異性擴增峰的引物并更改。

(3)引物混合物擴增

將確定好的不同色標記的所有引物組成引物混合物進行擴增實驗，觀察有無非特異性擴增峰，以及引物混合物的擴增效率如何。若有非特異性擴增峰則進行缺失排查實驗，找出產生非特異性擴增峰的引物并更改，確定最終的引物序列。

本發(fā)明的引物單基因座擴增和單色擴增測試結果較好，無非特異性擴增峰出現(xiàn)。而在測試引物混合物時發(fā)現(xiàn)：在FAM色會出現(xiàn)一條非特異性擴增峰，大小為108bp左右，結果見圖3a。本發(fā)明對FAM色引物依次進行缺失實驗：當HEX色的所有引物都加，而FAM色缺失RS780094的標記引物時，擴增產物的非特異性擴增峰消失，結果見圖3b；然后再用RS780094的標記引物與HEX色的非標記引物依次進行缺失實驗，擴增結果顯示當缺失RS3817588的野生型非標記引物時，非特異性擴增峰消失結果見圖3c。故本次實驗在保證RS3817588引物擴增效率和特異性的情況下，更改RS780094的標記引物，更改前RS780094位點的引物擴增產物大小為173bp(易感型)和177bp(野生型)，更改后RS780094位點的引物擴增產物大小為150bp(易感型)和154bp(野生型)。

本發(fā)明在篩選引物時還發(fā)現(xiàn)：嚴格按照引入錯配原則進行等位基因特異性引物的設計時，會出現(xiàn)引物的特異性過強而擴增不出峰或者擴增效率不高等情況。例如：RS13062383的突變型引物在引物3′端的第二位引入強錯配堿基“T”和中錯配堿基“C”時都會出現(xiàn)擴增不出峰的情況；而引入弱錯配堿基“A”時，則出現(xiàn)擴增效率不高的情況，不斷提高引物濃度依然得不到較佳的擴增效果；故本發(fā)明將其錯配堿基引入第四位并將強錯配堿基“G”改成中錯配堿基“A”時，擴增效果較好。由此可見，人為引入錯配時不能嚴格按照錯配原則進行，要視具體情況而定，不同堿基組成的引物引入錯配的情況會有差異。本發(fā)明對這7組引物進行了多次更改和反復測試，在保證引物的特異性和擴增效率的情況下最終確定了各SNP位點的引物序列，具體的引物信息見表2。

表2 各SNP位點引物序列

表2中，“F1”編號指等位基因特異性引物擴增時具體位點的野生型，“F2”編號指等位基因特異性引物擴增時具體位點的突變型(易感型)，“R”編號指5’末端熒光素標記的共用引物。在上述引物中，每個SNP位點均有兩條等位基因特異性非標記引物，分別用于擴增野生型和突變型(易感型)堿基序列，而每個位點的共用引物，用于和等位基因特異性非標記引物形成配對，使目標堿基序列能夠得到擴增。

本發(fā)明在確定兩色熒光組合方案的基礎上，通過大量試驗，確定了上述7個SNP位點的組合方式和熒光標記類型。所用熒光標記可以是FAM、HEX、TAMRA和ROX中任選兩種，考慮成本和熒光效率，本方案優(yōu)選以FAM、HEX染料標記共用引物。將7個SNP位點的引物分成兩組，第一組包括RS10886471、RS13062383、RS780094、RS7903146共四個位點，各位點的共用引物用FAM進行標記，第二組包括RS3817588、RS2241766和RS7403531三個位點，各位點的共用引物用HEX進行標記，分子量內標使用橙色的熒光染料LIZ500(美國應用生物系統(tǒng)公司)進行標記。

1.4引物濃度的優(yōu)化

由于每條引物的擴增效率不同，致使每條引物要達到同樣的擴增峰值時在體系中的加量不同。因此，本發(fā)明在確定好引物序列后，將對引物的濃度進行優(yōu)化。

引物合成后，首先對各引物的濃度從0.02μM至0.2μM做濃度梯度實驗，梯度間隔為0.02μM；然后對引物的退火溫度做溫度梯度實驗，梯度間隔為2℃，對人基因組DNA做引物的單擴實驗，比較觀察不同的引物濃度和不同的退火溫度對擴增效率的影響；最后，根據(jù)檢測結果，選擇峰高在2000～5000RFU之間的引物濃度和退火溫度和退火溫度，配制初始的引物混合物，對人基因組DNA進行擴增，根據(jù)檢測結果對各引物濃度進行微調，使復合引物在各位點的擴增峰高基本一致即可。

本發(fā)明中，每個SNP位點的兩條非標記引物在擴增時會出現(xiàn)抑制和競爭的情況，因此在配制引物混合物時的加量應多于標記引物。因兩條非標記引物人為引入錯配堿基的位置不同進而擴增效率不同，所以在進行引物濃度優(yōu)化時需不停的對其加量進行微調，以使兩條非標記引物在擴增雜合突變時的峰高基本一致。

本發(fā)明經過引物濃度的多次微調實驗，最終確定了各SNP位點引物在擴增體系中的最適濃度。具體的濃度見下表：

表3 各SNP位點引物在擴增體系中的終濃度

1.5擴增及產物檢測

擴增體系

首先完成除模板外的PCR反應體系的配制，最后加入擴增模板；提取基因組DNA時，先用紫外風光光度計測量濃度，再稀釋使其終濃度在0.05～1ng/μL左右，在實際操作中，一般取1～2μL的DNA模板進行擴增。體系中各組分的加樣量如表4所示。

表4 試劑盒擴增體系

擴增程序

上述體系配制好后立即用掌式離心機離心，后將其置于熱循環(huán)儀上。選擇表5的程序進行擴增，擴增后的產物應立即進行熒光凝膠電泳檢測或是避光保存。

因本發(fā)明中7個SNP位點的引物擴增產物的大小均在210bp以下，為了節(jié)省試劑盒的檢測時間，在確定好引物濃度的情況下，本發(fā)明將對PCR的擴增程序進行優(yōu)化。在預變性時間不變的情況下，更改熱循環(huán)程序中的退火時間和終延伸時間，篩選出擴增時間短且擴增效率高的程序。優(yōu)化過程如下：(1)在預變性3分鐘、變性15秒、30個循環(huán)數(shù)和終延伸20分鐘的情況下，退火時間60秒和退火時間30秒的擴增效果無明顯差異，電泳檢測結果均較佳。本次優(yōu)化選擇退火時間30秒的擴增程序；(2)因本發(fā)明所有位點的擴增產物片段較短，所需延伸時間較其他常規(guī)PCR擴增程序短，故本次優(yōu)化對終延伸時間做梯度實驗，梯度間隔為5分鐘。在預變性3分鐘、變性15秒、退火30秒、30個循環(huán)數(shù)的情況下，終延伸分別設置為20分鐘、15分鐘、10分鐘和5分鐘，擴增產物電泳結果顯示：終延伸20分鐘和終延伸15分鐘的結果無明顯差異，終延伸10分鐘的電泳結果會出現(xiàn)各SNP位點峰高不均衡的的情況，而終延伸5分鐘的電泳結果會出現(xiàn)個別SNP位點峰高過低的情況。本發(fā)明經多次試驗最終確定了PCR的擴增程序，具體的情況見表5。

表5 試劑盒擴增程序

擴增產物在遺傳分析儀上熒光檢測

由去離子甲酰胺與試劑盒中分子量內標LIZ-500(美國應用生物系統(tǒng)公司)組成上樣混合物(按體積比9.5∶0.5混合)。將10μL上樣混合物與1μL擴增產物混合，離心，避免產生氣泡。95℃變性3分鐘，冰浴3分鐘，用遺傳分析儀3130(美國應用生物系統(tǒng)公司)檢測分析。

等位基因分型標準物的制備

本實施例中選取經子淵司法鑒定所醫(yī)學檢驗部測序成功并確定基因型的患者，選出各SNP位點不同基因型的個體，分別用RS10886471、RS13062383、RS780094、RS7903146、RS3817588、RS2241766和RS7403531各位點的單基因座引物進行擴增，其中，野生型的個體用野生型的引物，突變型的個體用突變型的引物進行擴增。引物序列見表2。

(1)擴增體系

首先完成除模板外的PCR反應體系的配制，最后加入擴增模板；提取基因組DNA時，先用紫外風光光度計測量濃度，再稀釋使其終濃度在0.05～1ng/μL左右，在實際操作中，一般取1～2μL的DNA模板進行擴增。體系中各組分的加樣量如表4所示。

(2)擴增程序

上述體系配置好后立即用掌式離心機離心，后將PCR管置于熱循環(huán)儀上，選擇表5的程序進行擴增，擴增后的產物應立即進行熒光凝膠電泳檢測或是避光保存。

(3)擴增產物在遺傳分析儀上熒光檢測

由去離子甲酰胺與試劑盒中分子量內標LIZ-500(美國應用生物系統(tǒng)公司)組成上樣混合物(按體積比9.5∶0.5混合)。將10μL上樣混合物與1μL擴增產物混合，離心，避免產生氣泡。95℃變性3分鐘，冰浴3分鐘，用遺傳分析儀3130(美國應用生物系統(tǒng)公司)檢測分析。

(4)分型分析

用片段分析軟件GeneMapperID-X分析步驟(3)中遺傳分析儀檢測收集的數(shù)據(jù)。

(5)等位基因分型標準物的組配

根據(jù)各SNP位點的等位基因擴增峰高比例，峰高的少加，峰低的多加，把各等位基因擴增產物混合，組成等位基因分型標準物。再次電泳檢測，檢測圖如附圖1。

本發(fā)明試劑盒的準確性驗證

本實施例選取已經確診為II型糖尿病患者5例，該5例患者的基因型均由子淵司法鑒定所醫(yī)學檢驗部成功測序，然后用本發(fā)明的試劑盒對上述5例患者的各SNP位點進行檢測。5位患者的編號分別為C1、C2、C3、C4和C5。檢測結果見表6，具體的檢測方法如下：

擴增體系

首先完成除模板外的PCR反應體系的配制，最后加入擴增模板；提取基因組DNA時，先用紫外風光光度計測量濃度，再稀釋使其終濃度在0.05～1ng/μL左右，在實際操作中，一般取1～2μL的DNA模板進行擴增。體系中各組分的加樣量如表4所示。

表4 試劑盒擴增體系

擴增程序

上述體系配制好后立即用掌式離心機離心，后將其置于熱循環(huán)儀上，選擇表5的程序進行擴增，擴增后的產物應立即進行熒光凝膠電泳檢測或是避光保存。

表5 試劑盒擴增程序

擴增產物在遺傳分析儀上熒光檢測

由去離子甲酰胺與試劑盒中分子量內標LIZ-500(美國應用生物系統(tǒng)公司)組成上樣混合物(按體積比9.5∶0.5混合)。將10μL上樣混合物與1μL擴增產物混合，離心，避免產生氣泡。95℃變性3分鐘，冰浴3分鐘，用遺傳分析儀3130(美國應用生物系統(tǒng)公司)檢測分析。

利用本發(fā)明的試劑盒對上述5位患者的檢測結果見下表。通過對比分析可知，利用本發(fā)明的試劑盒對II型糖尿病患者基因型的檢測結果與子淵司法鑒定所醫(yī)學檢驗部的測序結果完全一致。

表6 本試劑盒對5例患者檢測的基因型

通過上述實施例，我們可以看出本發(fā)明的試劑盒檢測結果準確可靠、操作方法簡單、只需一次實驗即可檢測7個II型糖尿病的易感SNP位點，并獲得相應位點的基因型。檢測結果不僅可以用來評估健康人群患II型糖尿病的風險和預防，還可以作為II型糖尿病患者的輔助診斷和治療。

本發(fā)明建立了一種新型的利用熒光標記引物特異性擴增結合毛細管電泳技術的II型糖尿病易感基因檢測的分型方法，通過一次實驗即可同時檢測RS10886471、RS13062383、RS780094、RS7903146、RS3817588、RS2241766和RS7403531等7個II型糖尿病相關的SNP位點，并同時得到分型結果，而其他相關的發(fā)明或產品只能檢測出其中一個或兩個位點；該方法操作簡單、準確性強、靈敏度高，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；應用本發(fā)明的試劑盒對待測者的II型糖尿病易感基因進行檢測，最快可在兩個小時內得出實驗結果，亦可進行批量檢測，為待測人群患II型糖尿病的風險進行評估，并用于II型糖尿病的輔助診斷和預防；本發(fā)明首次將ARMS-PCR技術和熒光凝膠電泳技術相結合運用于II型糖尿病易感基因的檢測中，并可單管同時檢測多個II型糖尿病的熱點易感基因位點，檢測結果即是易感基因的分型結果。

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。