本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞體外擴(kuò)增方法，具體地涉及一種優(yōu)化的從幼稚T細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

免疫耐受是指免疫活性細(xì)胞接觸抗原性物質(zhì)時(shí)所表現(xiàn)出的一種主動(dòng)的不應(yīng)答狀態(tài)，是一種有別于免疫缺陷和免疫抑制生物學(xué)現(xiàn)象。免疫耐受不良與多種疾病相關(guān)，如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病(graft versus host disease,GVHD)和母胎免疫排斥等。在器官或組織移植中，傳統(tǒng)的免疫抑制藥物雖能顯著延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，但其伴隨的副作用是患者整體免疫功能下降、感染機(jī)會(huì)增加，并可能誘發(fā)腫瘤等，極大地限制了臨床器官移植的進(jìn)一步發(fā)展；在母胎免疫排斥所導(dǎo)致的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病中，使用免疫抑制藥物治療可能對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育造成潛在的不良影響。因此細(xì)胞靶向性誘導(dǎo)免疫耐受日益受到重視。通過(guò)體外誘導(dǎo)的方式，擴(kuò)增一種安全有效、半衰期長(zhǎng)、甚至注入體內(nèi)后具有再生能力的，能誘導(dǎo)特異性免疫耐受的細(xì)胞具有廣闊的應(yīng)用前景。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是一大類具有免疫調(diào)節(jié)和抑制功能的T細(xì)胞亞群，它參與并維持機(jī)體的免疫自穩(wěn)，其數(shù)量和功能的穩(wěn)定與腫瘤逃逸、自身免疫性疾病、X連鎖隱性遺傳病IPEX(免疫調(diào)節(jié)異常，多內(nèi)分泌腺病，腸病，X連鎖綜合征)、移植物抗宿主病(GVHD)和妊娠免疫耐受等密切相關(guān)。根據(jù)來(lái)源不同，Treg可分為兩大類：(1)天然型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural Treg,nTreg)：成熟于胸腺，表達(dá)CD25分子和Foxp3，約占外周CD4⁺T細(xì)胞的5％‐10％；(2)誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(induced Treg,iTreg)：在不完全暴露抗原刺激和/或聯(lián)合刺激的特定條件下，由幼稚T細(xì)胞(T cells)在體內(nèi)周圍組織中激活擴(kuò)增而來(lái)。nTreg和iTreg雖然來(lái)源不同，但其表型和免疫學(xué)功能相似，均以表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3為最主要特征，表達(dá)CTLA‐4、ICOS及OX‐40等表面分子，分泌IL‐10、TGF‐β等細(xì)胞因子，通過(guò)多種途徑抑制效應(yīng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答并促進(jìn)抑制型細(xì)胞因子分泌，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的免疫自穩(wěn)、誘導(dǎo)宿主對(duì)移植物的免疫耐受，是機(jī)體以主動(dòng)方式獲得并維持自身免疫耐受的重要方式。

近來(lái)，過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究顯示，CD4⁺、CD25⁺Treg可以推遲甚至治療同種異體移植物排斥反應(yīng)。在動(dòng)物模型中，IgG介導(dǎo)擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表位組合物可預(yù)防、治療甚至治愈自身免疫疾病的小鼠。對(duì)Treg的基礎(chǔ)和臨床研究，尤其是臨床應(yīng)用潛能的研究是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)。然而，nTreg僅占正常人周圍血CD4⁺T細(xì)胞的5‐15％，大大地限制了其臨床應(yīng)用。在已報(bào)道的Treg擴(kuò)增方法中，iTreg多存在以下問(wèn)題：使用anti‐CD3/CD28‐磁珠作為誘導(dǎo)劑，擴(kuò)增成本高；使用異種或異體血清，具有潛在生物安全問(wèn)題；需要多次分選，操作復(fù)雜且增加成本；此外，還存在擴(kuò)增誘導(dǎo)周期較長(zhǎng)、穩(wěn)定性欠佳等其他問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)以上要解決的技術(shù)問(wèn)題，提供一種從幼稚T細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，該方法操作簡(jiǎn)便、安全有效、擴(kuò)增誘導(dǎo)周期較短、穩(wěn)定性較好、成本經(jīng)濟(jì)。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的從幼稚T細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，該方法的步驟包括：

(1)anti‐CD3抗體包被：細(xì)胞培養(yǎng)，在24孔培養(yǎng)板中每孔加入含0.1‐2μg/ml anti‐CD3抗體的PBS 1mL置于4℃孵育1h至24h備用，其他孔板根據(jù)體積或底面積換算；

(2)外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離：抽取肝素抗凝靜脈血20ml，取3支15ml管離心管，每管加入淋巴細(xì)胞分離液4ml，將6‐7mL外周血沿管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液層面之上，800g離心17min，分別收集血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞，血漿56℃水浴滅活補(bǔ)體，外周血單個(gè)核細(xì)胞加入足量的生理鹽水洗滌1‐2次；

(3)磁珠分選幼稚T細(xì)胞：將所述步驟(2)中獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，加PBS洗滌，用美天旎磁珠陰性分選幼稚T細(xì)胞；每10⁷細(xì)胞以40μl buffer重懸，加入10μl CD4⁺T Cell Biotin‐Antibody Cocktail II抗體，混勻后4℃孵育5min；加入30μl buffer、20μl的Naive CD4⁺T Cell Micro Bead Cocktail II磁珠，混勻后4℃孵育10min，得到細(xì)胞混合液；用3‐5ml buffer平衡LD型細(xì)胞分選柱，將所得的細(xì)胞混合液加入平衡后的LD型細(xì)胞分選柱，用3‐5ml buffer洗滌裝有細(xì)胞混合物的離心管后加入細(xì)胞分選柱，收集過(guò)柱后的細(xì)胞懸液，得到陰選的未被抗體結(jié)合的細(xì)胞，即幼稚T細(xì)胞；

(4)誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)：將包被anti‐CD3的培養(yǎng)板從4℃取出于置于37℃培養(yǎng)箱平衡；吸去PBS；將幼稚T細(xì)胞重懸于Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整至0.2‐2×10⁶/孔接種于包被anti‐CD3的培養(yǎng)板。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方比例為：已添加2.06mM Glutamax‐I和25mM HEPES buffer的RPMI 1640培養(yǎng)基，向所述RPMI 1640培養(yǎng)基中加入10％v/v自體血清，并加入終濃度為200U/ml重組人IL‐2、1‐5ng/ml重組人TGF‐β1、0.1‐10μg/ml anti‐CD28、10‐200nM雷帕霉素。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述方法還包括Treg細(xì)胞傳代步驟，在該步驟中，根據(jù)細(xì)胞情況，離心計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，將其重懸于所述Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)整至0.2‐2×10⁶/孔，接種于另一個(gè)包被anti‐CD3的24孔板。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述方法還包括Treg細(xì)胞凍存步驟，在該步驟中，所述凍存液的配方如下：向已添加2.06mM Glutamax‐I和25mM HEPES buffer的RPMI 1640培養(yǎng)基中，按體積百分比(v:v)加入10％DMSO和20％自體血清。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述方法還包括Treg細(xì)胞復(fù)蘇步驟，在該步驟中，于37℃水浴復(fù)蘇細(xì)胞，使用5ml的所述Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后，重懸于所述Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，調(diào)整至0.2‐2×10⁶/孔接種于包被anti‐CD3的24孔板中。

本發(fā)明的方法采用預(yù)包被的anti‐CD3抗體的培養(yǎng)板作為擴(kuò)增誘導(dǎo)劑；在使用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的同時(shí)，吸取上層自體血清作為T(mén)reg培養(yǎng)血清，從而避免了同種異體血清和異種血清潛在的生物安全問(wèn)題及免疫排異反應(yīng)，并且節(jié)約了商品血清成本；此外，本發(fā)明僅在培養(yǎng)開(kāi)始階段用磁珠陰性分選幼稚T細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程不需要進(jìn)行多次分選，從而降低成本，減少污染機(jī)會(huì)和對(duì)細(xì)胞的損傷和消耗，節(jié)省操作時(shí)間；本發(fā)明還進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化了每個(gè)培養(yǎng)孔的細(xì)胞數(shù)、培養(yǎng)基量和刺激劑濃度、治療時(shí)間和治療的細(xì)胞總數(shù)、細(xì)胞濃度，使擴(kuò)增和治療效果更為穩(wěn)定。利用表型和功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證體外擴(kuò)增Treg的擴(kuò)增效率和純度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明方法的擴(kuò)增誘導(dǎo)周期是12‐21天，Treg細(xì)胞純度達(dá)到85％以上。

附圖說(shuō)明

圖1示出了Treg抑制功能實(shí)驗(yàn)的操作示意圖。

圖2示出了使用根據(jù)本發(fā)明的方法誘導(dǎo)增殖后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

圖3示出了Treg表型和CD25、CD127、Foxp3表達(dá)的流式分析結(jié)果。

圖4示出了Treg表型和IL‐10、TGF‐β、IFN‐γ表達(dá)的流式分析結(jié)果。

圖5示出了Treg抑制功能實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。如未特別指出，本發(fā)明的實(shí)施例中所使用試劑、儀器均為本領(lǐng)域已知并可獲得的。

實(shí)施例1

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)化的從幼稚T細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的方法，其具體步驟如下：

步驟1. anti‐CD3抗體包被

細(xì)胞培養(yǎng)前24h至1h，在U型或平底培養(yǎng)板中每孔加入含0.1‐2μg/ml(優(yōu)選為1μg/ml)的anti‐CD3(OKT3，eBioscience)抗體的PBS(磷酸鹽緩沖鹽水)，24孔板加1ml，其他孔板根據(jù)體積或底面積換算。置于4℃直至使用。

步驟2.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離

抽取肝素抗凝靜脈血20ml，取3支15ml管離心管，每管加入淋巴細(xì)胞分離液4ml，將6‐7mL外周血沿管壁緩慢置于淋巴細(xì)胞分離液層面之上，800g離心17min，分別收集血漿和PBMC，血漿56℃水浴滅活補(bǔ)體，PBMC加入足量的生理鹽水洗滌1‐2次。

步驟3.磁珠分選Naive T細(xì)胞(幼稚T細(xì)胞)

1)將步驟2中獲得的PBMC進(jìn)行計(jì)數(shù)，加PBS洗滌一遍，用美天旎磁珠(CD4⁺T Cell Isolation Kit II,human,cat 130‐094‐131)陰性分選幼稚T細(xì)胞；

2)每10⁷細(xì)胞以40μl buffer重懸(以下所加buffer及抗體均按10⁷細(xì)胞計(jì)算)，加入10μl CD4⁺T Cell Biotin‐Antibody Cocktail II抗體?；靹蚝笾糜诒?℃孵育5min；

3)加入30μl buffer、20μl的Naive CD4⁺T Cell Micro Bead Cocktail II磁珠?；靹蚝笥诒浞跤?0min；

4)用3‐5ml buffer平衡LD型細(xì)胞分選柱，將步驟3)所得的細(xì)胞混合液加入平衡后的柱子，用3‐5ml buffer洗滌裝細(xì)胞混合物的離心管后加入柱子，收集過(guò)柱后的細(xì)胞懸液即為陰選的未被抗體結(jié)合的細(xì)胞，此為幼稚T細(xì)胞(T細(xì)胞)；

5)將柱子從磁鐵上取下，加入5ml buffer將液體打出后收集，此為其他細(xì)胞(即非幼稚T細(xì)胞)。

步驟4.誘導(dǎo)擴(kuò)增培養(yǎng)

1)提前至少20min將包被anti‐CD3的培養(yǎng)板從4℃冰箱取出，置于37℃培養(yǎng)箱預(yù)熱平衡。

2)吸去PBS，不可吹打已包被抗體的區(qū)域。

3)將幼稚T細(xì)胞重懸于Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整至0.2‐2×10⁶/孔接種于包被anti‐CD3的培養(yǎng)板。Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：RPMI 1640培養(yǎng)基(已添加2.06mM Glutamax‐I和25mM HEPES buffer)加10％v/v自體血清，并加入終濃度為200U/ml rh IL‐2，1‐5ng/ml rh TGF‐β1，0.1‐10μg/ml anti‐CD28，10‐200nM Rapamycin(雷帕霉素)。

4)未使用的孔加滿PBS以降低邊緣蒸發(fā)效應(yīng)，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3‐5天。

步驟5.Treg細(xì)胞傳代

3‐5天后根據(jù)細(xì)胞情況，離心計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，重懸于Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整至0.2×10⁶‐2×10⁶/ml，接種于另一個(gè)包被anti‐CD3的24孔板，其他孔板根據(jù)體積或底面積換算。

步驟6.每2‐3天重復(fù)步驟5，直至細(xì)胞凍存，或者從抽血培養(yǎng)開(kāi)始算第12‐15天，取部分細(xì)胞流式分析Treg細(xì)胞比例及表型，并進(jìn)行Treg抑制功能實(shí)驗(yàn)。

步驟7. Treg細(xì)胞凍存

配制凍存液：RPMI 1640Medium(已添加2.06mM Glutamax‐I和25mM HEPES buffer)按體積百分比加10％DMSO、20％自體血清，置于4℃冰箱直至使用。根據(jù)需要調(diào)整Treg細(xì)胞數(shù)重懸于凍存液中，‐80℃冰箱過(guò)夜，置于液氮中保存。

步驟8. Treg細(xì)胞復(fù)蘇

37℃水浴復(fù)蘇細(xì)胞，5ml Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后，重懸于Treg誘導(dǎo)培養(yǎng)基，調(diào)整至0.2×10⁶‐2×10⁶/ml接種于包被anti‐CD3的24孔板，其他孔板根據(jù)體積或底面積換算。重復(fù)步驟6。

步驟9. Treg效能評(píng)價(jià)

在培養(yǎng)過(guò)程中，每天鏡下觀察細(xì)胞增殖情況，拍照存檔；每3天取2×10⁵細(xì)胞流式分析Treg純度和各種細(xì)胞因子表達(dá)：包括CD4、CD25、CD45‐RA、CD127、Foxp3、IL‐10、TGF‐β、IFN‐γ等；于第10‐15天，進(jìn)行Treg抑制功能實(shí)驗(yàn)：CFSE(羧基熒光素雙乙酸鹽琥珀酰亞胺酯)是一種熒光探針，可穿透細(xì)胞膜后與胞內(nèi)蛋白共價(jià)結(jié)合，定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，水解后釋放出綠色熒光。細(xì)胞核中熒光染色最強(qiáng)。CFSE不影響細(xì)胞的增殖能力，在細(xì)胞增殖過(guò)程中，其熒光強(qiáng)度隨細(xì)胞分裂而逐級(jí)遞減，熒光平均分配至兩個(gè)子代細(xì)胞中，因此其熒光強(qiáng)度是親代細(xì)胞的一半，根據(jù)這一特性，它可被用于檢測(cè)細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的估算及細(xì)胞分裂等方面。本發(fā)明采用CFSE染色的PBMC與梯度稀釋的Treg共培養(yǎng)，流式檢測(cè)CFSE，CFSE熒光強(qiáng)度的衰減程度與效應(yīng)細(xì)胞PBMC的增殖程度正相關(guān)，與Treg抑制能力負(fù)相關(guān)，對(duì)比不加Treg與添加Treg，效應(yīng)細(xì)胞CFSE熒光強(qiáng)度的衰減程度的變化即可知道Treg的抑制功能，具體操作方法如下。

9.1包被孔板：

用冷的PBS稀釋?duì)俩\CD3(0.1‐0.5μg/ml)，混勻后在96孔板每孔加入100μl包被抗體，置于4℃冰箱過(guò)夜。從6‐12孔全部包被抗體。

9.2應(yīng)答細(xì)胞CFSE染色：

(1)取出一管CFSE(A)溶解于18μl DMSO，配制成5mM的CFSE儲(chǔ)液；

(2)用PBS或RPMI(無(wú)血清，血清可終止染色)將CFSE儲(chǔ)液稀釋成10μM(2X)工作液備用；

(3)用15ml離心管收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用預(yù)熱好的PBS洗滌2次以去除血清殘留，將細(xì)胞重懸于PBS，調(diào)整濃度至2×10⁶/ml；加入等體積CFSE(2×)，混勻，置于37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，期間顛倒混勻數(shù)次；

(4)加入含10％血清的培養(yǎng)基至15ml，充分混勻以終止反應(yīng)；300×g離心5min，去上清；

(5)用10％血清培養(yǎng)基再洗滌一次；

(6)用完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整濃度至2×10⁶/ml(即2×10⁵/100μ1)。

9.3 Treg與應(yīng)答細(xì)胞混合培養(yǎng)：

用CD127磁珠陰選Treg，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×10⁶/ml(即1×10⁵/100μ1)(可先用127磁珠陰選，再用CD25⁺磁珠陽(yáng)選富集Treg)。

如圖1所示，在96孔板中第5‐11列加入50μl RPMI完全培養(yǎng)基，第12列加入100μl Treg(僅有Treg的對(duì)照)。從第12列中吸取50μl細(xì)胞于第11列(2：1)，混勻，再?gòu)牡?1列吸50μl于第10列，以此類推直至第7列。最后從第7列吸取50μl細(xì)胞丟棄(32:1)。從第6‐11列，每孔加入CFSE染色的T細(xì)胞50μl(1×10⁵/孔)，第6列為只有T細(xì)胞的對(duì)照，在第5列加入50μl T細(xì)胞(1×10⁵/孔，不刺激的對(duì)照)。在第12列加入50μl RPMI完全培養(yǎng)基使各孔終體積保持一致。置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3‐4天。A、B、C為復(fù)孔。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

使用根據(jù)本發(fā)明的方法誘導(dǎo)增殖后的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生長(zhǎng)情況如圖2所示。其中，圖2中的A、B、C、D分別為day2(第2天)、day4(第4天)、day6(第6天)、day12(第12天)的細(xì)胞生長(zhǎng)情況。由圖2可見(jiàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，刺激后細(xì)胞較刺激前大，胞膜較光滑，碎片較少，背景干凈。

圖3和圖4分別示出了Treg表型和轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)志以及細(xì)胞因子表達(dá)的流式分析結(jié)果。結(jié)果顯示，培養(yǎng)細(xì)胞向CD127^lo/‐CD25⁺Foxp3⁺Treg方向分化。

圖5示出了Treg抑制功能實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示，加入培養(yǎng)后，Treg能明顯抑制效應(yīng)細(xì)胞的增殖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明方法的擴(kuò)增誘導(dǎo)周期是12‐21天，CD25⁺Foxp3⁺Treg細(xì)胞純度達(dá)到85％以上。