本發(fā)明涉及昆蟲基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種綠盲蝽ApEps15基因及其在RNAi介導(dǎo)的害蟲防治方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

昆蟲害蟲和人類戰(zhàn)爭常常伴隨著難以預(yù)測的新趨勢。2000年以前，綠盲蝽并非是我國棉產(chǎn)區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要害蟲，原因是為了防止棉鈴蟲所使用的農(nóng)藥把綠盲蝽的數(shù)量保持低水平。然而1997年開始，Bt棉花的商業(yè)化種植有效控制了棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的危害，綠盲蝽逐漸成為危害棉花的主要害蟲。目前對綠盲蝽的防治主要依靠化學(xué)防治，該方法不僅容易導(dǎo)致其產(chǎn)生抗藥性，而且對環(huán)境造成污染。因此，發(fā)展一種經(jīng)濟有效、環(huán)境友好的方法控制綠盲蝽具有重要意義。利用轉(zhuǎn)基因作物進行抗蟲可以有效抵抗蟲害，并且安全環(huán)保，這些優(yōu)點使轉(zhuǎn)基因作物成為抗蟲策略的首選?；谀壳耙訰NAi為基礎(chǔ)發(fā)展抗蟲轉(zhuǎn)基因作物是當前的研究熱點，且該技術(shù)在害蟲防治領(lǐng)域已經(jīng)取得一些進展。

RNAi指的是內(nèi)源或外源RNA被RNase III內(nèi)切酶DICER切成大小20–25bp，小dsRNA片段，然后這些小片段進一步被進入RNAi誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體內(nèi)并被解開雙鏈，把反義鏈作為識別同源性mRNA的引導(dǎo)者，最后降解同源性mRNA的過程。表皮生長因子是一種小肽，由53個氨基酸殘基組成，是類EGF大家族的一個成員，是一種多功能的生長因子，在體內(nèi)體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用。表皮生長因子通過與細胞表面的受體，表皮生長因子受體(EGFR)結(jié)合而起作用。EGF一旦同應(yīng)答細胞表面的特異受體結(jié)合，便促進受體二聚化并使細胞質(zhì)位點磷酸化。被激活的受體至少可與5種具有不同信號序列的蛋白結(jié)合，進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。EGF能夠廣泛促進細胞的增殖。

Eps15起初被鑒定為與表皮生長因子受體(EGFR)激酶活性有關(guān)。其由三個部分組成的。研究表明Eps15的干擾影響表皮生長因子受體(EGFR)對生長因子(EGF)的內(nèi)吞作用。所以對昆蟲生長發(fā)育中起著重要的作用。由此可見，該基因很有可能將成為一種新的靶標來設(shè)計研發(fā)RNAi介導(dǎo)的害蟲防治策略方面能夠應(yīng)用。然而至今在昆蟲中RNAi介導(dǎo)Eps15沉默研究幾乎沒有。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種綠盲蝽表皮生長因子途徑底物15命名為ApEps15基因，在綠盲蝽生長發(fā)育和生理過程中起著非常重要的作用，沉默該基因后，對綠盲蝽個體發(fā)育造成的影響。

本發(fā)明的另一個目的提供一種綠盲蝽ApEps15基因在RNAi介導(dǎo)的害蟲防治方面的應(yīng)用。

綠盲蝽ApEps15基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

綠盲蝽ApEps15基因在RNAi介導(dǎo)的害蟲防治方面的應(yīng)用。

所述RNAi介導(dǎo)中，合成的dsRNA通過注射或飼喂進入綠盲蝽體內(nèi)。

所述合成dsRNA所對應(yīng)的靶標片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述注射體積為41.6nl，注射dsRNA濃度為10μg/μl，注射部位為綠盲蝽的后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)。

所述飼喂的飼料總體積200ul，dsRNA濃度0.5ug/ul。

所述綠盲蝽為三齡綠盲蝽。

本發(fā)明中利用生物信息學(xué)技術(shù)，分析了綠盲蝽成蟲和幼蟲轉(zhuǎn)錄組，并獲得了ApEps15基因，然后按下面循序進項(1)取綠盲蝽總RNA，通過RT-PCR得到cDNA；(2)設(shè)計帶有T7序列的特異性引物；(3)通過PCR技術(shù)擴增目的基因片段：以第一步得到的cDNA為模板，第二步設(shè)計的特異引物擴增，得到帶有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(4)構(gòu)建含有選定目的基因片段的載體并轉(zhuǎn)入宿主大腸桿菌中，培養(yǎng)，提取含有目的基因片段的質(zhì)粒；

(5)以上一步所提取含有目的基因片段的質(zhì)粒為模板，第二步設(shè)計的特異性引物擴增，得到大量含有T7序列和目的基因片段的PCR產(chǎn)物；(6)利用T7RNA聚合酶將上一步得到的PCR產(chǎn)物合成為目的基因片段dsRNA；(7)進行顯微注射實驗把靶標dsRNA傳遞到體內(nèi)

(8)人工飼料的配制(9)將dsRNA混合到人工飼料中通過封口膜包裝飼喂3齡幼蟲24小時后用正常飼料繼續(xù)飼養(yǎng)(9)統(tǒng)計死亡率，觀察表型。在此基因內(nèi)重新設(shè)計一對引物，提取綠盲蝽不同組織RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以這些cDNA為模板進行RT-PCR反應(yīng)。

附圖說明

圖1實驗所用dsRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖。

其中A為ESP-15的dsRNA，B為GFP的dsRNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。

圖2 ESP-15dsRNA顯微注射后存活率。

圖3 ESP-15dsRNA顯微注射后Qpcr結(jié)果。

圖4 ESP-15dsRNA顯微注射誘導(dǎo)的異常表型，其中左圖為空白對照，右圖為實驗組。

圖5綠盲蝽ApEps15的dsRNA飼喂傳遞7天后存活率。

圖6綠盲蝽ApEps15的dsRNA飼喂后表型，其中左圖為空白對照，右圖(2張)為實驗組。

具體實施方式

下面通過具體實施例進一步說明本發(fā)明。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為市售常規(guī)生化試劑。

實施例1ApEps15基因克隆、dsApEps15的具備，注射和飼喂實驗

1、ApEps15基因的生物信息學(xué)分析

本實驗室事前對綠盲蝽進行轉(zhuǎn)綠組測序，成功得到綠盲蝽63029條基因序列，并注釋了其中25760條基因序列。利用生物信息學(xué)技術(shù)及相關(guān)在線軟件對綠盲蝽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行初步的分析，通過在線程序NCBI Blast等程序的幫助下確定了到綠盲蝽ApEps15基因，見序列表SEQ ID NO1。

2、供試昆蟲及組織收集

綠盲蝽為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所使用新鮮玉米(ZeamaysL)及四季豆(Phaseolusvulgaris L.)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25-28℃，相對濕度為60％-70％，光照為16:8(L:D)。

3、RNA的提取

昆蟲總RNA提取的全部過程在無RNase條件下進行。整個提取步驟如下所示：

1)取-70℃保存的昆蟲組織，加入已經(jīng)用液氮預(yù)冷的玻璃勻漿器中，立即向勻漿器內(nèi)加入1mL Trizol試劑，將組織充分研磨磨碎；將研磨好的組織溶液用無RNA酶的槍頭轉(zhuǎn)移到無RNA酶的1.5mL離心管中，暫時置于冰上。

2)4℃，12000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到新的無RNA酶的1.5mL離心管中。

3)將上清在室溫下放置5min后，向離心管中加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩15s，再室溫靜置2-3min。

4)4℃，12000g離心15min，混合物在此后分層，下層為有機相，上層為水相(RNA就在水相中)，用無RNA酶的槍頭將上層水相轉(zhuǎn)移到新的無RNA酶的1.5mL離心管中，注意盡量不要吸到中間層，以免造成蛋白質(zhì)或DNA污染。

5)加入0.5mL異丙醇，混勻后，室溫靜置10min來沉淀RNA。

6)4℃，12000g離心10min后，觀察到的沉淀即為RNA,棄上清(盡量吸凈)，加入1mL 75％的乙醇(用DEPC水配置，現(xiàn)用現(xiàn)配)，輕輕震蕩離心管懸浮沉淀，洗滌沉淀。

7)4℃，7500g離心10min后，棄上清(盡量吸凈)，超凈臺中干燥沉淀5-10min。

8)加入10-20μL RNA-free水(根據(jù)RNA量而定)，輕彈離心，使沉淀充分溶解。

9)55-60℃溫育后，取1μL樣品稀釋至5μL，其中2.5μL進行電泳檢測，2.5μL用NanoDrop儀器檢測；剩余的樣品用于cDNA合成或者保存于-70℃冰箱。

4、第一鏈cDNA的合成

整個反轉(zhuǎn)錄過程在無RNA酶污染的條件下進行，操作步驟按Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit進行，具體如下：

1)在無RNA酶的PCR管中依次加入：2μg RNA(根據(jù)NanoDrop定量的結(jié)果計算應(yīng)該加入RNA的體積數(shù))，DNaseⅠ1μL，1μL Ribolock RNase Inhibitor，1μL 10×Reaction Buffer with MgCl₂，用RNA-free水將體系補足到10μL；輕微震蕩后離心；

2)37℃溫育30min后，向體系內(nèi)加入1μL 50mM EDTA，震蕩后離心，然后65℃溫育10min,以去除DNA酶I；

3)加入1μLoligo-dT，用RNA-free水補至12μL；

4)65℃溫育5min后，立即置于冰上；

5)依次加入下列試劑，使體系達到20μL：4μL的5×Reaction buffer；2μL的dNTP Mix(10mM)；1μL的Revert Aid Reverse Transcriptase和1μL的Ribolock RNase Inhibitor；簡單混勻離心；

6)42℃溫育1h，然后再70℃溫育5min；

7)合成后存于-20℃或者-70℃冰箱，使用前按情況稀釋若干倍。

5、靶標基因的克隆

本發(fā)明選取了持家基因、能量代謝相關(guān)基因和細胞凋亡相關(guān)基因上的基因片段，通過注射法研究其對昆蟲的影響，GFP基因上的片段作為對照。持家基因又稱管家基因，是指所有細胞中均要表達的一類基因，其產(chǎn)物是對維持細胞基本生命活動所必需的；而能量代謝相關(guān)基因和細胞凋亡相關(guān)基因也在綠盲蝽生長發(fā)育和生理過程中起著非常重要的作用。本發(fā)明選取此類基因上的片段，利用注射法進行RNAi將其沉默，研究觀察沉默該基因后，對綠盲蝽個體發(fā)育造成的影響。GFP即綠色熒光蛋白，在昆蟲體內(nèi)并不存在，故大量研究中將其作為對照基因合成dsRNA。

1.靶標基因引物的設(shè)計：

(1)利用BLAST檢索數(shù)據(jù)庫，搜索綠盲蝽的相近物種同一靶標基因的蛋白或者cDNA編碼的氨基酸序列，用綠盲蝽成蟲若蟲轉(zhuǎn)錄組組建的本地BLAST庫進行比對查詢，確定所選基因的序列。

(2)根據(jù)靶標基因的片段，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計帶T7啟動子的引物，引物設(shè)計原則如下：

a.引物設(shè)計的區(qū)間要在靶標基因的編碼區(qū)，中間片段大小在400～500bp左右。

b.中間片段盡量選在靶標基因的特異區(qū)域。

c.引物之間不能形成引物二聚體，交叉二聚體。

2.根據(jù)以上引物設(shè)計原則設(shè)計引物后，送至華大基因進行引物合成。

3.相關(guān)靶標基因的引物序列見表1。

表1.實驗所用引物

4.目的片段的PCR擴增、測序及序列分析

1).以綠盲蝽cDNA為模板，用ExTaq酶擴增表1-1中基因。反應(yīng)體系為25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反應(yīng)緩沖液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl cDNA，1μl F引物(10mM)，1μl R引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60-65℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

2).PCR產(chǎn)物用溶解在1×TAE緩沖液的1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。檢測正確的PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收(操作步驟按試劑盒內(nèi)附帶的說明書進行)，回收的片段連接到pGME-T載體上(體系為8μl膠回收產(chǎn)物、1μl 10×T4鏈接反應(yīng)緩沖液、0.5μl pGME-T載體和0.5μl T4連接酶，16℃條件下連接過夜)，連接體系轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化步驟按感受態(tài)細胞附帶的說明書進行)，培養(yǎng)過夜后，挑取8個陽性克隆進行PCR驗證(體系和條件同上)，將檢測正確的克隆用液體LB培養(yǎng)基(含氨芐抗生素)培養(yǎng)過夜檢驗?zāi)康钠涡蛄小?/p>

3).根據(jù)測序結(jié)果，將正確的菌株加入含有氨芐抗生素的新鮮LB培養(yǎng)基重新?lián)u菌，獲得新鮮的菌液，將1ml菌液和百分之八十的甘油按照9:1比例混合，存于-80℃低溫冰箱保存。將剩余的菌液進行質(zhì)粒提取。序列結(jié)果見序列表SEQ ID NO2。

5.dsRNA模板的制備

以帶有靶標基因片段的質(zhì)粒為模板，用聚合酶擴增。反應(yīng)體系為25μl：17μl重蒸水，2.5μl 10×反應(yīng)緩沖液，2μl dNTPs(2.5mM)，1μl載有靶標基因片段的質(zhì)粒，1μl正向(F)引物(10mM)，1μl反向(R)引物(10mM)和0.5μl DNA聚合酶。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55-60℃退火45s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

將1μl PCR產(chǎn)物用溶解在1×TAE緩沖液的1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。如果所得條帶長度與目的片段長度一致，并且結(jié)果顯示為單一明亮的條帶，則將剩余的PCR產(chǎn)物進行酚氯仿抽提與純化。

PCR產(chǎn)物的酚氯仿抽提的步驟：

1).將需要純化的PCR產(chǎn)物用無RNA酶的H2O定容至200μl

2).加入等體積(200μl)的酚氯仿試劑(一定取酚氯仿試劑的下層，并且拿試劑瓶時要平穩(wěn)，不能晃動)。

3).溫和混勻，在4℃離心機下離心(12000rpm，4℃)15min.

4).4.取上清，加入1/10體積(20μl)的3M乙酸鈉(pH5.2)和2倍體積(400μl)的100％乙醇(-20℃貯存)，溫和混勻后放于-20℃靜置沉淀至少3小時或者過夜。

5).在4℃離心機下離心(12000rpm，4℃)30min.

6).白色沉淀積于離心管底部，棄上清液(為防止沉淀一起被吸出，可保留些許上清液)，加入75％乙醇(-20℃貯存)輕輕混勻，洗滌沉淀

7).在4℃離心機下離心(7500rpm，4℃)5min.

8).將乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的殘留液體用10μl移液槍慢慢吸出。將離心管開蓋放入37℃恒溫培養(yǎng)箱干燥，10min左右，待乙醇全部揮發(fā)。

9).加入5μl RNase–free H2O輕彈管底，讓沉淀充分均勻溶解于無RNA酶的H₂O。

10).取1μl溶液溶于4μl無RNA酶的H2O中，用濃度測量儀器檢測濃度和OD值。用凝膠電泳檢測產(chǎn)物單一性，如果檢測條帶是單一明亮的條帶，并且其OD值為：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

則說明PCR產(chǎn)物質(zhì)量良好，可以作為下一步合成dsRNA的模板使用。

6、dsRNA的合成

1.將ATP，CTP，GTP，UTP(100mM)放于冰上慢慢融化，5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液室溫融化，T7RNA聚合酶放于-20℃貯存，隨用隨拿，用完立即放入-20℃環(huán)境下貯存。溶解以后輕彈管底，瞬時離心，將試劑離心到管底。

2.按以下比例將試劑混合：

試劑 50μl體系

反轉(zhuǎn)錄緩沖液 10μl

ATP，CTP，GTP，UTP(100mM) 各1μl

RNA酶抑制劑 1.25μl

模板 1.5μg

無RNA酶的H2O定容至 49μl

T7RNA聚合酶 1μl

輕彈混勻，瞬時離心。放入37℃金屬浴中4小時。

3.從金屬浴中取出離心管，放入75℃金屬浴中5min，然后放置室溫冷卻(切勿放在冰上)。吸出1μl，稀釋5倍，凝膠電泳檢測產(chǎn)物條帶。

4.去除DNA和dsRNA.按照比例加入下列試劑：

試劑 60μl體系

10×反應(yīng)緩沖液 6μl

DNA酶Ⅰ 2μl

RNA酶 0.5μl

無RNA酶的H2O 2.5μl

dsRNA產(chǎn)物49μl

充分混勻，輕彈管底，瞬時離心后，放入金屬浴37℃30min，加入EDTA試劑1μl,65℃金屬浴中放置5min終止反應(yīng)。取1μl產(chǎn)物，稀釋5倍，凝膠電泳檢測產(chǎn)物單一性，濃度檢測儀器檢測濃度和OD值。如果檢測條帶是單一明亮的條帶，并且其OD值為：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

則說明dsRNA質(zhì)量良好，可以進行下一步dsRNA酚氯仿抽提。

7、dsRNA的酚氯仿抽提

1.將需要純化的dsRNA(～60μl)用無RNA酶的H2O定容至200μl(可根據(jù)實際需要等比例擴大體系)。

2.加入1/2體積(100μl)的水飽和酚試劑(一定取水飽和酚試劑的下層，并且拿試劑瓶時要平穩(wěn)，不能晃動)和1/2體積的氯仿(100μl)。

3.輕輕混勻，在4℃離心機下離心(12000rpm，4℃)15min。

4.取上層水相，加入的等體積氯仿(200μl)，輕輕混勻，在4℃離心機下離心(12000rpm，4℃)15min。

5.取上層水相，加入1/10體積(20μl)的3M乙酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積(500μl)的100％乙醇(-20℃貯存)，溫和混勻后放于-20℃靜置沉淀至少3小時或者過夜。

6.在4℃離心機下離心(12000rpm，4℃)30min。

7.白色沉淀積于離心管底部，棄上清液(為防止沉淀一起被吸出，可保留些許上清液)，加入80％乙醇(-20℃貯存)輕輕混勻，洗滌沉淀。

8.在4℃離心機下離心(7500rpm，4℃)5min。

9.將乙醇慢慢吸出(注意不要吸出沉淀)，接近沉淀的殘留液體用10μl移液槍慢慢吸出。將離心管開蓋放入37℃恒溫培養(yǎng)箱干燥，10min左右，待乙醇全部揮發(fā)。

10.加入5μl無RNA酶的H2O輕彈管底，讓沉淀充分均勻的溶解于無RNA酶的H2O中。

11.取1μl溶解的dsRNA產(chǎn)物稀釋于4μl DEPC H2O中，用凝膠電泳檢測產(chǎn)物單一性，并用濃度檢測儀器檢測濃度和OD值。如果檢測的條帶是單一明亮的條帶，并且其OD值為：

260/280:1.8-2.0

260/230:1.8-2.0

則證明dsRNA質(zhì)量良好，可以進行綠盲蝽體內(nèi)注射RNAi實驗。

8、事實熒光定量PCR與分析

實驗采用的是2-ΔΔCT法進行相對定量，即通過內(nèi)參基因校準不同樣品的模板加入總量的差異。ΔΔCT＝(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)實驗組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組，2-ΔΔCT的意義即為：實驗組的目的基因相對于對照組的目的基因的倍數(shù)，由此即可得到相對表達量。本實驗所用的引物如表2所示

表2實時熒光PCR實驗所用引物

本實驗中，以α-tubulin,GADPH為內(nèi)參基因，按照TakaRa公司的SYBR PRemix Ex TaqTM試劑盒說明書對綠盲蝽對照組和實驗組進行Real Time PCR反應(yīng)，以實驗的三組基因的第1d、2d、3d、4d、5d樣品的cDNA模板。反應(yīng)體系以及反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)體系為20μL

9、綠盲蝽RNAi飼喂方法的具體實施

9.1齡(3L)綠盲蝽的準備

本發(fā)明中所選綠盲蝽為3L若蟲，現(xiàn)以3L若蟲的收集方法如下：收集1L初孵若蟲(200～300頭)，放入養(yǎng)蟲盒中，盒中放入干凈濾紙和一根去皮的新鮮玉米，約4天后所有1L若蟲成長為3L若蟲，準備鋪好濾紙和7～8粒新鮮玉米粒的塑料培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿里放15只3L若蟲，放若蟲時，用軟毛刷輕輕挑取，以免對若蟲造成不必要的機械損傷。饑餓處理兩個小時

人工飼料的配制

人工飼料是按照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所棉花害蟲研究組所提供的配方來配制的(棉蟲組已經(jīng)在人工飼料的配制和實際應(yīng)用方面通過了實驗驗證)。

9.2注射篩選Eps15基因片段的dsRNA對綠盲蝽生長發(fā)育的影響

合成完dsRNA以后先用注射法傳遞dsRNA，dsGFP和dsβ-actin分別作為對照。注射法使用3L綠盲蝽，注射參數(shù)如下：注射體積為41.6nl，注射dsRNA濃度為10μg/μl，注射部位為綠盲蝽的后胸與腹部節(jié)間膜的最外側(cè)。結(jié)果表3所示。

表3盲蝽Eps15dsRNA注射7天存活率

9.3飼喂傳遞Eps15dsRNA基因?qū)G盲蝽生長發(fā)育的影響

三齡綠盲蝽的準備和人工飼料的配制

為飼喂實驗所準備的綠盲蝽前期準備階段與注射實驗一樣然而最后開始做實驗前饑餓處理兩個小時。

人工飼料是按照中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所棉花害蟲研究組所提供的配方來配制的(棉蟲組已經(jīng)在人工飼料的配制和實際應(yīng)用方面通過了實驗驗證)

飼料總體積200ul，dsRNA濃度0.5ug/ul。結(jié)果如表3所示。

表4綠盲蝽Eps15的dsRNA飼喂7天存活率