本發(fā)明涉及一種微生物菌株，具體涉及一種可降低煙葉中水溶性糖的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，及其篩選方法、培養(yǎng)方法和該菌株在煙葉中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙葉是卷煙生產(chǎn)的原料，煙葉質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到卷煙品質(zhì)的高低。煙葉的化學(xué)常規(guī)成分主要是：總植物堿、水溶性總糖、還原糖、總氮、氯和鉀，還含有蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、果膠等大分子化合物，這些成分在煙葉中的含量以及某些成分之間的比例關(guān)系，對(duì)煙葉品質(zhì)有著重要的影響。煙葉中的水溶性糖包括還原糖和非還原性水溶性糖，在一定范圍內(nèi)，糖含量高，煙氣協(xié)調(diào)，卷煙吃味醇和。通常煙葉中總糖/總植物堿的值(簡稱糖堿比)接近10的烤煙煙葉質(zhì)量最好，一般為6-10。但某些煙葉(特別是一些北方地區(qū)煙葉)水溶性糖含量過高，導(dǎo)致糖堿比極度失調(diào)，這樣的煙葉抽吸起來，協(xié)調(diào)性差，煙氣發(fā)酸，滿足感弱。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)某些煙葉水溶性糖含量過高，糖堿比嚴(yán)重失調(diào)，煙葉質(zhì)量差的問題，提供一種可降低煙葉中水溶性糖的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供了所述的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的篩選方法；

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供了異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的培養(yǎng)方法；

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供了提供了異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)在降低煙葉中水溶性糖應(yīng)用。

為了達(dá)到上述的技術(shù)效果，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

一種降低煙葉中水溶性糖的菌株，所述的菌株為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)為：CGMCC 10337。

本發(fā)明還提供了所述的異常威克漢姆酵母的培養(yǎng)和顯微形態(tài)特征如下：

麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，細(xì)胞球形、卵形、臘腸形，大小為(2.6～8.8)×(2.6～4.3)μm；

麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)一個(gè)月，菌落奶酪狀，乳白色，表面平滑，不反光，邊緣樹根狀；

玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，不產(chǎn)生假菌絲。

本發(fā)明提供了所述的降低煙葉中水溶性糖的菌株的篩選方法，包括以下步驟：

步驟A：取土壤樣品9～10g于90mL富集培養(yǎng)基中，然后于溫度28～32℃下培養(yǎng)92～100h得到富集培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程中如有菌絲長出，挑出棄去；

步驟B：取富集培養(yǎng)液1～1.2mL，放入裝有熔化后冷卻至48～52℃的分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，凝固后置于溫度28～32℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45～50h；然后挑選生長的菌落接入馴化培養(yǎng)基中，于溫度28～32℃下靜置培養(yǎng)45～50h；接著將培養(yǎng)物梯度稀釋涂布于分離培養(yǎng)基平板，得到單菌落，通過劃線分離純化得到異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

在上述的篩選方法中，所述的富集培養(yǎng)基包括下述重量份的組分：葡萄糖，20.0份；蛋白胨，10.0份；酵母膏，5份；乳酸，5份；富集培養(yǎng)基的pH為5.0，在121℃滅菌20min。

在上述的篩選方法中，所述的分離培養(yǎng)基包括下述重量份的組分：葡萄糖，60.0份；蛋白胨，10.0份；酵母膏，5份；乳酸，5份；分離培養(yǎng)基的pH為6.0，在121℃滅菌20min。

在上述的篩選方法中，所述的馴化培養(yǎng)基包括下述重量份的組分：：葡萄糖，60.0份；蛋白胨，10.0份；酵母膏，5份；乳酸，5份；馴化培養(yǎng)基pH 5.0，在121℃滅菌20min。

本發(fā)明還提供了所述的降低煙葉中水溶性糖的菌株的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

步驟a：斜面培養(yǎng)：將冷凍保存的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)接種到麩皮汁斜面培養(yǎng)基上，于溫度28～32℃下靜置培養(yǎng)1-2天；

步驟b：搖瓶液體培養(yǎng)：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的葡萄糖水溶液1000mL高壓蒸汽滅菌；將步驟a所得菌體接種到葡糖糖水溶液上，然后于溫度28～32℃、搖床轉(zhuǎn)速140-160r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)18～24h，培養(yǎng)至菌數(shù)達(dá)10¹⁰以上，得到種子液。

在上述的培養(yǎng)方法中，所述的麩皮汁斜面培養(yǎng)基的制備步驟如下：25g麩皮加水150mL，加熱煮沸后計(jì)時(shí)25～35min，過濾，濾液補(bǔ)足100mL，然后加入葡萄糖2g、酵母膏0.5g、瓊脂1.5g。

本發(fā)明還提供了所述的降低煙葉中水溶性糖的菌株在降低煙葉中水溶性糖的應(yīng)用，將種子液按照煙葉重量的5～30％，加入到煙葉中，然后于溫度20～45℃下發(fā)酵1～6天。

在上述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，將種子液按照煙葉重量的20～30％，加入到煙葉中，然后于溫度20～45℃下發(fā)酵1～6天。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的有益效果：

本發(fā)明提供了一株異常威克漢姆酵母，該菌株生長繁殖力強(qiáng)、菌絲生長旺盛。使用該菌株發(fā)酵處理糖含量高、糖堿比嚴(yán)重失調(diào)的煙葉，能降低水溶性含量20～95％，具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，發(fā)酵后煙葉協(xié)調(diào)性提高，煙氣酸氣減弱，有回甜味，滿足感增強(qiáng)，感官質(zhì)量明顯改善。

附圖說明

圖1為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的菌落形態(tài)；

圖2為異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的細(xì)胞形態(tài)；

異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)的保藏說明：

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡稱CGMCC；

保藏編號(hào)：CGMCC 10337；

保藏時(shí)間：2015年1月12日。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述和說明。

實(shí)施例1：異常威克漢姆酵母的篩選和分離：

取土壤樣品(四川涼山姜州煙田土壤)10g于90mL富集培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)至96h，培養(yǎng)過程中如有菌絲長出，挑出棄去。取富集培養(yǎng)液1mL，放入裝有熔化后冷卻至50℃分離培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中混合均勻，凝固后放于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。挑取生長的菌落接入馴化培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)物梯度稀釋涂布于分離培養(yǎng)基平板，得到單菌落，通過劃線分離純化得到異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)。

所述富集培養(yǎng)基為：葡萄糖20.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5g，乳酸5g，pH 5.0，121℃滅菌20min，

所述分離培養(yǎng)基為：葡萄糖60.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5g，瓊脂1.5g，pH 6.0，121℃滅菌20min。

所述馴化培養(yǎng)基：葡萄糖60.0g，蛋白胨10.0g，酵母膏5g，乳酸5g，pH 5.0，121℃滅菌20min。

異常威克漢姆酵母的培養(yǎng)和顯微形態(tài)特征如下，詳見圖1和圖2：

麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，細(xì)胞球形、卵形、臘腸形，大小為(2.6～8.8)×(2.6～4.3)μm；

麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)一個(gè)月，菌落奶酪狀，乳白色，表面平滑，不反光，邊緣樹根狀；

玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，不產(chǎn)生假菌絲。

本發(fā)明篩選的異常威克漢姆酵母具有rRNA基因D1D2區(qū)序列。

實(shí)施例2：異常威克漢姆酵母的種子液的制備：

將實(shí)施例1得到的異常威克漢姆酵母Y05菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及生產(chǎn)，獲得蠟狀芽孢桿菌(代號(hào)Y15)種子液。

斜面培養(yǎng)：將冷凍保存的異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)Y05菌種接種到麩皮汁斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫靜止培養(yǎng)1-2天。所述麩皮汁斜面培養(yǎng)基為：25g麩皮加水150mL，加熱煮沸后計(jì)時(shí)30min，過濾，濾液補(bǔ)足100mL，加入葡萄糖2g，酵母膏0.5g，瓊脂1.5g。

搖瓶液體培養(yǎng)：1％葡萄糖水溶液1000mL，高壓蒸汽滅菌，將斜面培養(yǎng)所得的菌體接種到培養(yǎng)基液體中，培養(yǎng)溫度：30℃，搖床轉(zhuǎn)速140-160r/min，搖瓶培養(yǎng)18-24h，培養(yǎng)至菌數(shù)達(dá)10¹⁰以上，得到種子液。

實(shí)施例3：

將實(shí)施例2得到的異常威克漢姆酵母種子液按照煙葉重量的30％，加入到含水量15％的煙葉中，30℃條件下發(fā)酵6天，與未發(fā)酵處理空白煙葉相比，發(fā)酵煙葉中水溶性總糖含量降低60.5％，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明：發(fā)酵煙葉煙氣協(xié)調(diào)性較好，酸氣減弱，有回甜味，滿足感增強(qiáng)。

實(shí)施例4：

將實(shí)施例2得到的異常威克漢姆酵母種子液按照煙葉重量的5％，加入到含水量50％的煙葉中，25℃條件下發(fā)酵2天，與未發(fā)酵處理空白煙葉相比，發(fā)酵煙葉中水溶性總糖含量降低25.4％，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明：發(fā)酵煙葉煙氣協(xié)調(diào)性較好，酸氣減弱，有回甜味，滿足感增強(qiáng)。

實(shí)施例5：

將實(shí)施例2得到的異常威克漢姆酵母種子液按照煙葉重量的20％，加入到含水量35％的煙葉中，40℃條件下發(fā)酵4天，與未發(fā)酵處理空白煙葉相比，發(fā)酵煙葉中水溶性總糖含量降低92.6％，感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明：發(fā)酵煙葉煙氣協(xié)調(diào)性變好，酸氣明顯減弱，有回甜味，滿足感增強(qiáng)。

盡管這里參照本發(fā)明的解釋性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，上述實(shí)施例僅為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)計(jì)出很多其他的修改和實(shí)施方式，這些修改和實(shí)施方式將落在本申請(qǐng)公開的原則范圍和精神之內(nèi)。