本發(fā)明涉及一種小RNA(microRNA)，負調控鹿茸的癌樣生長。

背景技術：

在哺乳動物中，只有鹿茸角是目前所知唯一具有表形態(tài)再生能力的器官，即在失去后還能完全再生出來(如圖1，2)。在再生周期里，鹿茸從頂部生長點平均每天延伸1-2cm。所以有人稱鹿茸的生長是“癌樣”(cancer-like)生長。隨著近年來大量促癌因子，如TNFα、KGF等的發(fā)現(xiàn)，這種認為鹿茸癌樣生長的觀點已經(jīng)得到分子水平證據(jù)的支持?？芍档米⒁獾氖悄[瘤和癌癥組織很少自愈，而鹿茸會在近百天的的癌樣生長后最終自動停止，茸性皮膚會慢慢死亡脫落。這種鹿茸茸皮癌樣生長后停止的過程中一定存在負調控因子起作用。

MicroRNA(miRNA)是一類內生的、重要的基因表達的負調控因子，通過調節(jié)目標mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率來表現(xiàn)其功能。這些小RNA長度為20-24個核苷酸、來源于長的具有發(fā)卡樣二級結構的轉錄子，并被兩種核酸內切酶Drosha和Dicer剪切。具體過程：miRNA首先由細胞核內的核糖核酸酶Drosha產(chǎn)生，此酶將在基因中編碼的初級miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)的莖環(huán)結構加工成前體miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)，60-70核苷酸長。然后通過輸出蛋白5(esportin-5)將pre-miRNA轉位輸出到細胞質，并在另一種RNAIII，Dicer的作用下形成雙鏈的miRNA。

RNA誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)包含AGO(argonaut)蛋白，組成miRNA雙鏈。其中一條鏈形成成熟的miRNA而另一條鏈降解。成熟miRNA蛋白復合體通過與mRNA的3’UTR區(qū)目標位點結合，而進行轉錄抑制或者降解mRNA決定于成熟miRNA和目標mRNA互補程度。

一個miRNA的選擇性活性依賴于與這個同源mRNA互補的miRNA的種子序列(seed region)。因為microRNA種子內的不完美堿基配對代表這個核心5-7核苷酸序列可以潛在識別結合很多的mRNA序列，種子序列通常在基因組中重復并且同時調控幾百個目標mRNA。然而，miRNA影響單個蛋白水平相對溫和，盡管如此，在一個通路中通過一個miRNA同時調節(jié)幾個基因的狀況對于源于這個通路的生物學過程是有一個積累效應的。

越來越多的證據(jù)表明miRNA在許多細胞增殖、分化、形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生等生物學過程中起非常關鍵的調節(jié)作用。眾所周知，miRNA參與調節(jié)腫瘤起始和進展，并通過抑制目標基因起到癌基因或腫瘤抑制的功能。到目前，越來越多的miRNA被證明在癌癥發(fā)生過程中起非常重要的作用，這說明miRNA可以作為治療癌癥的潛在新靶標。

SOX9(transcription factor sex-determining region Y(SRY)-box 9protein)屬于SOX家族，是雄性決定、軟骨形成、神經(jīng)形成和神經(jīng)嵴發(fā)育、干細胞形成等發(fā)育進程中的一個關鍵性轉錄因子。多項研究證實，SOX9在細胞增殖和細胞生存中起決定性作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明確定了東北馬鹿(Cervus elaphus)鹿茸茸皮這種快速增長細胞起抑制作用的因子，并確定這種負調控因子的名稱、序列。本發(fā)明從馬鹿鹿茸茸皮組織的microRNA數(shù)據(jù)庫中篩選得到的microRNA，PC-5p-1090(以下簡稱PC-1090)，是一種在茸皮中特異性表達的miRNA，為24nt，軟骨組織中無法檢測到該成熟miRNA。序列如SEQ ID NO：1所示(CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU)。

本發(fā)明經(jīng)過Hela、U2OS、293T等細胞的細胞增殖檢測和Western Blotting等實驗證明PC-1090下調細胞增殖關鍵轉錄因子SOX9的表達(圖4、5所示)，可抑制細胞增殖(圖6所示)。

本發(fā)明包含以下有益效果：

作為基因表達的負調控因子，microRNA在細胞生長、器官發(fā)育、個體生長及各種疾病的進程中都起到非常重要的作用。因此，從快速生長的鹿茸頂端茸皮組織中分離出來的microRNA序列對鹿茸的癌樣生長及自動終止會起非常重要的調控作用。

為此，本發(fā)明從快速生長期的新生馬路鹿茸頂端茸皮組織microRNA測序結果中得到一個miRNA，PC-1090，其轉錄前體長約120nt，可形成發(fā)卡結構，成熟miRNA全長24nt(GenBank登陸號:KJ179845)，在miRBase數(shù)據(jù)庫(Release 21)中無同源序列。BLAST結果顯示，無論是成熟miRNA全長還是其seed序列，在人、小鼠、大鼠、狗、雞、豬等模式物種基因組中均無同源序列。僅在牛(Bos taurus)第11號染色體上有成熟miRNA的同源序列，相似性100％。

通過TargetScan預測鹿茸茸皮發(fā)育的關鍵性因子SOX9是PC-1090的靶基因之一，通過PC-1090mimics實驗驗證了PC-1090對SOX9具有靶向作用，在U2OS、293T等細胞中證明了PC-1090具有高效下調SOX9蛋白的作用(實驗結果如圖4、5所示)，并抑制細胞增殖(實驗結果如圖6所示)。

本發(fā)明篩選的基因序列如下：

名稱：PC-5p-1090

序列：CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU。

附圖說明

圖1為馬鹿鹿茸表形態(tài)再生周期圖。其中，箭頭所指為鹿茸頂端增生區(qū)；

圖2為鹿茸快速生長期頂端增生區(qū)軸向縱切圖和茸皮組織結構圖；其中，左側為軸向縱切圖，右側為茸皮組織結構圖，E為上皮，D為真皮層，RM為間充質層，CA為未礦化軟骨區(qū)，H為毛囊，S為皮脂腺；圖中箭頭所指處可見軟骨中紅色血管；

圖3為多種模式生物SOX9mRNA 3’UTR區(qū)具有潛在的PC-1090的seed序列(小寫加下劃線序列)互補結合保守位點(框內序列)；

圖4為PC-1090mimics下調U2OS細胞內源SOX9蛋白水平圖；內參為GAPDH；

圖5為PC-1090mimics可下調293T細胞pMIR-SOX9-3UTR-Luc載體表達熒光素酶；內參為GAPDH，實驗設pMIR-Luc空白質粒(ev)對照；

圖6為CCK-8法檢測轉染PC-1090mimics后以24小時為間隔的Hela細胞增殖活性圖；其中，A為PC-1090-NC陰性對照活性曲線；B為PC-1090mimics活性曲線。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一種調節(jié)鹿茸茸皮快速生長的microRNA，它命名為：PC-5p-1090，其序列為CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU(如Seq ID No：1所示)。

具體實施方式二：本實施方式的一種調節(jié)鹿茸茸皮快速生長的microRNA的應用，抑制促進細胞增殖的關鍵轉錄因子SOX9表達。

具體實施方式三：本實施方式的一種調節(jié)鹿茸茸皮快速生長的microRNA的應用，它具有抑制細胞增殖功能。

本發(fā)明內容不僅限于上述各實施方式的內容，其中一個或幾個具體實施方式的組合同樣也可以實現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑公司購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

實施例1、鹿茸茸皮PC-1090的獲取過程

1)材料獲?。簩嶒炈貌牧蠟樘幱诳焖僭鲩L期約70天的東北馬鹿鹿茸茸皮組織(圖2所示)。鋸茸后立即用消毒的剪刀將鹿茸頂端組織切成厚度小于0.5cm的片狀，立即放入裝有防止RNA降解的保護液(RNAlater)中，置于低溫保存箱中并帶回實驗室保存。

2)mRNA的提?。簩嶒炇冶４媛谷椎娜灼そM織分離后稱取30mg，在超凈工作臺中快速切碎置于無菌1.5mL試管中，利用QIAGEN公司(德國)試劑盒DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat.No.69504)提取鹿茸茸皮中的總RNA，并將提取的總RNA最終溶解于RNAse-free的水中，提取的總RNA經(jīng)過分光光度檢測均具有較高的質量(OD260nm/OD280nm：1.75-1.86)。

3)鹿茸茸皮small RNA高通量測序：將提取的總RNA遞交到美國聯(lián)川公司(杭州)通過Illumina miRNA Solexa測序平臺進行鹿茸茸皮組織small RNAs文庫進行高通量測序后，用ACGT101-miRv4.2(LC Sciences)軟件進行數(shù)據(jù)處理。

4)鹿茸茸皮新miRNAPC-1090的獲取：對鹿茸茸皮組織的small RNA文庫分別進行Solexa深度測序后獲得序列原始數(shù)據(jù)進行綜合分析，得到一種新miRNA，PC-1090，其序列不能比對到miRBase牛的miRNAs前體(pre-miRNAs)，但是測得序列(已知的成熟體)可以比對到基因組上，而且延伸的基因組序列可以形成合格的發(fā)夾結構。

5)靶基因預測：通過TargetScan預測PC-1090的靶基因之一為調節(jié)茸皮快速增長的關鍵轉錄因子SOX9。

實施例2、PC-1090在細胞水平上能夠下調促細胞增殖關鍵性因子SOX9表達

1)PC-1090合成：將PC-1090序列遞交到上海吉瑪公司合成mimics和相應的Negative Control(NC)。

2)構建SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT載體：序列比對分析得知多種模式生物Sox9mRNA 3’UTR區(qū)具有潛在的PC-1090seed序列(小寫加下劃線序列)互補結合保守位點(框內序列)(圖3所示)。因此，本實施例根據(jù)小鼠SOX9的3’UTR區(qū)克隆了339bp的片段插入到pMIR-REPORT(Applied Biosystems公司，美國)載體中，其中插入片段包含PC-1090種子序列的互補序列，插入片段(如Seq ID No：2所示)如下：

caatgttttcagccatagacctttgggtctgcctggactgtatgtggatgtgtgcgtgtgttgtgacacgggacaacacatgcctctgcaagtgtgtgtgccgtggatagccccttggctgctctcctgcagagagacatcggacagaccttaattcttactcactgctgtggctggagagtataaggaatgctttttctttttttctttctttctttcttttttttttttaagacagcagtctttttttttaatttaaaaaaaaaaagatatattaacagttttagaagtcagtagaataaaaccttaaagcgttcttataatatggcatctttcgcg。

pMIR-REPORT載體是ABI公司(美國)設計的將一個miRNA的靶序列插入到多克隆位點中，pMIR-REPORT的熒光素酶蛋白Luciferase報告載體可以用來定性和定量衡量miRNA的功能。當PC-1090mimics和SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT載體共轉染細胞時，如果Luciferase蛋白表達下調，說明PC-1090對SOX9表達有下調作用。

3)細胞培養(yǎng)：293T細胞和U2OS細胞均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，培養(yǎng)基：293T細胞培養(yǎng)基為DMEM(Gibco，美國)，U2OS細胞培養(yǎng)基為McCoy's 5A(Modified)Medium(Gibco，美國)，均添加10％的胎牛血清(Gibco，美國)和100U/mL的雙抗(Invetrogen公司，美國)。置于37℃，5％二氧化碳條件下培養(yǎng)。

4)轉染與Western檢測：細胞以8×10⁵個/孔種于6孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)36小時，細胞匯合度達到70％-80％，以Lipofectmin3000(Invetrogen公司，美國)為介導，將合成的PC-1090的mimics和SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT載體對U2OS細胞、293T細胞進行轉染，轉染的重組質粒量為2ug/孔。40～48小時后收細胞，對蛋白進行變性處理后，利用4％-12％的PAGE預制膠(Invitrogen公司，美國)電泳。轉硝酸纖維膜后，用5％脫脂奶粉的TBST混合液封閉2小時，然后硝酸纖維膜分別在SOX9一抗(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)(圖4)或Luciferase一抗(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)(圖5)中孵育2小時以上，熒光標記的二抗(Licor Bioscience，美國)中孵育1小時，以GAPDH(Santa Cruz Biotechnology公司，美國)為內參，Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃膜。檢測結果表明PC-1090有效下調SOX9的表達(圖4、5所示)。

實施例3、PC-1090在細胞水平上具有抑制細胞增殖功能

1)細胞培養(yǎng)與轉染：Hela細胞購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，培養(yǎng)基為DMEM(Gibco，美國)，培養(yǎng)方法同實施例2中3)。細胞轉染同實施例2中的4)。

2)細胞活性檢測：利用CCK-8(上海碧云天)試劑盒檢測PC-1090mimic/NC轉染Hela細胞后的增殖情況，每隔24小時對轉染后的細胞進行計數(shù)統(tǒng)計。檢測結果表明相比對照組(NC)，PC-1090mimics的Hela細胞增殖受到抑制(圖6所示)。