本發(fā)明屬于微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茭白黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)：

茭白(zizanialatifolia)又稱(chēng)菰，為禾本科菰屬多年生宿根草本植物，其肉質(zhì)鮮嫩，富含豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和多種藥用成分。廣泛栽培于長(zhǎng)江流域及以南地區(qū)，廣西柳州、桂林、賀州等地區(qū)素有種植。隨著茭白產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，種植面積不斷擴(kuò)大，目前茭白已成為我國(guó)第二大水生蔬菜。

茭白黑粉菌(ustilagoesculenta)屬于擔(dān)子菌門(mén)黑粉菌科，研究發(fā)現(xiàn)，茭白黑粉菌為茭白植株的內(nèi)生真菌，茭白能否孕茭與其成功侵染密切相關(guān)。當(dāng)茭白植株受茭白黑粉菌侵染后，由于茭白抽穗開(kāi)花受抑制，莖部組織受刺激膨大形成肉質(zhì)莖，其中呈現(xiàn)白嫩可食用的肉質(zhì)莖的稱(chēng)為正常茭白，而布滿(mǎn)褐色孢子的肉質(zhì)莖的茭白為灰茭，不可食用。據(jù)報(bào)道，誤食茭白黑粉菌可引起肺炎?；臆驼＼字械能缀诜劬谛螒B(tài)上存在較大的差異，茭白黑粉菌在灰茭中主要以冬孢子(t型)形式存在，致使茭肉呈褐色，而茭白黑粉菌在正常茭白中則多以菌絲型(mt型)存在，使茭肉呈白色。因此，深入研究茭白黑粉菌，對(duì)揭示茭白孕茭機(jī)理與茭白育種工作具有重要意義。

用分子生物學(xué)手段研究茭白黑粉菌為揭示茭白孕茭機(jī)理和加快茭白育種進(jìn)程提供新的研究思路。分離和鑒定茭白黑粉菌致病與孕茭機(jī)理相關(guān)基因是關(guān)鍵所在，而建立真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)創(chuàng)造缺陷突變體則是分離和鑒定該相關(guān)基因的一種有效途徑。yujiajia等建立了peg介導(dǎo)茭白黑粉菌原生質(zhì)體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，雖然通過(guò)該遺傳轉(zhuǎn)化體系獲得了敲除突變體及egfp綠色熒光蛋白過(guò)表達(dá)，但該轉(zhuǎn)化體系存在一定缺陷，不僅需要制備繁瑣的敏感原生質(zhì)體，且還需要對(duì)轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行線性化處理才能獲得轉(zhuǎn)化子。

目前，絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為植物病原真菌分子遺傳和基因功能研究的重要手段。由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(atmt)已經(jīng)成功應(yīng)用于u.maydis、pseudozymaantarctica、u.hordei、s.scitamineum等黑粉菌及其它絲狀真菌中。已有大量文獻(xiàn)證明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化與peg轉(zhuǎn)化方法相比，具有轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化子t-dna為單拷貝、隨機(jī)插入頻率高等優(yōu)點(diǎn)。此外，peg轉(zhuǎn)化時(shí)的受體只能為原生質(zhì)體，而高濃度的peg對(duì)原生質(zhì)體有毒害作用。而由農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子比較穩(wěn)定，由atmt得到的轉(zhuǎn)化子，在沒(méi)有選擇壓力的培養(yǎng)基上培養(yǎng)幾代后也不會(huì)喪失抗生素抗性。迄今，未見(jiàn)茭白黑粉菌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性好的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茭白黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茭白黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法，以茭白黑粉菌孢子為轉(zhuǎn)化受體材料，將含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌與茭白黑粉菌孢子混合后共培養(yǎng)，用抗生素篩選，獲得抗性轉(zhuǎn)化子。

上述根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茭白黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括以下步驟：

<1>茭白黑粉菌孢子的制備；

<2>含載體農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備；

<3>轉(zhuǎn)化。

步驟<1>按以下操作進(jìn)行：在yepsa固體培養(yǎng)基上將茭白黑粉菌培養(yǎng)2天后，將茭白黑粉菌接種至yeps液體培養(yǎng)基，搖床200rpm，培養(yǎng)2天，然后5000rpm離心收集菌體，加入ddh2o2制成1×10⁷個(gè)/ml孢子懸浮液，獲得茭白黑粉菌孢子懸浮液，備用。

步驟<2>按以下操作進(jìn)行：利用質(zhì)粒pex2-egfp和pex2-rfp為轉(zhuǎn)化載體，pex2-egfp載體攜帶綠色熒光蛋白基因egfp和潮霉素抗性篩選基因hph，pex2-rfp載體攜帶紅色熒光蛋白基因rfp和潮霉素抗性篩選基因hph，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒pex2-egfp和pex2-rfp載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；挑含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌體至5ml的mm液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，培養(yǎng)過(guò)夜，用im液體培養(yǎng)基將菌液稀釋od600至0.15，28℃下預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，使菌液od600調(diào)至為0.5備用。

mm液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，其配方為：1.45gkh2po4，2.05gk2hpo4，0.5gnh4no3，0.01gcacl2，0.3g(nh4)so4，2gglucose，0.01gfeso4，5mlz-buffer，加雙蒸水定容至1000ml，ph6.7-7.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：1gglucose，7.808gmes，1.45gkh2po4，0.5gnh4no3，0.6gmgso4·7h2o，0.01gcacl2，0.3gnacl，0.5g(nh4)so4，hcl調(diào)ph值到5.6，雙蒸水定容至1000ml。

z-buffer中含有以下成分cuso4*5h2o，znso4*7h2o，mnso4*h2o，h3bo3和nambo4*2h2o各0.01％。

步驟<3>按以下操作進(jìn)行：分別取步驟<1>中茭白黑粉菌孢子懸浮液和步驟<2>中農(nóng)桿菌培養(yǎng)液各100μl，混合后涂板于含as的覆蓋有纖維素濾膜的im固體培養(yǎng)基上，24℃下共培養(yǎng)48h-72h；轉(zhuǎn)移纖維素濾膜至含有潮霉素b和頭孢噻肟鈉的yepsa，28℃下培養(yǎng)5-8d；將長(zhǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)化子用牙簽挑到含有潮霉素b和頭孢噻肟鈉的yepsa上進(jìn)行二次篩選；第二次篩選獲得的抗潮霉素b的茭白黑粉菌即為轉(zhuǎn)化子。

im固體培養(yǎng)基由每升誘導(dǎo)培養(yǎng)基加25克瓊脂構(gòu)成。

為研究茭白黑粉菌的孕茭機(jī)制，發(fā)明人建立了一種根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茭白黑粉菌的遺傳轉(zhuǎn)化方法，以茭白黑粉菌孢子為轉(zhuǎn)化受體材料，將含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌與茭白黑粉菌孢子混合后共培養(yǎng)，用抗生素篩選，獲得抗性轉(zhuǎn)化子。該法操作簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高且穩(wěn)定性好，以此構(gòu)建茭白黑粉菌突變體庫(kù)，為篩選茭白黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換突變體提供了豐富的篩選菌源，同時(shí)為克隆茭白黑粉菌二型態(tài)轉(zhuǎn)換基因以及茭白黑粉菌與茭白植株互作相關(guān)基因提供了手段，對(duì)闡明茭白的孕茭機(jī)制和推進(jìn)茭白育種工作具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1是茭白黑粉菌分生孢子和菌絲，圖中：a：茭白黑粉菌分生孢子，b：茭白黑粉菌菌絲。

圖2是雙元載體結(jié)構(gòu)示意圖，圖中：a：載體pex2-egfp，b：載體pex2-rfp。

圖3是茭白黑粉菌熒光鑒定結(jié)果圖，圖中：a：在明場(chǎng)下的茭白黑粉菌gfp轉(zhuǎn)化子分生孢子，b：在綠色熒光濾鏡下的茭白黑粉菌gfp轉(zhuǎn)化子分生孢子c：在明場(chǎng)下的茭白黑粉菌rfp轉(zhuǎn)化子分生孢子，d：在紅色熒光濾鏡下的茭白黑粉菌rfp轉(zhuǎn)化子分生孢子。

圖4是茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子pcr鑒定結(jié)果圖，圖中：m：marker2k，1-16：茭白黑粉菌gfp和rfp轉(zhuǎn)化子，17：為茭白黑粉菌野生型，18：質(zhì)粒pex2-egfp。

圖5是茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子southernblot結(jié)果圖，圖中：m：marker1kb，1-5：茭白黑粉菌gfp轉(zhuǎn)化子，6-9：茭白黑粉菌rfp轉(zhuǎn)化子，11：為茭白黑粉菌野生型，10：陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pex2-egfp。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1茭白黑粉菌t-dna插入轉(zhuǎn)化子的獲得

<1>茭白黑粉菌孢子的制備

在yepsa固體培養(yǎng)基(yeastextraction1％，peptone2％，sugar2％，agar2％)上將茭白黑粉菌培養(yǎng)2天后，將茭白黑粉菌接種至yeps液體培養(yǎng)基(yeastextraction1％，peptone2％，sugar2％)，搖床200rpm，培養(yǎng)2天，然后5000rpm離心收集菌體，加入ddh2o2制成1×10⁷個(gè)/ml孢子懸浮液(圖1))，獲得茭白黑粉菌孢子懸浮液，備用。上述一切操作在無(wú)菌的條件下進(jìn)行。

<2>含載體農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

利用質(zhì)粒pex2-egfp和pex2-rfp為轉(zhuǎn)化載體，pex2-egfp載體攜帶綠色熒光蛋白基因egfp和潮霉素抗性篩選基因hph(圖2a)，pex2-rfp載體攜帶紅色熒光蛋白基因rfp和潮霉素抗性篩選基因hph(圖2b)，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法將質(zhì)粒pex2-egfp和pex2-rfp載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；挑含有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌菌體至5ml的mm液體培養(yǎng)基中(狀觀霉素100μg/ml和利福平50μg/ml)，28℃，200rpm，培養(yǎng)過(guò)夜，用im液體培養(yǎng)基將菌液稀釋od600至0.15(左右)，28℃下預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6h(28℃，200rpm)，使菌液od600調(diào)至為0.5(左右)備用。其中，

mm液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基(minimalmedia，mm)，其配方為：1.45gkh2po4，2.05gk2hpo4，0.5gnh4no3，0.01gcacl2，0.3g(nh4)so4，2gglucose，0.01gfeso4，5mlz-buffer(含有以下成分cuso4*5h2o，znso4*7h2o，mnso4*h2o，h3bo3和nambo4*2h2o各0.01％。)，加雙蒸水定容至1000ml，ph6.7-7.0；誘導(dǎo)培養(yǎng)基(inducemedia，im)配方為：1gglucose，7.808gmes，1.45gkh2po4，0.5gnh4no3，0.6gmgso4·7h2o，0.01gcacl2，0.3gnacl，0.5g(nh4)so4，hcl調(diào)ph值到5.6，雙蒸水定容至1000ml。

<3>轉(zhuǎn)化

分別取步驟<1>中茭白黑粉菌孢子懸浮液和步驟<2>中農(nóng)桿菌培養(yǎng)液各100μl，混合后涂板于含as(200μmol/l)的覆蓋有纖維素濾膜的im固體培養(yǎng)基(由每升誘導(dǎo)培養(yǎng)基(inducemedia，im)加25克瓊脂構(gòu)成)上，24℃下共培養(yǎng)48h-72h(黑暗條件下)；轉(zhuǎn)移纖維素濾膜至含有潮霉素b(100μg/ml，)和頭孢噻肟鈉(300μg/ml)的yepsa，28℃下培養(yǎng)5-8d。將長(zhǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)化子用牙簽挑到含有潮霉素b(100μg/ml，)和頭孢噻肟鈉(300μg/ml)的yepsa上進(jìn)行二次篩選；第二次篩選獲得的抗潮霉素b的茭白黑粉菌即為轉(zhuǎn)化子。

實(shí)施例2茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子的鑒定

1)熒光顯微鏡鑒定

將茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子分生孢子置于熒光顯微鏡下觀察熒光。茭白黑粉菌野生型沒(méi)有檢測(cè)到熒光信號(hào)，經(jīng)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化子在熒光顯微鏡激發(fā)光下發(fā)綠光或紅光，證明農(nóng)桿菌的綠色熒光蛋白gfp和紅色熒光蛋白rfp已經(jīng)成功轉(zhuǎn)到茭白黑粉菌中并得以表達(dá)(圖3)。

2)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子pcr驗(yàn)證

以雙元載體pex2-egfp和pex2-rfp上的潮霉素基因(hph(seq.id.no.1))為模板設(shè)計(jì)引物hph-f：atgaaaaagcctgaactcaccgc(seq.id.no.2)/hph-r：gctgctccatacaagccaaccac(seq.id.no.3)對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行pcr擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約733bp)，以初步驗(yàn)證是否得到真正有插入的突變體。

pcr反應(yīng)液組成(25μl體系)：25.0μl反應(yīng)體系中，加入2.5μl10×pcrbuffer、2.0μl2.5μmol/ldntp、1.0μl5μmol/l正向引物hph-f、1.0μl5μmol/l反向引物hph-r，1.0utaqdna聚合酶和1.0μldna，用ddh20補(bǔ)至25.0μl。pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min，然后94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

所有測(cè)試的茭白黑粉菌gfp和rfp轉(zhuǎn)化子及質(zhì)粒pex2-egfp均能擴(kuò)增出預(yù)期的約733bp大小的片段，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的野生型菌株對(duì)照則擴(kuò)增不到任何條帶，說(shuō)明轉(zhuǎn)化子含有t-dna插入片段(圖4)

3)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子southernblot驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子t-dna插入和拷貝數(shù)，對(duì)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行southernblot。對(duì)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子dna采用hindiii內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，然后進(jìn)行0.8％瓊脂糖凝膠電泳。將電泳凝膠轉(zhuǎn)入尼龍膜(roche，cat.no.11417240001)，以引物hph-f/hph-r擴(kuò)增得潮霉素基因hph片段為探針，pcr反映體系同2)，隨后的分子雜交采用pcrdigprobesynthesiskit(roche，cat.no.11636090910)，顯色反應(yīng)采用dignucleicaciddetectionkit(roche，cat.no.11175041910)進(jìn)行，具體步驟參考產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)。

所有測(cè)試的9個(gè)茭白黑粉菌轉(zhuǎn)化子(其中5個(gè)為gfp轉(zhuǎn)化子，4個(gè)為rfp轉(zhuǎn)化子)均能檢測(cè)到雜交信號(hào)，且雜交信號(hào)表現(xiàn)豐富帶型；除了2個(gè)轉(zhuǎn)化子(圖5泳道5和7)為雙拷貝外，其他轉(zhuǎn)化子均為單拷貝，說(shuō)明t-dna在轉(zhuǎn)化子中為隨機(jī)插入，且77.8％以上為單拷貝(圖5)。